수초 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 (MOG

Immunology and Infection
 

Summary

실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)는 다발성 경화증의 설립 동물 모델입니다. C57BL / 6 마우스는 중추 신경계 자기 반응성 면역 세포에 의해 야기 오름차순 이완성 마비를 초래 미엘린 희소 돌기 아교 세포의 당 단백질 (MOG) 펩티드 35-55 (MOG 35-55)로 면역화된다. 질병 유도 및 모니터링을위한 프로토콜이 논의 될 것이다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (86), e51275, doi:10.3791/51275 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

다발성 경화증은 강력한 신경 변성 성분과 중추 신경계의 만성 탈수 초성 다발 신경의 신경 염증성 질환이다. 질병의 정확한 원인은 아직 불분명하지만, 자기 반응성 T 림프구의 병태 생리에서 중요한 역할을하는 것으로 생각된다. MS 치료는 지금까지 단지 부분적으로 효과적이고 연구 노력은 질환의 병태 생리에 대한 우리의 지식을 확장하고, 새로운 치료 전략을 개발하는 것을 계속한다. 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)는 MS가 많은 임상 및 병리 생리 학적 기능을 공유하기위한 가장 일반적인 동물 모델입니다. 인간 MS의 다른 임상 면역 조직 학적 측면을 반영 EAE 모델의 광범위한 다양성이있다. 마우스에 적극적으로 유도 EAE 강력하고 복제 결과 가장 쉬운 유도 모델입니다. 그것은 특히 면역 neuroi 의해 도전 트랜스 제닉 마우스를 사용하여 약물의 또는 특정 유전자의 효과를 조사하기에 적합nflammation. 따라서, 마우스는 CNS 균질 또는 미엘린 단백질의 펩티드로 면역화된다. 때문에 이러한 펩티드의 낮은 면역 원성 가능성에 강한 보조제가 사용됩니다. EAE 감수성과 표현형은 선택 항원 및 설치류의 변형에 따라 달라집니다. C57BL / 6 마​​우스는 유전자 변형 마우스 건설에 일반적으로 사용되는 변형하고 수초 희소 돌기 아교 세포의 당 단백질 (MOG)에 다른 사람의 사이에서 반응한다. 면역 원성 에피토프 MOG 35-55은 이틀 후 예방 접종의 날에 적용되는 완전한 프로 인트 아쥬 반트 (CFA) 이전에 예방 접종 백일해 독소에 일시 중단됩니다. 마우스는 예방 접종 후 9-14일에서 흐늘 흐늘 한 마비를 오름차순으로 "클래식"자기 제한 단상 EAE을 개발한다. 생쥐 25-50일 대한 임상 점수 시스템을 사용하여 매일 평가된다. 관리 EAE와 동물의 촬영뿐만 아니라이 모델의 응용 가능성과 한계에 대한 특별한 고려 사항에 대해 설명합니다.

Introduction

다발성 경화증 (MS)은 중추 신경계의 만성 탈수 초 염증성 질환이다 상기 이종 및 축적 임상 증상 및 희소 돌기 아교 세포의 뉴런 결과의 파괴. MS는 중추 신경계 (CNS)의 프로토 타입 면역 질환으로 고려되고 동물 모델은 그 복잡한 발병 기전에 빛을 발산하기 위해 개발되었다. 또한, 현재의 치료법은 부분적으로 만 효과적이며 신경 변성 성분은 아마도 미래의 치료를위한 중요한 도전 동안 주로 질환의 염증 단계를 표적으로하는 것은 1,2 접근한다.

질병의 정확한 원인은 아직 불분명하지만, CNS에서 축삭의 수초 에피토프에 대한 면역 반응은 질병의 발병을 자극하는 것으로한다. 면역계, 유전 취약성 및 환경 적 요인 (예 : 감염, 비타민 D)의 조절 곤란이 믿어진다MS의 병태 생리 학적 메커니즘의 영향 중앙 부분.

동물 모델의 세 가지 유형이 현재 MS의 병리학 적 패턴의 탐사를 위해 설립 : Theiler의 쥐 뇌척수염 바이러스 (TMEV)와 같은 바이러스 성 모델, cuprizone 같은 독성 요원에 의해 유도 된 모델, 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) (3) 마지막으로 다른 변종, 4. 그들 모두가 MS의 기능을 모방 있지만, 그들은 적응 면역 체계의 참여와 같은 기본 병적 인 기능에 엄청난 차이가 있습니다. 이 신경 염증성 경로를 조사하기 위해 특히 유용합니다 종종 새로운 치료 전략 5,6의 효능에 대해 "증거의 원칙"모델 역할로 EAE는 가장 일반적인 동물 모델입니다. EAE는 많은 다른 동물 (예를 들어, 마우스, 쥐, miniswine, 기니 돼지, 닭, 또는 영장류)에 유도 할 수있다. 그러나, 생쥐는 적어도 부분적으로 인해 가장 널리 이용되고있다 종정교한 유전자 변형 또는 녹아웃 마우스 (7)의 레퍼토리를 확장합니다.

EAE의 병태 생리학은 뇌 특정 항원에 대한 면역 시스템의 반응에 기초한다. 이 반응은 유사한 신경 학적 및 병리학 적 기능의 결과로, 항원의 장부 구조의 염증과 파괴를 유도하는 MS 환자에서 관찰 된 것과. 세 가지 다른 접근 방식이 구분 될 수있다 : 적극적으로 유도 EAE (aEAE, 활성 예방 접종),자가 면역의 연구를 허용하고, 최근에는 자연 EAE 마우스 모델 (sEAE) 수동적으로 EAE 전송, (예방 접종 동물에서 encephalitogenic 세포의 전송 pEAE) 외인성 조작없이 기계. 가장 쉬운 유도 모델은 빠르고 강력한 결과에 항복 마우스에서 aEAE입니다. 이 모델은 필드 8에있는 많은 연구자에 의해 neuroimmunological 동물 모델의 "금 표준"으로 간주됩니다.

aEAE 유도를 들어, 동물선택된 항원으로 이루어진 에멀젼의 피하 주사와 예방 접종 및 예방 접종 하루 이틀 나중에 백일해 독소의 복강 내 주사와 함께 인트 adjuvans (CFA)를 완료합니다. 따라서, 미엘린 특정 T 림프구 외주 활성화 및 혈액 - 뇌 장벽을 가로 질러 CNS에 마이그레이션된다. CNS에 진입하면, T 세포는 단핵구 또는 대 식세포 결국 탈수 초화 및 축삭 세포의 죽음 9와 같은 다른 세포의 후속 염증 폭포, 참여의 결과로 지역 및 침투 항원 제시 세포에 의해 활성화된다. 예방 접종 프로토콜 및 마우스 변형의 조합에 따라 (예 : C57BL / 6, SJL / J, Biozzi) 및 항원 (예를 들면 수초 희소 돌기 아교 세포의 당 단백질 (MOG), 수초 기본 단백질 (MBP), 수초 테오 단백질 (PLP)), 질병 과정은 급성, 만성 진보 또는 재발 송금인 질병의 코스를 수강 할 수 있습니다.

35-55 펩티드 (10)와 C57BL / 6 마우스의 예방 접종에 대한 프로토콜을 설명 다음 10-20일 이상. 단독 MOG 35-55 펩티드의 면역 원성 잠재력 질환을 유발하기에 충분하지 바와 같이, 예컨대 CFA 보조제가 필요하다. 그것은 CFA의 구성 요소가 이러한 분자의 식균 작용 및 사이토 카인의 분비를 유도하는 단핵 식세포를 활성화 것을 가정한다. 이것은 항원의 존재 및 림프계 이들의보다 효율적인 전송의 연장 초래한다. EAE 유도는 다른 사람의 사이에서 조절하는 제안 된 백일해 독소 (PT)의 응용 프로그램에 의해 촉진된다혈액 - 뇌 장벽과 면역 응답 자체 11. 질병 유도 한 후, 특별한주의가 질병의 증상에 대한 마우스의 매일 평가를 수행해야합니다.

Protocol

마우스 실험 1. 일반 댓글

  1. 마우스를 사용하여 모든 실험은 각각의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 수행되어야한다.
  2. 무균 조건 하에서 쥐를 유지하고 물과식이에 액세스 할 수 있도록. 주 : 질병에 대한 감수성은 나이, 성별에 따라 달라질 수 있기 때문에 실험 그룹으로 나이와 성별 일치 마우스를 사용하는 것이 중요합니다.
  3. MOG 35-55 펩티드 항원 또는 nonencephalitogenic 펩티드가 있거나없는 PBS로 대체되는 경우 선택된 실험 조건에 따라서는, 가성 면역화 대조군으로 간주 될 수있다.
  4. (아래 참조) 이전에 시작 실험에 대한 방법 론적 측면을 고려하시기 바랍니다. 우리는 EAE 점수에 대한 하나 또는 두 개의 눈을 멀게 관찰자를 포함하는 것이 좋습니다.

MOG 35-55 에멀젼 2. 준비

  1. MO의 1:1 비율의 200 μLG 35-55 펩타이드 솔루션 및 CFA는 각 마우스에 주입해야한다. 준비하고 주입하는 동안 점성 에멀젼의 일부 손실이있다. 따라서, 필요한 양의 1.5 배를 준비합니다. MOG 35-55 펩타이드 솔루션 및 CFA 모두의 필요한 양의 2에 의한 에멀젼과 분열의 전체 볼륨을 계산합니다.
  2. 2 ㎎ / ㎖의 최종 농도 DDH 2 O에 동결 건조 MOG 35-55을 희석. 우리는 일반적으로 200 μg의 MOG에게 마우스 당 35-55 펩타이드를 사용합니다. 이 금액은 스톡 용액 100 μL에 포함된다. 펩티드 용액을 -20 ℃에서 보관해야
  3. 박격포로 건조 된 결핵균 H37RA (100 mg)을 1 병의 내용을 넣습니다.
    1. 얇은 분말을 얻을 수 박격포와 유 봉 접지.
    2. 4 ° C.에 저장 될 수있는 10 ㎎ / ㎖ CFA 원액을 얻을 불완전 프로 인트 보조제 10 ㎖를 추가
    3. 이전에 예방 접종을, CFA 원액 재치를 희석2 ㎎ / ㎖의 최종 농도 H IFA. 미립자 물질을 재현 탁하고 실험 준비하는 동안 점성 솔루션의 일부 볼륨 손실을 고려하는 각 사용하기 전에 철저하게 섞는다.
    4. 1 밀리그램의 최종 농도 / ㎖에 도달 할 때까지 MOG 35-55 펩티드 용액과 1:1로 섞는다.
      주의 : 열 사망 결핵균은 타고난 면역 반응을 자극한다. 흡입, 섭취, 피부 및 눈에 접촉하지 않도록 할 것.
  4. 얼음에 솔루션을 Precool.
    1. 두 개의 2 ㎖ 주사기로 1 2 ㎎ / ㎖ CFA ㎖ 및 1 ㎖ 2 ㎎ / ㎖ MOG 35-55 솔루션을 그립니다. 면역화 된 동물의 수에 따라 필요한 주사기의 개수를 계산한다.
      주의 : 엄밀히 말하면 그것은 육아종을 유발하거나 면역 반응을 유도 할 수 있으므로 도움이되는 준비 중에 바느질하지 마십시오.
    2. MOG 35-55 솔루션 및 CFA에 대한 20 G 정맥에 27 G 정맥을 사용합니다. 공기 방울을 피하고에서 모두와 주사기를 연결하는 hree 방향 밸브.
    3. 다른 하나의 주사기에서 에멀젼을 보내기 좋은 유화가 중요한 단계입니다 적어도 10 분 동안 잘 혼합. 유화를 지원하는 세 방향 밸브를 거의 닫습니다. 이 솔루션은 흰색 뻣뻣하고 단계없이 분리와 점성해야한다.
    4. 에멀젼은 이전에 예방 접종을 몇 일 동안 저장할 수 있습니다. 그들은 안정 여부를 관찰하기 위해 에멀젼을 제조 한 후 적어도 30 분을 기다립니다. 이전에 예방 접종을 두 주사기 중 하나에 솔루션을 그리고 27 G 정맥을 연결합니다.

백일해 독소의 3. 준비

  1. 백일해 독소의 다른 양 또한 투여 경로 (예를 들어 정맥 내 또는 복강 내)에 의존하기 문헌에서 찾을 수있다. 우리 연구실은 복강 예방 접종의 날에 PBS 200 μL에 백일해 독소 (400) NG를 사용하고 이틀 후. 주의 : 백일해 독소는 많은 생물학적 효과를 가지고. 흡입, 섭취, 피부 및 눈과의 접촉을 피하십시오.
  2. 100 ㎍ / ㎖의 원액 500 μL의 DDH 2 O에서 백일해 독소의 50 μg을 재구성. 4 ℃에서 보관
  3. PBS로 1:50 희석. 200 ㎕의 현재 PBS의 400 NG가 포함되어 있습니다. 주사기의 필요한 양을 준비하고 각각의 바늘 허브를위한 ~ 100 μL를 추가로 여분의 볼륨을 고려하십시오.

4. 동물 예방 접종

  1. 필요한 단기 안락사에 대한 특정 기준에 대한 기관 동물 관리 및 사용위원회에 문의 해주세요. 이러한 케타민 / 자일 라진 주사 또는 halothan 같은 다른 프로토콜도 가능하다 동안 우리 연구실은 이소 플루 란과 간단한 마취제를 사용합니다. 마취를 기다린 마취의 수준을 평가하기 위해 앞발 발가락 핀치를 사용합니다.
  2. 예방 접종은 동물에 대한 스트레스를 최소화하고 최적의 예방 접종을 위해 숙련 된 사람에 의해 수행되어 있는지 확인합니다.
  3. 반대로 100 μl를 주입각각의 뒷 측면에 두 개의 서로 다른 사이트에 세대 / CFA 에멀젼 피하. 피부 아래 구근 대량 양식이 실험을하는 동안 유지해야하는 지 확인하십시오.
  4. intraperitonelly 백일해 독소의 200 μl를 주입한다.
  5. 각각의 마우스는 쉽게 꼬리베이스의 색상 표시에 의해 예를 들어, 매일 평가를 식별 할 수 있는지 확인합니다.
  6. 예방 접종 후 하루에 두에 백일해 독소의 두 번째 용량을 관리 할 수​​ 있습니다.

5. EAE 모니터링

  1. 무게 및 임상 점수는 매일 평가되어야한다. EAE의 발병은 일반적으로 질병 활성의 지표로서 사용될 수있는 체중 감소와 상관. 기관 동물 관리를 참조 및 개별 생쥐 실험을 꺼내해야 할 때 기준을 미리 정의 할위원회를 사용하십시오. 체중 감소는 20 초기 체중의 %하거나 심한 임상 증상이 (EAE 7 또는 더 나쁜 점수) 발생을 초과 할 때 고려되어야한다. 재를 참조하십시오허용되는 최대 점수에 대한 각 기관의 동물 관리 및 사용위원회의 spective 지침.
  2. 생쥐가 EAE의 임상 증상을 가질 때, 수통 여전히 도달 할 수 있고 음식이 케이지 바닥에 배치하는 것이 중요하다.
  3. 다양한 스코어링 증상이 사용될 수있다. 우리의 실험실에서 0-10 스케일이 설정됩니다.
학년 임상 기호 논평
0 임상 징후 없다 마우스 꼬리의 기지에서 개최하면 일반 걸음 걸이, 꼬리의 움직임과 제기 될 수 있으며, 꼬리는 둥근 물체를 감싸는
1 부분적으로 맥 빠진 꼬리 정상적인 걸음 걸이, 꼬리의 끝이 처진다
2 마비 꼬리 정상적인 걸음 걸이, 꼬리는 처진다
3 뒷다리 마비, 조정되지 않은 움직임 조정되지 않은 걸음 걸이, 꼬리 파행, 뒷다리는 곤란에 응답
4 마비 하나의 뒷다리 하나의 뒷다리 드래그로 조정되지 않은 걸음 걸이, 꼬리 맥진 한 뒷다리가 끼에 응답하지 않습니다
5 두 뒷다리 마비 드래그 두 뒷다리와 조정되지 않은 걸음 걸이, 꼬리 파행, 두 뒷다리가 끼에 반응하지 않는
6 뒷다리 마비, 앞발의 약점 앞다리와 조정되지 않은 보행은 꼬집기 후에 몸, 앞다리의 반사를 당겨 투쟁, 꼬리는 파행
7 뒷다리는 앞다리 하나가 마비, 마비 마우스를 움직일 수없는, 하나의 앞다리는 발가락 핀치, 꼬리가 파행 응답
8 뒷다리는 두 앞발 마비, 마비 마우스를 두 앞발은 발가락 핀치에 반응하지 않는, 움직일 수없는, 꼬리는 파행
9 죽어가는 번호 이동, 변경 호흡
10 죽음

표 1. 임상 채점 시스템.

Representative Results

접종 후, 마우스 체중 및 임상 증상의 변화를 매일 평가되어야한다. 질병의 발병은 일반적으로 EAE 현상 볼 수 있습니다 1-2일 전에 시작할 수있는 무게의 감소와 상관 관계가있다. EAE의 임상 증상은 보통 하루에 9, 14 후 예방 접종 사이에 시작합니다. 병변이 주로 C57BL / 6 마​​우스에있는 MOG-EAE에서 척수 언어로 번역, 그들은 일반적으로 주동이의 패턴에 꼬리에 주로 행등 증상을 개발할 수 있습니다. EAE의 증상과 예방 접종 마우스의 예시 사진 (6 득점)는도 1a에 도시되어있다. 일부 비정형 EAE의 증상은 또한 축 로터리 방식으로 압연으로 발생할 수있는, 고전 EAE에서 반영되지 않습니다 새우등 모양이나 과민 반응은 표 1에 묘사 된 점수. 모터 증상이 모델의 주요 특징으로,이 점수는 우리에게 주는가 질병의 심각도의 좋은 표시. 다른 모니터링 시스템 (예를 들어, 0 득점 -다른 적자를 평가하는 5 또는 0 ~ 6) 더 복잡한 복합 점수도 발표되었다. 증상이 심한 경우는 각각의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 실험의 반출 할 필요가 가진 생쥐에주의하시기 바랍니다. 마우스는 다음 10-20일 이상 증상이 일반적으로 부분적인 회복을 보여줍니다. 대표적인 질병 과정은 그림 1B에 도시되어있다. 결과 매개 변수를 평가하기위한 관심의 EAE 동안 다른 시간 지점이 있습니다. 자주 찾을 수있는 몇 가지 일반적인 분석은 매우 간략하게 설명되어 있습니다. 질병 최대, 마우스는 체외에서 MOG 35-55 펩타이드 (MOG 리콜 분석)와 격리 된 면역 세포의 restimulation 후 사이토 카인의 생산 확산을 위해 평가 될 수있다. 면역 세포는 EAE의 증상이 뇌와 마우스의 척수에서 분리하고 추가로 처리, 유동 세포 계측법에 의해 예를 들어 있습니다. 척수 부분의 조직 학적 분석은 질병 m에서 수행 될 수있다병변 부하와 탈수 초화 aximum, 나중에 신경 변성 및 신경 세포 사멸에 대한 마커를 점하면서 관심이있을 수 있습니다.

그림 1
그림 1. 대표 EAE 결과. 30 일 예방 접종 후 EAE의 증상과 예방 접종을 C57BL / 6 마우스의 A. 대표 사진 (EAE 6 득점). B. 주제 질병 과정. 데이터는 평균과 평균의 표준 오차로 표시됩니다 (N = 5). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

Discussion

능동 면역화 프로토콜과 상이한 EAE 모델의 다중은 지난 수십 년에 걸쳐 설명되었다. 쥐 모델은 최근까지 널리 이용되고 있지만, 마우스는 지금 EAE 연구를위한 가장 인기있는 모델 생물이다. 이러한 발전으로 인해 가능 형질 전환 마우스의 광범위하고도 증가 레퍼토리에 다른 사람 중 하나입니다. MOG 35-55 펩티드와 C57BL / 6 마우스의 면역화는 가장 널리 분산 EAE 모델의 하나이며, 신뢰성 복제 잘 사용하기 동물 모델로 간주 될 수있다. 다른 EAE 모델이보다 구체적인 실험 질문에 사용하는 동안 많은 neuroimmunological 실험실에서, MOG 35-55 유도 EAE는 선택의 모델로 설정됩니다.

고려해야 할 중요한 점은 EAE의 실험 방법 론적으로 올바른 수행되는 것을 보장하기 위해 실험 설정의 계획이다. 내부 유효성, 질병의 증상의 눈을 멀게 득점은 매우 좋습니다. exper를imental 그룹이 있어야한다 연령, 체중, 성별 일치와 마우스가 무작위로 치료 그룹에 할당해야합니다. 실험은 항상 동물 복지 규정에 따라 수행되어야한다. EAE 연구는 종종 파워 부족하고 계정에 통계 유형 II 오류을지지 않습니다. 따라서, 종래의 실험으로, 샘플 크기 계산이 수행되어야한다. 필요한 그룹의 크기는 예상 효과의 크기에 따라 달라집니다. 통계 분석에 대한 전문가의 상담 EAE 실험을 시작하기 전에 고려 될 수있다.

프로토콜의 몇 가지 제한 사항을 염두에 보관해야합니다. 가장 중요한 것은, aEAE 데이터의 해석은 면역 반응에 모두 추가 영향을 보조 백일해 독소의 사용과 예방 접종의 모드에 의해 손상된다. 또한 MOG 35-55 EAE 모델은 주로 면역 반응을 구동 CD4 + T 세포를 보여주는 것이 고려되어야한다. CD8 + T 세포와 B 세포가 재생이러한 세포 유형을 어드레싱 할 때 덜 두드러진 역할 및 대안 프로토콜이 고려되어야한다. 예상되는 질병 과정은 급성 단상과 자기 제한됩니다. 대안 적으로, 되돌아가 송금 투병 기간은 또한 대체 EAE 모델에서 달성 될 수있다. 프로토콜의 또 다른 중요한 한계는 MS의 병태 생리의 면역 성분으로 특정 편견이다. 지난 몇 년 동안, MS는 강력한 신경 퇴행성 구성 요소가 점점 명백 해졌다. 신경 학적 결손의 진보적 인 축적 희소 돌기 아교 세포 및 뉴런 결과의 죽음. 그것은 EAE 모델이 완전히자가 면역 염증의 퇴행성 신경 메커니즘에 관한 실험 문제를 해결하기 위해 적합하지 않을 수 있음을 고려해야한다. CNS 병리에 초점을 맞춘 다른 동물 모델이 고려 될 수있다 - 주변 면역 체계의 개입없이 독성 탈수 초화를 훼손 cuprizone 모델 예.

설명 프로토콜은 기본 neuroimmunological 실험 모델로 간주하고 다른 응용 프로그램에 수정 될 수 있습니다. 상술의 실험 절차는 쉽게 다른 생쥐 균주에 의해 다른 EAE 프로토콜에 적용될 수 또는 유형 및 단백질의 양 (예를 들면 치료 적 평가에 특히 적합 되돌아가 송금 EAE 질병 과정에 대한 PLP에게 139-151 펩티드 및 SJL 마우스를 사용 재발에 대한 영향). 기술 된 프로토콜은 또한 대체 전송 실험 (패시브 EAE)을 위해 사용될 수있다. 이 모델에서, C57BL / 6 마우스는 MOG 35-55 펩타이드 전술 한 바와 같이 CFA와 함께 예방 접종을하고 있습니다. 반면, 백일해 독소가 필요하지 않습니다. 7-15 일 비장 또는 림프절은 고립되고, 면역 세포는 C57BL/6se 마우스의 새로운 그룹으로 전송하기 전에 MOG 35-55 펩타이드 및 각종 사이토 카인과 함께 체외에 재 자극 후. 이받는 마우스는 몇 일전 CLAS시보다 EAE을 개발sical 예방 접종. 체외 조건은 특정 면역 학적 질문 (T H 1 또는 T H 17 세포에 예를 들어 편광)을 변화시킬 수있다.

때로는 낮은 질병 발생 또는 약한 증상은 실험적인 도전이 될 수 있습니다. 문제 해결을위한 몇 가지 권장 사항은 다음과 같습니다 :

- 중증도는 펩티드 / 마우스의 상이한 양으로 변화 될 수있다.

- 최적의 CFA 농도는 1 ~ 5 ㎎ / ㎖에서 다를 수 있습니다. 실험을 설정할 때 CFA의 적정을 고려하십시오. 많은 규제가 2 ㎎ / ㎖를 초과하는 CFA 농도를 금지 허용 CFA 농도에 대한 각 기관의 동물 관리 및 사용위원회의 각각의 가이드 라인을 참조하시기 바랍니다.

- 다른 방법으로는 에멀젼 제조에 기술되어있다. 가난한 유화가 possib로 간주되는 경우 등 1 시간 또는 초음파에 대한 소용돌이로 교반 등의 다른 방법이 고려 될 수있다르 오류 소스.

- 나이, 성별, 연도와 동물 시설 내 환경 조건의 계절 EAE의 감수성에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 이 조건이 독립적 인 실험과 비교할 수 있는지를 확인해야한다.

전술 한 바와 같이, 상기 프로토콜은 양자 EAE 실험 시작점으로 사용될 수있다. 이 모델은 특히 (야생형받는 마우스에 encephalitogenic 녹아웃 세포를 전송하여 예) 유전자 표현형의 말초 및 중추 신경계 효과를 분리하여 전송 세포의 표현형 철저 특징으로 할 수와 같은 특정 면역 질문에 적합합니다. 지난 몇 년 동안 EAE 연구의 최신 개발은 T 세포 수용체 유전자 변형 마우스입니다. 이 마우스는 외부 영향이 도움이되는 예방 접종의 문제를 회피하지 않고 자발적으로 EAE 증상을 개발할 수 있습니다. 그러나,이 모델은 breedi 위해 동물의 대용량을 필요충분한 그룹의 크기를 확인하기 위해 겨. 녹아웃 마우스의 평가는 이전 aEAE 달리 EAE 실험에 이종 교배가 필요합니다. 각 마우스가 다른 날에 질병의 증상을 개발로, 새로운 물질의 평가는 다소 복잡 할 수 있습니다. 따라서 neuroimmunological에 대한 고전적인 aEAE의 값은 도전받지 않은 남아있다.

Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

이 작품은 임상 연구를위한 학제​​ 간 센터 (IZKF) 뮌스터 (SEED 3월 12일, SB)에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight e.g. Jackson Laboratory, Charles River
MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) e.g. Pepceuticals Ltd Store at -20 °C
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Sigma-Aldrich Co. F5506 Store at 4 °C
Syringes, 1 ml with 26 G 3/8 in needle  e.g. Becton Dickinson & Co. 309625
Syringes, 2 ml e.g. B. Braun 7389
Needles, 25 G 5/8 in and 30 G 1/2 in  e.g. Becton Dickinson & Co., 305122, 305106
Three way valve e.g. B. Braun 16494 C
Pertussis toxin, lyophilized in buffer Enzo Life Sciences Inc. BML-G100 Store at 4 °C
M. tuberculosis H37 RA BD Difco 231141 Store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat. Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Wiendl, H. Neuroinflammation: the world is not enough. Curr. Opin. Neurol. 25, 302-305 (2012).
  3. vander Star, B. J., et al. In vitro and in vivo models of multiple sclerosis. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 11, 570-588 (2012).
  4. Pachner, A. R. Experimental models of multiple sclerosis. Curr. Opin. Neurol. 24, 291-299 (2011).
  5. Bittner, S., et al. The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis. Exp. Neurol. 238, 149-155 (2012).
  6. Handel, A. E., Lincoln, M. R., Ramagopalan, S. V. Of mice and men: experimental autoimmune encephalitis and multiple sclerosis. Eur. J. Clin. Invest. 41, 1254-1258 (2011).
  7. Krishnamoorthy, G., Wekerle, H. EAE: an immunologist's magic eye. Eur. J. Immunol. 39, 2031-2035 (2009).
  8. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat. Protoc. 1, 1810-1819 (2006).
  9. Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin. Exp. Immunol. 162, 1-11 (2010).
  10. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur. J. Immunol. 25, 1951-1959 (1995).
  11. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J. Immunol. 169, 117-125 (2002).

Comments

5 Comments

  1. Dear Authors - you describe various conditions that contribute to a less than adequate disease response. But, do you have experience with conditions that create an exaggerated response in C57/Blk6 Jax, that result in animals dieing due to severe neurologic signs, rather than stabilizing and recovering as your discussion describes? For the past year, we have been struggling with a model that "used to work" at Harvard, but since moving to the National Cancer Institute, the model fails in that the previously resistant Tbet-/- (Tbx21) mice now develop EAE and both they and the Blk6 proceed to death. We have ruled out/excluded pathogens/commensals (segmented filamentous bacteria, Helicobacter, and norovirus), we have tried to emulate the same husbandry conditions as Harvard (using sterile micro-isolator caging, acidified water, even switching to a different diet)- but to no avail. Do you have any suggestions?

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 24, 2016 - 12:32 PM
  2. Dear Melody,
    these are rather strange experiences and my guess would be that there is a General Problem which renders your mice so over-succeptible to EAE. These changes are not so uncommon and can be rather tricky to solve. My advice would be to:
    - Try a delivery of your mice to another animal Provider (in europe we would for example choose Harlan or Janvier instead)
    - Try another animal housing facility at your University if available - the specific Environment can result in tremendous differences (even if there are no pathogens), People Report that regularly. The microbiome is suspected to be responsible for that while there are no specific tests for that.
    - Of course reduce amount of MOG (100 µg or lower)
    Hope that helps and good luck!
    Best, Stefan

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 25, 2016 - 9:16 AM
  3. Stefan- Thank you for your response. The investigator was using 100ug MOG and dropped it to 50ug, but this has not changed the profiles. We have done replicate studies in different facilities - same problem. Yesterday I found the following intriguing comments on the commercial Hooke EAE CRO site - they stated that you must titrate the pertussis dose for each lab, and if EAE is too severe, lower the dose (see below). Have you ever heard of this before? Does this sound reasonable? If you could give me your email, I can send you some of our mean clinical score graphs and you will see our problem. Here is their web site.
    http://www.hookelabs.com/protocols/eaeAI_C57BL6.html
    "Titration for optimal dosage of pertussis toxin. We strongly recommend that new customers establish the optimal PTX dose by inducing EAE in 10 mice in their own lab. The optimal PTX dose needed to obtain good EAE is typically 100 to 250 ng/mouse for each of the two PTX administrations. Larger doses of PTX are needed if mice experience higher levels of stress. The dose required decreases with mouse age. Even with identical mice and reagents, the PTX dose required varies from lab to lab. Finally, PTX potency varies from lot to lot; this affects the required dose. Hooke tests each lot of PTX in mice; the dilutions recommended in this protocol are the result of our testing.
    To determine the best PTX dose for the lab conditions, adjust PTX concentration to 4 µg/mL; this gives 400 ng PTX in each 0.1 mL dose (6000/1.5*0.1). Immunize 10 mice. Score mice daily starting 7 days after immunization, continuing until 28 days after immunization. (See Appendix A - EAE scoring guide.)

    If EAE is too severe, reduce PTX concentration to ~2.8 – 3.4 µg/mL (280 to 340 ng PTX/dose).
    If EAE is too mild, a higher dose of PTX is required;

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 25, 2016 - 12:03 PM
  4. My email is stefan.bittner@unimedizin-Mainz.de, you can reply directly there.
    I know Hooke kits and to our experience there is no obvious Change compared to self-made Solutions (for some People they work a bit better, for others not) - the main reason why we are not working with them routinously are Price + no flexibility in MOG/CFA composition.
    Pertussis: We never had Problems there and are not doing the testing (perhaps we are just lucky that our ptx is quite stable from Batch to Batch), but i know that other labs are doing the Titration as described by you and it might be a good Point for Trouble-Shooting!

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 27, 2016 - 6:20 AM
  5. Dear Stefan,

    I am trying to induce EAE in a B6/129 mixed background strain of mice. I wonder would the same protocol work?
    Thanks,

    Donghai

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 1, 2016 - 6:41 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics