Farelerde kontrastlı MR ile optik sinir lifi Dürüstlük İn vivo

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Bu video naif fare görsel projeksiyon kontrastlı MR görüntüleme ve akut optik sinir ezilme yaralanma ve kronik optik sinir dejenerasyonu ile ilişkili optik sinir dejenerasyonu tekrarlayan ve uzunlamasına in vivo çalışmalar için, bir klinik 3 T tarayıcı kullanarak, bir yöntemi göstermektedir knock-out fareler (p50 KO).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fischer, S., Engelmann, C., Herrmann, K. H., Reichenbach, J. R., Witte, O. W., Weih, F., Kretz, A., Haenold, R. In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice. J. Vis. Exp. (89), e51274, doi:10.3791/51274 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kemirgen görme sistemi görsel kortekse talamik ve orta beyin merkezleri ve postsinaptik projeksiyonlar girmek için optik siniri oluşturmak retina ganglion hücreleri ve aksonlar kapsar. Onun farklı anatomik yapısı ve kullanışlı erişilebilirlik dayanarak, nöronal hayatta, aksonal rejenerasyon ve sinaptik plastisite üzerindeki çalışmalar için tercih edilen bir yapı haline gelmiştir. MR görüntülemede son gelişmeler manganez aracılı kontrast (MEMRI) kullanarak bu projeksiyon Retino-tectal kısmının in vivo görselleştirme sağladı. Burada, (200 mikron) 3 ortak çözünürlükleri 3 Tesla tarayıcı kullanılarak elde edilebileceği farelerde görsel projeksiyonu, gösterilmesi için bir MEMRI protokol mevcut. Biz 15 nmol MnCl 2, tek bir dozaj intravitreal enjeksiyonu 24 saat içinde sağlam çıkıntının doymuş bir donanıma yol gösterilmektedir. Retina hariç, sinyal yoğunluğundaki değişiklikler vardır gözetmeden,çakıştı görsel uyarılma ya da fizyolojik yaşlanma göçük. Biz daha akut optik sinir hasarına yanıt olarak aksonal dejenerasyon izlemek boylamasına için bu tekniği uygulamak, bir paradigma lezyon yerinde hangi Mn 2 + ulaşım tamamen tutuklamalar tarafından. Bunun aksine, aktif Mn + 2 taşıma canlılığı, sayı ve akson lif elektriksel aktivitenin kantitatif orantılıdır. Böyle bir analiz için, görsel, projeksiyonlar dahil duyusal spontan atrofi gösteren transgenik fare modelinde (NF-KB p50 KO) görsel yol boyunca Mn 2 + taşıma kinetik örneklemektedir. Bu farelerde, MEMRI azalır fakat böylece NF-KB mutasyonlar ile yapısal ve / veya fonksiyonel bozukluğu belirtileri ortaya, yabani tip farelere kıyasla Mn + 2 taşıma gecikmeli olmadığını gösterir.

Özetle, MEMRI uygun in vivo analizlerde köprü ve characterizati için mortem histoloji gönderebilirsinir lifi bütünlüğü ve aktivite üzerinde. Bu aksonal dejenerasyon ve rejenerasyon, ve hakiki veya uyarılabilir fenotipleri için mutant farelerin soruşturmalarla ilgili uzunlamasına çalışmalar için son derece yararlıdır.

Introduction

Onun olumlu nöro-anatomik yapısına dayalı kemirgen görme sistemi nöro 1 ya da pro-rejeneratif etkileri 2,3 arabuluculuk farmakolojik bileşikler ve kabiliyetlerini değerlendirmek için benzersiz olanaklar sunuyor. Ayrıca, son zamanlarda presinaptik iskele proteini Bassoon 4 eksik fareler için açıklandığı gibi, fare mutantlarının işlevsel ve nöro-anatomik özelliklerinden çalışmalar sağlar. Bundan başka, yardımcı araçları bir geniş spektrumlu elektroretinografi ve davranışsal testler ve içsel sinyallerinin optik görüntüleme kortikal yeniden düzenlemelerin belirlenmesi ile, örneğin, retinal ganglion hücre (RGC) ve RGC akson sayı hem de RGC aktivitesi, ilave bir özelliği elde edilir. Lazer mikroskopi son teknik gelişmeler, optik sinirin (ON) ve beynin bütün montaj örneklerinde derin doku floresan görüntüleme ile RGH yenilenme yerinde görselleştirme sağlar. Bu histolojik araştırma olarakical yaklaşım, hafif levha floresan mikroskobu ile birlikte tetrahidrofuran merkezli doku temizleme deafferented ON ve optik sisteminde 5 içine yeniden girmek tek liflerin çözünürlüğünü verir. Bu tür teknikler çözünürlük ve büyüme modelleri belirlenmesinde üstün olabilecek iken, onlar özellikle uzun süreli yenilenme sürecini değerlendirmek için istenen bireysel gelişim olayları, tekrarlayıcı ve boyuna analizlerini mümkün değil.

Kontrastlı MR fareler ve sıçanlarda 6,7 Retino-tectal projeksiyon minimal invaziv görselleştirme için istihdam edilmiştir. Bu retinal hücrelere paramanyetik iyonlar (örneğin, Mn + 2) doğrudan teslimat göz içi ile elde edilebilir. Bir kalsiyum analog olarak, Mn 2 + voltaj kapılı kalsiyum kanalları aracılığıyla RGH somata içine dahil edilir ve aktif sağlam ON ve optik sistemin aksonal hücre iskeletinin boyunca taşınır. O beyin çekirdekleri birikir iseo 10,11 oluşabilir rağmen görsel projeksiyon, lateral genikülat çekirdeği (LGN) ve üstün kollikulusu (SC), yani primer görsel korteks içine transsinaptik yayılımı, 8,9 önemsiz görünür. MR dizileme altında, paramanyetik Mn 2 + esas t 1 spin-örgü durulma zamanı 12 kısaltarak MR kontrast artırmaktadır. Böyle Mn 2 + MRI (MEMRI) başarıyla ON yaralanma 13,14 sonrası aksonal rejenerasyon ve dejenerasyon değerlendirmesi dahil sıçanların çeşitli nöro-anatomik ve fonksiyonel çalışmalarda, tatbik edilmiştir gelişmiş, Retino-tectal projeksiyon 15 hassas anatomik haritalama , hem de farmakolojik tedavi sonrası 16 aksonal taşıma özelliklerinin belirlenmesi gibi. Mn + 2 alımı ve nakil nöronal, yanı sıra geliştirilmiş MRI protokollerin doz, toksisite ve kinetik olarak son refinements Transjenik ilgili çalışmalara uygulanmasını genişletmiştiryaygın klinik pratikte 17 kullanılan 3 Tesla tarayıcıları kullanarak fareler 9.

Burada, biz fare Retino-tectal projeksiyon in vivo görüntüleme boyuna uygun bir MEMRI protokol mevcut ve naif ve çeşitli nörodejenerasyon koşullarda Mn 2 + bağımlı sinyal donanımı değerlendirerek uygulanabilirliğini örneklemek. Bizim protokol genellikle özel hayvan tarayıcılar daha erişilebilir bir ılımlı 3 T manyetik alan MR veri toplama belirli bir önem vermektedir. Naif farelerde, sistem özel sinyal yoğunluğu büyük ölçüde yeniden üretilebilir ve intravitreal (ivit) 2 Mn + uygulama sonrası artış olmak ne kadar göstermektedir. Kantitatif, görsel projeksiyon boyunca Mn 2 + yayılım (3 ve 26 aylık farelerin arasında ölçülen) normal yaşlanma sürecinin bağımsız oluşur ve güçlendirme karanlığa görsel uyarı ve adaptasyon dirençlidir. Buna karşılık, Mn 18 ON akut yanı sıra nfkb1 knock-out farelerde spontan apoptotik RGH ölümden ve dejenerasyon 19 ON acı (p50 KO) takip azalır. Bu nedenle, geleneksel histolojik analiz için genişleme, bireysel hayvanların uzunlamasına MEMRI analizi nörodejeneratif süreçleri tek kinetiği profil sağlar. Bu farmakolojik veya genetik müdahalelerle ilgili nörokorunma ve aksonal rejenerasyon üzerine çalışmaları için yararlı olmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan müdahaleler Laboratuvar Hayvanları Hayvan Bakımı ve Kullanımı Avrupa Sözleşmesi ve Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım ARVO Bildirimi çerçevesinde yapılmaktadır. Tüm deneyler yerel etik kurul tarafından onaylanmıştır. Farelerde ON hasarın işlem başka bir yerde, 9 anlatılmıştır.

1.. Intravitreal Manganez Enjeksiyon

  1. Önce MR asistan yardımı ile taramak için Mn 2 + enjeksiyon 24 saat gerçekleştirin. (Steril PBS içinde 420-450 mg / kg vücut ağırlığı),% 5, kloral hidrat çözeltisinin intraperitonal enjeksiyon ile hayvanlar anestezisi. Ek topikal anestezi için, önce göz delinme için kornea sıvı conjuncain bir damla (0.4% oksibuprokain hidroklorür) uygulanır. 15 nmol Mn enjekte etmek için, 2 + göz için, örneğin, 132 LH 2 'de 1 M MnCI2 stok solüsyonu 1 L seyreltilmesi ile, bir 7.5 mM MnCI2 çözelti hazırlamak/ Sub> O. 34 G küçük bir hub çıkarılabilir iğne (RN iğne) bağlı bir 5 ul Hamilton şırınga içine nihai çözümün yükü 5 ul.
  2. Sağ gözü ile başlarken, bir binoküler mikroskop altında ve hafifçe açık sol-taraflı fareyi getirin ve sol elin baş ve işaret parmağı arasında sağ göz düzeltmek. Sağ elinizle şırınga Pick up ve ucuna yakın iğne tutun. Göz ampul atravmatik delik için, dikkatli böylece skleral damarları koruyucu, limbusta yaklaşık 1 mm uzak infero-zamansal çevresi de vitreus içine iğne takın.
  3. Hamilton şırınga ölçeğini kontrol ederken sonra, yardımcı yavaşça 2 ul toplam hacim uygulanır. Bu işlem sırasında, mikroskop altında optimal iğne yerleştirme izlemek ve sıvı lens veya dökülmeye patlamasına kaçının. Statik olarak ek bir 30 saniye boyunca yerleştirilen iğne tutun, daha sonra sıvı en aza indirmek için yavaş yavaş gerienjeksiyon yerinde sızmasına neden olunacaktır.
  4. İşlem boyunca, özel bakım göz basıncı önlemek için alınmalıdır. Aynı şekilde, göz ampul delmek için sert ya da çok sayıda girişimleri önlemek. Mn 2 + RGCs ve ON boyunca taşıma içine çekmesi zaten 15 nmol MnCl 2 doymuş olduğundan, bu muğlak enjeksiyon hacimleri ile sinyal değişimleri en aza indirir. Görsel çıkıntının ikili sinyal artışı için, sol göz için enjeksiyon prosedürü tekrarlayın.
  5. Uygulama ofloksasin-ihtiva eden (3 mg / ml) göz damlası ve göz enfeksiyonları prosedür ve göz kurumasını önlemek için bir kez sonra pantenol içeren merhem içinde uygulanmaktadır. MR tarama başlangıcına kadar, normal konut koşulları altında kendi kafeslerine fareler dönün.

MRI için 2. Hayvan hazırlanması

  1. % 2 /% 98 izofluran / oksijen gaz karışımının verilmesi ile fare anestezisi. Neredeyse yatay, bükülmemiş pozisyonda bir fare tutucu üzerine fareyi monte edin. InsDaha sonra MR tarayıcı içinde ayarlanır MR bobin içine ert o. Uygun sistemleri tarafından solunum ve kalp atışlarının izlenmesi. Teknik ayrıntılar için, Herrmann ve arkadaşları 20 bkz.
  2. MRI sırasında, entegre bir boru ile fare kafası tutucuya bağlanmış bir buharlaştıncı ile, başlangıçta% 1.5 /% 98.5 izofluran / oksijen gaz karışımının sürekli olarak üfleme ile tedarik anestezi. Tarama sırasında, kaydedilen önemli bir parametre (örneğin, dakikada 40 nefes stabil bir solunum hızı için amaç) göre anestezi derinlik ayarlayın. Bir ısıtma aygıtı kullanılarak fare karın bölgesinde yer alan bir ısı algılayıcı tarafından ölçülen, 35 ve 37 ° C arasında kararlı vücut yüzey sıcaklığı. Teknik ayrıntılar için, Herrmann ve arkadaşları 17 bkz.
  3. Taramadan sonra, sahibinden fareyi kurtarmak ve anestezi kurtarma hızlandırmak için saf oksijen ile kaynağı. Ayrıca, kullanarak stabil vücut sıcaklığı tutmakBir kırmızı ışık ısı kaynağı.

3.. MRG Protokol

  1. Protokol 35 mm × 38 mm çaplı görüş etkili bir alan ile özel, SNR-verimli, küçük hayvan bobin (doğrusal polarize Litz bobin) ile donatılmış 3 Tesla için doğrulanır. Iletim-alım modunda bobin çalıştırın.
  2. Son konumunda hayvan ile, frekans analiz yardımıyla bobinin ayar ve maç ayarlayın. El ile görüntü homojenliği ve kalitesini optimize etmek verici referans gerilim ve şim akımları ayarlayın.
  3. Yine T planlaması için sagital ve transversal görünümünde 0.5 mm × 2 mm × 0,5 mm çözünürlük ile 1 ağırlıklı 2D TSE görüntü kazanır. Planlama MR taramaları kullanarak, koronal ölçüm doğrultusunda MEMR görüntüler elde, sağ-sol yönünde faz kodlama ile hayvanın kafasına paralel olacak şekilde döndürülmüş. Edinimi süreyi en aza indirmek için, ayarlanabilir bir görüş dikdörtgen alanı kullanıngerçek kafa boyutları. Faz kodlama yönünde görüş 93.8% dikdörtgen alanını kullanarak, baz matris 256, görüş alanını 14.08 mm × 50.65 mm × 54 mm ve 0.11 mm-128 dilim: Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir şımarık 3D FLASH dizisi (VIBE 3D) İstihdam dilim çözünürlük ile dilim kalınlığı% 61 olarak ayarlanır.
  4. 0.18 mm x 0.21 mm x 0.21 mm etkin çözünürlüğü (0.1 mm × 0,1 mm × 0.09 mm interpolasyon), eko zamanı T E = 6.51 msn'den sağlayarak, 512 × 480 × 128 ile son görüntüler oluşturmak için düzlem interpolasyon etkinleştirin, tekrarlama zamanı T R = 16 msn, bant genişliği = 160 Hz / px flip açısı = 22 °. Yaklaşık olarak 30 dakika toplam satın alma süresi (T) elde etmek için, iki ortalamalar ve üç set uygulayın.

4. MRG Veri Analizi

  1. Yazılım syngo fastView kullanarak verileri analiz edin. Nicel sinyal artış, o tanımlanan bölgeleri seçmekf 2D düzlemsel MR kayıtları ilgi ve gelişmiş yapısı (SI MEMRI), doku arka plan (SI backgr) ve gürültü (SD N) standart sapma sinyal şiddetlerini (SI) belirler. Gerektiğinde, LGN ve SC yapılar için nöro-anatomik yönlendirmeyi kolaylaştırmak için bir fare beyin atlası kullanın. : Aşağıdaki formül kullanılarak kontrast-gürültü oranını (CNR) hesaplayın
  2. CNR = (SI MEMRI - SI backgr) / SD N
  3. Her numune için ortalama CNR hesaplanması için üç ardışık görüntüleri niceliğini. Iki taraflı olarak enjekte edilen hayvanlarda, bağımsız bir şekilde, her bir yarım küre analiz.
  4. , Yatay koronal ve sagital görüntülerin tasviri için, özgün 3D MR veri setinden Multiplanar rekonstrüksiyon hesaplamak. Bu işlenmiş görüntüler kantitatif analiz için tavsiye edilmez. Retino bir animasyonlu 3D rekonstrüksiyon (maksimum yoğunluğu projeksiyonları, MIPs) oluşturmak için-Tectal projeksiyon, bir anjiyografi sonrası işleme yazılım modülünü kullanabilirsiniz.

5. Mn 2 + Autometallography (TIMM Boyama)

  1. MEMRI aşağıdaki Mn + 2 takip beyin yapılarının TIMM boyanması için, 15-150 nmol Mn + 2 ivit 24 saat önce görüntüleme için bir doz enjekte edilir.
  2. MR taradıktan sonra, PBS içinde 30 ml buz soğukluğunda% 0,325 Na 2 S (pH 7.4) ile hayvanların serpmek. Dondurulmuş bölümünde retinae ve dondurma örnekleri incelemek.
  3. Bir kriyotomu 15 mikron kalınlığında sıralı, ekvator bölümleri kesmek.
  4. Angenstein et al 22'ye göre sabitleştirici ve donmaya karşı koruma sağlamak yokluğunda TIMM boyama 21 yapın.

6.. İstatistiksel Analiz

Post hoc ANOVA ardından tek karşılaştırmalar için Student t-testi kullanılarak istatistiksel analizler gerçekleştirmek. Veriler ortalama ± standart hatası olarak sunuldu. Bağımsız N sayılardırHer deney için ayrı ayrı verilir. (***, 0,001 P ≤,, **, 0.01 P ≤ *, P ≤ 0.05) 0.05 ≤ P ulaşan sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Doğru bir görsel çıkıntının canlılık ve işlevselliği değerlendirmek için, bu görüntüleme tekniğin becerisi vitreus ve RGCs tarafından alımı için toksik olmayan bir Mn + 2 dozajın kesin uygulamaya dayanır. Bu ana varsayım tabaka belirli bir Mn + 2 uptake autometallography (TIMM boyama) 21 ile gösterilen, Şekil 1 'de test edilir. Retina bölümleri kontrol olarak 15 nmol ve 150 nmol ya da Mn 2 + ya da PBS ivit uygulamadan 24 saat sonra analiz edilmiştir. Bu zaman noktasında, Mn + 2 enjekte retinae T 1 'de maksimum sinyal artış gösterir ağırlıklı MR (N = 3, noktalı çizgiler), PBS retina sinyali (N = 3, kesikli çizgi) geliştirilmiştir değildir enjekte etmiştir (Şekil 1 ,) paneli bıraktı. 150 nmol enjekte edilen göz hyperintensive sinyal artışı not edin. Buna karşılık, kontrastsız beyin bölgeleri (yıldız) tüm işbirliği için benzer arka plan sinyal yoğunlukları gösteriyorözellikle RGC katmanı ve aşağıdaki bireysel RGC somata incelenmesi ile teyit sinir lifi tabakası (NFL) (Şekil 1, orta panelde büyütülmüş takmalar), içinde şulları (yeşil renkli). Ivit Mn 2 + uygulama artış genel TIMM boyama H & E ko-etiketleme (sağ panel).

Fare Retino-tectal çıkıntının in vivo görüntüleme için, bu ekipman ile birlikte çalışma parametreleri, Şekil 2'de gösterildiği gibi, 3 T alanda fareler analiz etmek için adapte edilmiş özel bir fare MEMRI protokolü seçmek için çok önemlidir. Böyle bir tarayıcı kurulumu uygulamak, bizim daha önceki iş CNS görüntü çözünürlüğü için bir sıçan kafa bobin özel bir fare bütün vücut bobinine 17 üstün olduğunu ortaya koydu. Kemirgen baş düzeltmek için ve düzgün sıçan bobin içindeki konumunu ayarlamak için, biz plastik lokma bar ile bir beşik ve bir konik tüp kullanmak, her ikisi de vücut ölçüleri karşılayacak downscaled edilirfarelerin (Şekil 2A, B). Görüntüler 3D gradyan eko dizileri uygulayan bir çapraz T 1 ağırlıklı matris üzerinde yakalandığı zaman, iktisap zaman 35 dakika içinde (200 mikron) 3 yüksek çözünürlüklü görüntüler nesil beklenebilir. Biz güçlü tarama sırasında hayati fonksiyonların sürekli izlenmesi önerilir. Birlikte postimaging oksijenlenme ve vücut ısısı kontrolü ile anestezi Ayarı önemli ölçüde iyileşme süresini hızlandırır ve yaklaşık% 100 hayatta kalma oranlarını garanti. Bu tür teknik önlemler tüm kohort boyuna ve tekrarlayan MR sürdürmek sağlamak için gereklidir.

Her çalışmada, 15 nmol, sadece toksik olmayan, Mn + 2 doz belirgin ON, retinada CNRS artırmak için yeterli olan, ivit uygulama 9 için kullanılır ve gerektiği presinaptik intraserebral LGN ve SC kadar optik sistem. CNR değerleri en iyi 200 mikron kalınlığında enine hesaplanırOrijinal izotropik 3D hacmini reslicing orijinal MR veri setlerinden elde dilim. Şekil 3A ilgi üç bölge (1) sinyal geliştirilmiş bir alanda (SI MEMRI için her görüntüde seçilen gelişmiş LGN, hassas CNR belirlenmesi bir örneğini gösterir ), (2) non-ilgin beyin dokusu (SI backgr), ve (3) arka plan gürültü (SD N). Yapan tek bir görsel çıkıntının tamamen boyunca ölçülür beklenebilir uzamsal sinyal artışı Şekil 3B'de gösterilmiştir. Optik sinir başında doruklarına dorsoventral düzlemi boyunca retina bölümlerde sinyal artışının güçlü kademeli artış dikkat. Buna ek olarak, uygulanan deneysel koşullar (görsel korteks sinyal damla) altında kortikal katmanları içine ilgili bir transsinaptik Mn + 2 yayılma eksikliğini not edin. MIPs toto (Film 1) 'de Retino-tectal çıkıntının 3D konumlandırma görselleştirmek için son derece açıklayıcıdır. AGörsel çıkıntı boyunca Mn + 2 arasında ccumulation Ca 2 + kanal ve hızlı bir aksonal taşıma bağlı, hem de hedef doku 13 arasındaki nispeten düşük gerilim mesafesi boyunca RGCs içine hücre içi alımını kinetiğine göre belirlenir. Önceki kinetik çalışmalara göre, Mn + 2 bağımlı sinyal artışı gibi erken enjekte edildikten sonra 6 saat olarak tespit edilebilir. Bu 24 saatte daha fazla tepe ve 120 saat sonrası enjeksiyon 9 içinde bazal düzeylere geri azalır. Bu nedenle, optimum sonuçları elde etmek için, MEMRI fareler 13 için gerekli olan donanımın zaman yarısını temsil ettiği, enjeksiyondan 24 saat sonra yapılmalıdır.

MEMRI tarafından görsel projeksiyon kontrast geliştirme için ilke sıraladı, biz daha iki parametre etkilerini iletişim - ışık durumu ve hayvan yaş - nicel ölçümlerini etkileyebilir:

(1) f test etmekveya orta beyin merkezlerinde Mn 2 + uyarıcı bağımlı birikimi, fareler ya feneri tanımlanmış bir frekansta maruz (5 Hz) ve ışık şiddeti (3 W LED) ile elde ışık uyarılmış şartlar altında ya da önce tarama tam karanlıkta tutuldu ve Mn + 2 maruz kaldıktan 24 saat boyunca. CNR 24 saat kantitatif analiz ivit sonra Mn 2 + uygulama ışık uyarılmış koşulları (66.29 ± 3.07 vs 54.56 ± 3.08, P ≤ 0.05, N = 7 / kıyasla koyu adapte Retİna sinyal yoğunluğunda önemli bir artış ortaya 8, Şekil 3C). Periferik retina ve optik sinir başı (Şekil 3B) arasındaki sinyal artışındaki degrade göz önüne alındığında, biz her zaman deney grupları içinde retina bölümleri ilgili analiz için güvence verdi. Beklendiği gibi ventrodorsal düzlemi boyunca görüntü analizi mutlak CNR değerleri her şartlarda aşağı gidiyor ki, ortaya çıkardı. Önemli olarak, relkaranlık ve aydınlık adapte Retİna arasındaki ative sinyal fark (veriler gösterilmemiştir) kalıcı kalır. LGN projeksiyon alanlarında Ancak, sinyal geliştirme (26.97 ± 1.78 vs 26.58 ± 1.05, p = 0.9, N = 7-2) ve SC (25.09 ± 1.24 vs 26.81 ± 1.55, p = 0.4, N = 7 / 8) açık ve koyu klima ortamlarda (Şekil 3C) arasında ayırt edilemez. Bu deney, hedef alanlarda Retino-tectal çıkıntı ve birikim boyunca uzanan yayılma tesadüf görsel uyarı etkilenmeyen oysa retinal tabakalarına Mn 2 + alımı, ışığa maruz kalma duyarlı olduğunu göstermektedir. Alternatif olarak, 3 T tarayıcının sinyal duyarlılığı LGN veya SC sinyal değişimi için algılama eşiğinin altında olabilir.

(2) görsel projeksiyon MEMRI ilgili sinyal donanıma hayvanın yaşı etkilerini araştırmak için, 3 ve 26 ay arasındaki o fareler incelendif yaş. (, = N, P = 0.79 16 23.90 ± 0.81), 13 aylık (23,35 3 aylık farelerin LGN (23.49 ± 1.36, N = 12) 7 ay arası farelerde ölçülen sinyal yoğunluğundaki farklılık göstermemektedir CNR değerler Şekil 3D) 1,29, p = 0.94, N = 10) veya 26 ay (25.10 ± 2.29, P = 0.53, N = 6 ±. Aynı şekilde, SC sinyal yoğunluğu (16.92 ± 2.18, p = 0.37; Şekil 3D) 3 ay (19.01 ± 1.20) ve yaş 26 ay arasında değişmez. Hafif bir artış 26 aylık Retİna (38.49 ± 3.25) arasında CNR değerlerinde belirgin olmasına rağmen bütün grupların (P> 0.05) göre, bu artışın önemi bulmuyor. Bu deneyler, görsel çıkıntının serebral hedef alanlarda sinyallerini güçlendiren görsel uyarı ve fizyolojik yaşlanma etkilenmemiş olduğunu göstermektedir.

Sonra, o yapısal değişiklikleri tespit etmek MEMRI hassasiyeti göstermelerif görsel projeksiyon akut ve kronik axonopathy neden oldu. Bu keşfetmek için, yaralanma 18 yanı sıra görsel yolunun 19 dahil duyusal projeksiyonlar küçülmüş, spontan dejenerasyon gösteren bir hayvan modelinde ON travmatik tarafından uyarılan Wallerian dejenerasyon bir model kullanılmıştır:

(1) ON ezilme yaralanması tarafından uyarılan Travmatik axonopathy Axona fasiküller kırılması neden olur. LGN Mn + 2 gelişmiş sinyal kaybı ile görüntülenmiştir ve SC bir hafta (Şekil 4A, bir gün (gösterilmemiştir) ile analiz edilir Sonuç olarak, hücre iskeletinin akson boyunca Mn + 2 arasında Retino-tectal taşıma tamamen ve sürekli bir şekilde bloke olacak noktalı çizgiler) ve 4 hafta (gösterilmemiş olan) yaralanmadan. Açıkça ON yaralanma nöroanatomik ve ardışık MR özelliklerini göstermek ve naif devlet onları incelemek için, lezyon sadece tek taraflı olarak verilemez. Bu t değişmeden Mn 2 + ulaşım sonuçlarıo müdahale tarafında izleme kesinti aksine yan kontrol eder. Deafferented alanlarda CNR değerlerinin analizi sinyal artışı (gösterilmemiştir) tam yokluğunu teyit etmektedir. Bu deney, daha MEMRI (Şekil 4B) öncesi ve yaralanma sonrası projeksiyon boyunca sinyal yoğunluğu boyuna değerlendirilmesi bir lezyon sitenin yerini ve şiddetini tespit son derece hassas olduğunu göstermektedir. Yaralanma önce ON boyunca sinyal yoğunluğu sürekli arka plan sinyali yukarıda kalırken, ON yaralanma sonrası plan düzey bir gün sinyal yoğunluğundaki bir temporo-mekansal düşüşü yoktur.

(2) Daha önceki çalışma 9 enjeksiyondan 24 saat sonra ölçüldüğünde, LGN Mn + 2 bağımlı sinyal artışı NF-KB p50 alt ünitesi eksik 10 aylık farelerde büyük azalma olduğunu gösterdi. Yüksek bir kıvamı ile bu tespit, biz Retino-tectal Mn 2 + trans genel bir bozulma kabulliman, muhtemelen RGCs sayılarında azalma nedeniyle ve yaşlanma p50 KO fareler 19 nöropati ON ilgili. Seçenek olarak ise, azaltılmış sinyal artışı vitreus bir gecikmeli sinirsel emilmesinin ve Mn + 2 yayılımı ve patolojik çıkıntı boyunca ilişkili olabilir. İkinci olasılık erken (8 ve 24 saat) ve geç (48 ve 72 saat) süresi 15 nmol Mn 2 + tek bir uygulamadan sonra tekrarlanan MR taramaları gerçekleştirerek ve retina ve LGN sinyal donanımın kinetik inceleyerek keşfedilmeyi olabilir puan. Yabani tip ve p50 KO farelerde, 8 saatte retina sinyal geliştirme zirveleri hemen hemen aynıdır geliştirme oranları (43.52 ± 3.24 ve 40.72 ± 2.79, p = = 3-6 0.6, N; sol Şekil 4C). Sinyal geliştirme 24 saat sonrası enjeksiyon yabani türleri yüksek olmaya devam ederken, bu p50 KO farelerde düşüşler (43.38 ± 2.18 vs 32.89 ± 1.54, P ≤ 0.01, N = 5-8). Daha sonraki aşamalarda (48 ve 72 saat) boyunca, sinyal artışı, böylece gecikmeli retinal Mn + 2 alımı ve p50 KO farelerde yayılma hariç, (knock-out fareler sürekli olarak daha düşük CNR değerleri ile) her iki grupta da azalır. P50 KO farelerin LGN karşılık gelen sonuçlar bu durumu doğrulamaktadır. CNR 8 ve 48 saat post-enjeksiyon (P 0.05 ≤, N = 5-9) arasında önemli ölçüde daha düşük olmasına rağmen, p50 KO farelerde sinyal zayıflama kinetiği (sağ, Şekil 4C), yabani tip farelerde karşılık gelir. Bu nedenle, Retino-tectal çıkıntının indirgenmiş temporo-uzamsal sinyal artışı kısıtlı RGC nüfus yerine bozulmuş taşıma kinetik kaynaklanan azalmış akson sayıları kaynaklanmaktadır. Biz CNS'deki projectional bozukluklar için genetik fare mutantlar ekran için değerli bir araç olarak MEMRI öneriyoruz.

içerik "fo: keep-together.within-page =" Her zaman "> Şekil 1
Mn 2 Şekil 1. TIMM lekeleme + RGCs alıma izin verir. T 1 Örnek ısıyla harita görüntüler MR (MRI T 1) sinyal lensin geliştirme ve bütün retinal çevresi (noktalı çizgi) 24 saat göstermektedir ağırlıklı 15 ivit uygulanmasından sonra nmol ve hiper-yoğun sinyal geliştirme 150 nmol uygulamasından sonra Mn 2 + (sol). Sıcak renkler, soğuk renkler daha yüksek sinyal değerlerini temsil eder. Ölçek çubuğu: 1 mm. Sağ / orta: Mn 2 + TIMM boyanma (siyah renkli) kullanılarak gümüş yağış tarafından tespit edilen MnCl 2 ivit enjeksiyonundan sonra RGCs tarafından alındıktan. PBS ile tedavi edilmiş kontrol retina bölümleri (iyi, N = 3), daha çok zayıf lekelenme ve RGC tabaka (RGC) difüz farklılaşmasını göstermektedir. Yüksek büyütme d izin vermez. bireysel hücrelerin (büyütülmüş takmalar) arasında iscrimination Ivit MnCI2 uygulama farklı olarak, özellikle sinir lifi tabakası (NFL), RGH tabakası ve iç nükleer tabaka (INL önemli bir gümüş yağış, retina katmanları arasında genel gümüş boyamayı artar; orta ve alt , büyütülmüş ilaveler, N = 3). H & E ayrıca rular böyle tabakası belirli Mn 2 + birikimi (sağ panel) boyama ile TIMM arasında Colabeling. Ölçek çubuğu, genel bakış: 50 um, büyütme: 25 mikron. IPL, iç çekirdek katmanı; OPL, dış pleksiform katman; ONL, dış nuklear tabaka; RPE, retinal pigment epitel.

Şekil 2,
Şekil 2. Klinik 3T tarayıcı fare MEMR görüntü elde edilmesi için özellikle MRI ekipmanı gösteren fotoğraflar. A) b ısmarlama fare beşiği gösterirsolunum izleme (beyaz keçe, mavi tüp). B) için ite bar baş sabitleme ve sensör beşiği yerleştirilmiş ve sabit fare gösterir. Anestezi gazı,. C) gönderme faaliyet doğrusal polarize Litz bobin içindeki fare baş ve yuvasının konumlandırma örnek teşkil etmektedir ve. D alma modu sol kaynağı) Tüpler, koruyucu tüpün önünde bobin platformu gösterir ve klinik 3 T tarayıcı. Bakır kaplı boru sıcak su bazlı ısıtma mat (tüp etrafında siyah sarma) kaynaklanan gürültü ve bloklar MRG sinyal ek koruma sağlar. E) 3 T tarayıcı gözenek içindeki hayvan bobin komple set-up visualizes sadece Tarayıcının içine İzomerkez de tam hayvan kafasını konumlandırma önce.

Şekil 3,
Bir enine MRG gelişmiş LGN ve arka dokusu faiz getirisi (ROI) haritalama bölgenin çeşitli ışık ve yaş koşulları altında naif Retino-tectal projeksiyon Şekil 3.. MEMRI. A) İllüstrasyon (sol) kayıt. LGN spesifik sinyal geliştirme ısı haritası sunum (sağda) ile izah edilir. 1 ve 1 ', sol ve sağ LGN; 2 ve 2 ', arka plan doku; 3, gürültü; P, posterior; R, doğru. Ölçek çubuğu:. MEMRI tarafından orijinal olarak satın enine MR görüntü dilimleri belirlenen gibi tek Retino-tectal projeksiyon boyunca sinyal artışı 100 mikron B) Mekansal haritalama. Dolu kareler, Mn 2 + bağımlı sinyal geliştirme; açık üçgenler, arka sinyal. R, retina; ON, optik sinir; OT, optik sistem; LGN, yanal genikülat çekirdeği; SC, üstün kollikulus; VC, görsel korteks. Dilim kalınlığı 200 mikron. C) Işık uyarım önemli ölçüde retina sinyal geliştirme azaltır. EnhaLGN ve SC ncement görsel uyarı bağımsızdır. Dolgulu çevreler, koyu-adaptasyon; açık daireler, ışık adaptasyon. D) Sinyal geliştirme 3 ve 26 ay arasındaki artan yaş bağımsızdır.

Şekil 4,
Nörodejeneratif koşullar altında Retino-tectal projeksiyon Şekil 4.. MEMRI. A) bilateral ivit enjekte edilen farelerin MEMRI sağ ON tek taraflı ezilme yaralanması bir hafta sonra yapılmaktadır. , Yatay koronal, ve lateral görünümleri multiplanar rekonstrüksiyon yaralı yarımkürede (noktalı çizgiler) için LGN ve SC sinyal artışı tam yokluğunu tasvir. c kontralateral yarımküre; i, ipsilateral hemisfer. Ölçek çubuğu:. 1 mm B) MIP görüntüler ve ON boyunca mekansal sinyal artışı uzunlamasına MRG analizi öncesi veyaralanmadan sonra bir gün. R, retina; ON, optik sinir; lezyon siteyi ok. Ölçek çizgisi:.. Retina hücrelerine Mn + 2 arasında p50 KO farelerde görsel çıkıntının kronik nörodejenerasyon altında sinyal artışı 0.5 mm C) Kinetik Erken (8 saat) alımı etkilenmez, ancak daha önce p50 LGN indirgenir KO fareleri. Tekrarlanan MR 24, 48'de görüntüleme ve (sadece retina için) 72 saat sonra sürekli sinyal azalması gösterir, ancak Mn + 2 taşıma ve p50 KO farelerde retina ve LGN birikim benzer kinetiği.

Film 1: Animasyon, 3D ısı haritası sunum yerinde kontrastlı Retino-tectal projeksiyon MR görüntüleme 15 nmol MnCl 2 ikili ivit enjeksiyonundan 24 saat sonra yapıldı.. Veriler, MIP modunda sunulmuştur. Dilim kalınlığı 200 mikron. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51274/51274_Haenold_Movie1.mp4" target = "_blank"> Videoyu izlemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Görsel sistemin MEMRI naif ve patolojik şartlar altında işlevselliğini değerlendirmek için geleneksel nörobiyolojik teknikleri uzanır. Apart izole MSS fiber sistemin bütünlüğü içine benzersiz bir fikir sağlamasının, MEMRI kolayca görsel algı için belirli bir paradigmanın derhal sonuçlarını araştırmak, davranış örneğin testleri, Optometri ve görsel tabanlı su görevleri ile takviye edilebilir. Ayrıca elektrofizyolojik ve in vivo fonksiyonel görsel tanımlanması ile histolojik araştırmalar bağlar. Tekniği (Şekil 3, hata çubukları görmek 4) son derece güvenilir ve aynı gruplar içinde küçük bireylerarası varyanslı tekrarlanabilir. Bu sinyal iyileştirme, ek Mn + 2 kaynağı 9 tarafından yükseltilmiş edilemez bir düzlüğe ulaşır böylece İlgi çekici, 15 nmol 'lık bir dozajda, Mn + 2, alımı ve aksonal transport süreçleri doymuştur. Pratik bir noktanın itibarenen azından sinyal artışı bazı derecesi, enjeksiyon ilişkili varyasyonları için böyle bir doz tepkisi özelliği en aza indirir, görüntülemek. Özellikle, dozaj ve Mn + 2 sinyal artışı kinetikleri üzerinde sunulan veriler, uygun kontrast elde etmek için fareler için özel ve yaklaşık 10-20x yüksek Mn + 2 doz ve artan bir gecikme (36 saat) farelerde gerektirir, bu farklıdır 13,23. Ayrıca, görsel projeksiyon boyunca iyileştirme bir hayvan 3 yaş ve 26 ay arasında tutarlı kalır. Bu bulgu görsel yaşlanma fareler üzerinde yapılan testler ve C57/B6 fareler kadar 24 yaş 2 yıl normal görsel aktiviteyi sürdürmek gerçeği ile uyumludur. Biz yaşlanma çalışmada fareler tek tek uzunlamasına analiz Her ne kadar, bir önceki sonuçlar, uzunlamasına aging çalışmalarda arzu edilebilir görsel bakım 9, 15 nmol tekrar tekrar tatbik Mn + 2 dozajların güvenliğini göstermektedir.

Mn + 2 RGCs dahil olduğu kavramı ile uygun olarak, Mn + 2 Angenstein ve arkadaşları tarafından uygulanan, serbest metal iyonları gümüş çökeltilmesine dayanır TIMM boyamasıyla somata kendi içine çekmesi göstermektedir. Intraserebral Mn + 2 tespiti için, aşağıdaki sistemik uygulama 22. Daha önce, intraserebral Mn + 2 dağıtım sıçan CNS 25 nöronal devrelerin belirginleştiren 54 Mn + 2 izotop otoradyografisi ile tespit değil, hücresel seviyede edildi. Burada, TIMM boyama Mn 2 + atıf biz RGC ve sinir lifi katmanlarında belirgin gümüş yağış bulmak maruz retina içinde farklı hücre popülasyonlarının, için alımı sağlar. Bu protokol 15 nmol Mn + 2 ile karşılaştırıldığında 150 nmol bir dozda uygulanmasından sonra TIMM lekeleme gösterilmektedir gelişmiş algılama geçerli olduğunu belirtmek gerekir. Mn + 2 alımı ve aksonal trans rağmennoktası zaten yüksek dozda Retino-tectal projeksiyon boyunca hiçbir ek CNR artış kazandırmak, böylece, 15 nmol'deki doymuş, aşırı takviyesi ilişkisiz böylece Mn 2 + ve gümüş yağış için erişilebilir işlemek serbest, protein kullanılabilirliğini artırmak olabilir. Boyama hassasiyet Future refinements tanımlanmış bir bölge içinde histolojik Mn + 2 zenginleşme hücresel konumu ile özel bir CNS çıkıntıların MEMRI bazlı CNR değerler arasında yapılan korelasyonun sağlayacaktır. Böyle bir özellik, aynı zamanda görsel projeksiyon dışındaki diğer CNS bölgelerde Mn + 2 dağılımının karakterizasyonu ve miktar tayini için yararlı olabilir. Aynı şekilde, Mn + 2 hipokamp mossy elyafların 26 arasında dejenerasyon ve rejenerasyon görselleştirmek için bir kainat toksisite modeli kullanılmıştır.

Mn + 2 voltaja bağımlı kalsiyum kanalları tarafından alınmakta ve hücre içinde aktif aksonal taşıma araçları ile dağıtıldığı can kolşisin 25,27 ile bloke edilebilir. MnCI2 bir intraperitoneal doz alan sıçanların Visual uyarma deneyleri, iç ve özellikle dış retina 28 artan bir sinyal artışı ortaya çıkarmıştır. Böylece, karanlık adaptasyonu, bundan başka, görsel uyarı 28 alımı retina Mn 2 + duyarlılığı gösteren, sadece oda ışık koşullarına maruz kalan farelere kıyasla dış retinal katmanlarda sinyal şiddetleri yükseltir. Benzer şekilde, ivit Mn + 2 uygulamadan sonra görsel uyarı maruz farelere kıyasla koyu uyarlanmış farenin retinasında gelişmiş sinyal yoğunluğu bulabilirsiniz. Bu fotoreseptör hücreleri içinde sürekli bir karanlık bir akımın, retina ve kuşağın özel elektrofizyolojik özellikleri ile ilgili olabilir. Fotoreseptör dış segmente Ca 2 + akını ölçüde karanlık akımın anayasa katkıda yana, onların nesil eşlik olabilirtarafından karanlığa fotoreseptör hücre tabakası içine Mn + 2 ko-uptake geliştirilmiş. Buna karşılık, ışık uyarımı karanlık akımını azaltır ve fotoreseptör hücrelerinin 29 hiperpolarizasyona neden olur. Böylece, kaba Mn + 2 uptake ışık koşulları altında azalmış olabilir.

MEMRI güvenilir kullanım için, daha belirgin Mn 2 + görsel projeksiyon ve hatta onun tüm uzantısı diğer bölgelerinde boyunca sinyal geliştirme değiştirir koyu adapte retina içine alımı olup olmadığını açıklığa kavuşturmak için önemlidir. Beyin ağları MEMRI sinyal yoğunluğundaki uyarılması bağımlı değişiklikler intraperitoneal Mn + 2 30 uygulaması sonrasında akustik sistemi için gösterilmiştir. Yu et al. Bu çalışmada, sıçanlarda MR tarar ve alt kolikül T 1 ağırlıklı sinyal artışı, daha sonra araştırılmıştır önce değişken frekanslarda gürültü maruz bırakıldı. Akustik uyarım ÖNEMLİ bulundutly böylece aktivite bağımlı Mn 2 + birikimi 30 fMRI gibi karakter örneklendiren bir tonotopic temsil MEMRI sinyal şiddetleri artar. Buna karşılık, bizim deneysel LGN Mn 2 + birikimi kurmak ve SC görsel uyarım bağımsız görünür. Bununla birlikte, duyusal beyin haritalama girişimlerinde bu farklar Yu ve diğerleri 30 tarafından kullanılan yüksek alan 7 T tarayıcı ile karşılaştırıldığında daha düşük bir manyetik alan ve 3 T tarayıcı saptanmasının sınırlı eşik ortaya çıkabilir.

Bugüne kadar, bu ölçüde biyofizik parametreleri anterograd aksonal Mn 2 + ulaşım ve nasıl MEMRI elektriksel aktivite için bir gösterge olarak hizmet olabilir etkileyecek ne bilinmemektedir. Bununla birlikte, bu RGCs Mn + 2 iletimi bağımsız bir şekilde, çift kutuplu hücrelerinden alınan ışık özel uyarılma ve elektrik giriş, en azından kısmen, meydana geldiği göstermektedir. Alternatif olarak, elektrik a net etkisiRetino-tectal izdüşümü içinde ctivity karanlık duyarlı 'OFF-RGCs' elektrik stimülasyonu ve 'ON-RGCs' ışık duyarlı bir sonucu olabilir. Böyle bir yorum Retino-tectal projeksiyon boyunca Mn 2 + ulaşım gibi retina dejenerasyonuna 11 neden Pde6b geninin rd1 mutasyonu taşıyan CBA fareler gibi kötü vizyonu ile fare suşları, engelli olmadığı bulgusuna tarafından desteklenmektedir. Yabani tip gören ve CBA fareler üzerinde kinetik çalışmada, benzer taşıma hızları (2.5 saat enjeksiyon sonrası at) başlangıç ​​akış aşamasında ve LGN ve SC 11 (24 saat sonra) nihai sinyal artışı gözlenmiştir.

Birlikte ele alındığında, bu gözlemler MEMRI, örneğin, görsel sistemin burada örneklediği gibi, oldukça elektriksel aktivite için daha yapısal bütünlüğü ve metabolik istikrar için değerli bir önlem olduğunu fikrini desteklemektedir. Pratik olarak, görünüşte sışık maruz serebral LGN ve SC sinyal artışı tablo bağımsızlığı aydınlatma ile ilgili özel bakım olmadan sağlam taşıma ve hayvanların barınma sağlar. Öte yandan, retinal sinyal artışı odak MEMRI çalışmalar için, bu tarama önce sıkıca kontrollü ışık koşulları altında hayvanları korumak için gereklidir.

Mn + 2 aksonal transport oranları ve daha sonra MEMRI sinyal artışı etkiler fizyolojik parametreler arasında, vücut sıcaklığının istikrar ve özel öneme sahip olabilir. Bu zenginleşme önemli ölçüde 30 ° C vücut sıcaklığının geçici bir azalma da azalmış olduğu bulunmuştur beyin, birinci koku projeksiyon hedeflerin arttırılması için burun içi Mn + 2 ile ilgili çalışmalar ile belirtilir normal vücut sıcaklığının altında 27 geliştirme sinyal ile karşılaştırıldığında. Bu yüzden, vücut ısısı önce ve MR boyunca izlenmesi ve ayarlanması gerekmektedir p için değil sadece tararhayvanların sağlığını rotect değil, aynı zamanda, Mn + 2 yayılma fizyolojik parametreleri normalize etmek.

Patofizyolojik değişiklikler ve metabolik bozuklukları Mn + 2, projeksiyon merkezlerinde sinyal artışı aksonal taşıma etkinliğini etkilediği için, örneğin, LGN ve SC, yapısal bütünlüğünü ve bu yolda fonksiyonel aktivitesi için bir ölçü olarak hizmet edebilir. Burada, ON dejenerasyon, iki farklı koşullar mevcut ve talamik ve beynin merkezlerinde Mn + 2 yayılma ve zenginleştirme aksonal bütünlüğünün bir fonksiyonu olarak değişir olduğunu göstermektedir. P50 KO mutant yavaş aksonal dejenerasyon iken ilgili aksonal rejenerasyon eksikliği nedeniyle 4 hafta içinde geri gelmez hemen yaralanma sonrası toplam sinyal kaybı, akut ON yaralanma sonuçları LGN azaltılmış CNR değerleri ile yansıtılır. Uzunlamasına görüntüleme olasılığı göz önüne alındığında, MEMRI bu uygulama değerli f olabilirveya ON postlezyonel büyüme tepkilerini izleme ve RGCs proregenerative genetik ya da farmakolojik müdahalelerin soruşturma için izin verir.

Buna ek olarak, kronik aksonal dejenerasyon süreçleri ile ilişkili sinyal artışı kademeli bozuklukları tespit etmek için çok hassas bir yöntem olarak MEMRI mevcut. Transkripsiyon faktörü NF-KB görsel sistemin 19 içinde NF-KB ekran yaşa bağlı nöronal hücre kaybı ve aksonal dejenerasyon p50 alt biriminin silinmesi ile nöronal bakım ve farelerde katılır. Histolojik ve elektron ek olarak mikroskobik Retino-tectal projeksiyon MEMRI bu farelerde fenotipik değişiklikleri tespit etmek mümkün, analiz eder. Ivit Mn 2 + uygulamasını aşağıdaki seri T 1 ağırlıklı MR görüntüleri satın alarak, bu p50 de görsel yolu boyunca bir basitçe gecikmiş Mn 2 + ulaşım düşürüldü genel ayırtKO fareleri. Böylece, tek bir Mn 2 + Uygulamadan sonra MEMRI tekrarlanan veri toplama mevcut genetiği değiştirilmiş farelerin paha biçilmez havuzunda aksonal taşıma kinetik ve nörofizyolojik değişiklikler tanımını sağlar. Şu anda, MEMRI çeşitli modifikasyonlar İnsanlarda teşhis uygulamaları için bu teknik güvenli hale getirmek amacıyla araştırılmaktadır. Enjeksiyon ivit bir alternatif teşkil yüksek klinik alaka, bir ümit verici yaklaşımı, göz damlaları gibi Mn 2 + teslim edilir. Görüntüler 4.7 T hayvan tarayıcı 31 elde edildiğinde Böylece, 1 M MnCl 2 topikal uygulanması SC% 20 oranında önemli bir sinyal donanımı vermiştir. Yöntem, retinal iskemi 31 aşağıdaki dejenerasyon ON geniş tespit başardı, ve arka arkaya aylık aralıklarla 32 uygulandığında uygulanan konsantrasyon güvenli kanıtladı. Mn2 + 'nın nispeten yüksek göz önüne alındığında, nörotoksisite örneğin, klinik olarak anlamlı MEMRI uygulamaları desteklemek için yararlı olacaktır.

Özetle, bizim çalışma MEMRI böylece görme sisteminin işlevselliğini değerlendirmek için Optometrik görevleri uzanan, farelerde Retino-tectal circuitries incelemek için güçlü bir deneysel bir yaklaşım olduğunu göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

AK Velux Vakfı tarafından desteklenen Oppenheim Vakfı ve RH tarafından desteklenmektedir. Biz histolojik destek için teknik ve K. Buder I. Krumbein teşekkür ve TIMM boyama üzerine teknik danışmanlık için J. Goldschmidt (Nörobiyoloji, Magdeburg, Almanya için Leibniz Enstitüsü).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M1787 MEMRI contrast reagent
Conjuncain Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany PZN 7617666 0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany PZN 3820927 3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol Jenapharm, Jena, Germany PZN 3524531
Chloral hydrate  Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany C8383 420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe  Hamilton Company, Reno, NV, USA 7634-01 SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN) Hamilton Company, Reno, NV, USA 207434/00 removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000 Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany 6502 tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O) Merck, Darmstadt, Germany 106346 for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O) Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany 208043
Gum arabic Roth, Arlesheim, Switzerland 4159 for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2) Roth, Arlesheim, Switzerland 3586
Citric acid (C6H8O7) Roth, Arlesheim, Switzerland 6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O) Merck, Darmstadt, Germany 106448
Silver nitrate (AgNO3) Roth, Arlesheim, Switzerland 7908

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kretz, A., et al. Simvastatin promotes heat shock protein 27 expression and Akt activation in the rat retina and protects axotomized retinal ganglion cells in vivo. Neurobiol Dis. 21, 421-430 (2006).
  2. Lima, S., et al. Combinatorial therapy stimulates long-distance regeneration, target reinnervation, and partial recovery of vision after optic nerve injury in mice. Int Rev Neurobiol. 106, 153-172 (2012).
  3. Lima, S., et al. Full-length axon regeneration in the adult mouse optic nerve and partial recovery of simple visual behaviors. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9149-9154 (2012).
  4. Goetze, B., et al. Vision and visual cortical maps in mice with a photoreceptor synaptopathy: reduced but robust visual capabilities in the absence of synaptic ribbons. Neuroimage. 49, 1622-1631 (2010).
  5. Luo, X., et al. Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury. Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).
  6. Pautler, R. G., et al. In vivo neuronal tract tracing using manganese-enhanced magnetic resonance imaging. Magn Reson Med. 40, 740-748 (1998).
  7. Watanabe, T., et al. Mapping of retinal projections in the living rat using high-resolution 3D gradient-echo MRI with Mn2+-induced contrast. Magn Reson Med. 46, 424-429 (2001).
  8. Pautler, R. G. In vivo, trans-synaptic tract-tracing utilizing manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI). NMR biomed. 17, 595-601 (2004).
  9. Haenold, R., et al. Magnetic resonance imaging of the mouse visual pathway for in vivo studies of degeneration and regeneration in the CNS. Neuroimage. 59, 363-376 (2012).
  10. Lindsey, J. D., et al. Magnetic resonance imaging of the visual system in vivo: transsynaptic illumination of V1 and V2 visual cortex. Neuroimage. 34, 1619-1626 (2007).
  11. Bearer, E. L., et al. Role of neuronal activity and kinesin on tract tracing by manganese-enhanced MRI (MEMRI). Neuroimage. 37, Suppl 1. S37-S46 (2007).
  12. Mendonca-Dias, M. H., et al. Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging. Semin Nucl Med. 13, 364-376 (1983).
  13. Thuen, M., et al. Manganese-enhanced MRI of the optic visual pathway and optic nerve injury in adult rats. J Magn Reson Imaging. 22, 492-500 (2005).
  14. Sandvig, I., et al. In vivo MRI of olfactory ensheathing cell grafts and regenerating axons in transplant mediated repair of the adult rat optic nerve. NMR biomed. 25, 620-631 (2012).
  15. Chan, K. C., et al. In vivo retinotopic mapping of superior colliculus using manganese-enhanced magnetic resonance imaging. Neuroimage. 54, 389-395 (2011).
  16. Chan, K. C., et al. In vivo chromium-enhanced MRI of the retina. Magn Reson Med. 68, 1202-1210 (2012).
  17. Herrmann, K. H., et al. Possibilities and limitations for high resolution small animal MRI on a clinical whole-body 3T scanner. Magma. 25, 233-244 (2012).
  18. Villegas-Perez, M. P., et al. Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats. J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).
  19. Takahashi, Y., et al. Development of spontaneous optic neuropathy in NF-κΒ50-deficient mice: requirement for NF-κΒp50 in ganglion cell survival. Neuropathol Appl Neurobiol. 33, 692-705 (2007).
  20. Herrmann, K. H. P., et al. MRI compatible small animal monitoring and triggering system for whole body scanners. Z Med Phys. 24, 55-64 (2013).
  21. Danscher, G., Zimmer, J. An improved Timm sulphide silver method for light and electron microscopic localization of heavy metals in biological tissues. Histochemistry. 55, 27-40 (1978).
  22. Angenstein, F., et al. Manganese-enhanced MRI reveals structural and functional changes in the cortex of Bassoon mutant mice. Cereb cortex. 17, 28-36 (2007).
  23. Thuen, M., et al. Manganese-enhanced MRI of the rat visual pathway: acute neural toxicity, contrast enhancement, axon resolution, axonal transport, and clearance of Mn(2). J Magn Reson Imaging. 28, 855-865 (2008).
  24. Lehmann, K., et al. Vision and visual plasticity in ageing mice. Restor Neurol Neurosci. 30, 161-178 (2012).
  25. Takeda, A., et al. Manganese transport in the neural circuit of rat CNS. Brain Res Bull. 45, 149-152 (1998).
  26. Nairismagi, J., et al. Manganese-enhanced magnetic resonance imaging of mossy fiber plasticity in vivo. Neuroimage. 30, 130-135 (2006).
  27. Smith, K. D., et al. In vivo axonal transport rates decrease in a mouse model of Alzheimer's disease. Neuroimage. 35, 1401-1408 (2007).
  28. Berkowitz, B. A., et al. Noninvasive and simultaneous imaging of layer-specific retinal functional adaptation by manganese-enhanced MRI. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2668-2674 (2006).
  29. Schnapf, J. L. B. D. A. How photoreceptor cells respond to light. Sci. Am. 256, (8), (1987).
  30. Yu, X., et al. In vivo auditory brain mapping in mice with Mn-enhanced MRI. Nat Neurosci. 8, 961-968 (2005).
  31. Sun, S. W., et al. Noninvasive topical loading for manganese-enhanced MRI of the mouse visual system. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 3914-3920 (2011).
  32. Sun, S. W., et al. Impact of repeated topical-loaded manganese-enhanced MRI on the mouse visual system. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 4699-4709 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics