Myéline Oligodendrocyte glycoprotéine (MOG

Immunology and Infection
 

Summary

Encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal établi de la sclérose en plaques. Souris C57BL / 6 sont immunisées avec la myéline oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), entraînant une paralysie flasque ascendante causée par des cellules immunitaires auto-réactifs dans le système nerveux central. Protocoles pour l'induction et la surveillance des maladies seront discutés.

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Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (86), e51275, doi:10.3791/51275 (2014).

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Abstract

La sclérose en plaques est une maladie neuro-inflammatoire démyélinisante chronique du système nerveux central avec une forte composante neurodégénérative. Bien que l'étiologie exacte de la maladie est encore peu claire, les lymphocytes T auto-réactifs sont supposés jouer un rôle central dans sa physiopathologie. Traitement de la SP n'est que partiellement efficace à ce jour et les efforts de recherche de continuer à développer nos connaissances sur la physiopathologie de la maladie et de développer de nouvelles stratégies de traitement. Encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal le plus commun pour MS partage de nombreuses caractéristiques cliniques et physiopathologiques. Il ya une grande diversité de modèles EAE qui reflètent différents aspects cliniques, immunologiques et histologiques de MS humaines. EAE activement induite chez la souris est le modèle inductible plus facile avec des résultats robustes et reproductibles. Il est particulièrement adapté pour étudier les effets des médicaments ou de gènes particuliers en utilisant des souris transgéniques contestées par neuroi auto-immunenflammation. Par conséquent, les souris sont immunisées avec des homogénats du système nerveux central ou des peptides de protéines de la myéline. En raison du faible potentiel immunogène de ces peptides, des adjuvants puissants sont utilisés. EAE sensibilité et phénotype dépend de l'antigène choisi et de la souche de rongeur. Souris C57BL / 6 sont la souche utilisée pour la construction de souris transgéniques et de répondre entre autres à la myéline oligodendrocyte glycoprotein (MOG). L'épitope immunogène MOG 35-55 est mis en suspension dans de l'adjuvant complet de Freund (CFA) avant l'immunisation et la toxine pertussis est appliqué sur le jour de la vaccination et deux jours plus tard. Souris développent une EAE monophasique auto-limitée "classique" avec paralysie flasque ascendante dans 9-14 jours après la vaccination. Les souris sont évalués quotidiennement en utilisant un système de notation clinique pour 25-50 jours. Considérations particulières pour la prise de soin des animaux avec EAE ainsi que les applications et les limites potentielles de ce modèle sont discutées.

Introduction

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire démyélinisante chronique du système nerveux central, dans lequel la destruction des neurones et des oligodendrocytes conduit à des symptômes cliniques hétérogènes et d'accumulation. MS est considérée comme une maladie auto-immune prototype du système nerveux central (SNC) et des modèles animaux ont été développés pour faire la lumière sur sa pathogénie complexe. En outre, les traitements actuels ne sont que partiellement efficaces et visent principalement la phase inflammatoire de la maladie tandis que la composante neurodégénérative est probablement le principal défi pour l'avenir thérapeutique des approches 1,2.

Bien que l'étiologie exacte de la maladie est encore peu clair, une réaction auto-immune contre des épitopes sur la gaine de myéline des axones dans le SNC est supposée provoquer l'apparition de la maladie. Le dérèglement du système immunitaire, la vulnérabilité génétique et des facteurs environnementaux (par exemple, les infections, la vitamine D) sont soupçonnés d'aspects centraux de l'influence des mécanismes physiopathologiques de la SEP.

Trois types de modèles animaux différents sont actuellement mis en place pour l'exploration de modèles pathologiques de MS: modèles viraux comme le virus de l'encéphalomyélite murine de Theiler (TMEV), les modèles induits par des agents toxiques comme cuprizone, et enfin les différentes variantes de l'encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) 3, 4. Bien que tous imitent fonctionnalités de MS, ils diffèrent énormément dans les caractéristiques pathologiques sous-jacents tels que l'implication du système immunitaire adaptatif. EAE est le modèle animal le plus commun, car elle est particulièrement utile pour étudier les voies neuro-inflammatoires et sert souvent de modèle "preuve de principe" pour l'efficacité de nouvelles stratégies de traitement 5,6. EAE peut être induite chez de nombreux animaux différents (par exemple, les souris, les rats, miniswine, cochons d'Inde, des poulets, ou de primates). Cependant, les souris sont devenues les espèces les plus largement utiliser ce qui est au moins en partie en raisond'élargir le répertoire de transgéniques sophistiquées ou des souris knock-out 7.

La physiopathologie de l'EAE est basé sur la réaction du système immunitaire contre des antigènes spécifiques de cerveau. Cette réaction provoque l'inflammation et la destruction des structures conductrices de l'antigène, ce qui entraîne des caractéristiques neurologiques et pathologiques comparables qui celles observées chez des patients atteints de SEP. Trois approches différentes peuvent être distinguées: EAE activement induite (æÆ; immunisation active), transmis passivement EAE (peae, le transfert de cellules encéphalitogènes d'un animal immunisé), et les modèles plus récemment spontanées EAE de souris (SEAE), qui permet l'étude des auto-immune mécanismes sans manipulation exogène. Le plus simple modèle inductible est æÆ chez les souris produisant des résultats rapides et robustes. Ce modèle est considéré comme le «gold standard» de modèles animaux neuroimmunologiques par de nombreux chercheurs dans le domaine 8.

Pour æÆ induction, l'animalest immunisé avec une injection sous-cutanée d'une émulsion comprenant de l'antigène choisi et les remplir des adjuvants de Freund (CFA), accompagnés par une injection intrapéritonéale de toxine de la coqueluche, le jour de la vaccination et deux jours plus tard. Par conséquent, les lymphocytes T spécifiques de la myéline sont activés dans la périphérie et migrent dans le SNC à travers la barrière sang-cerveau-barrière. Lors de l'entrée dans le système nerveux central, les cellules T sont réactivés par des cellules présentatrices d'antigène et d'infiltration locale résultant en subséquente cascades inflammatoires, l'implication d'autres cellules telles que les monocytes ou les macrophages et par la suite dans la démyélinisation et la mort cellulaire axonal 9. En fonction du protocole d'immunisation et de combinaison de souche de souris (par exemple, des souris C57BL / 6, SJL / J, Biozzi) et d'antigène (par exemple la myéline oligodendrocyte glycoprotein (MOG), la protéine basique de la myéline (MBP), la myéline protéine protéolipidique (PLP)), la maladie cours peut suivre un cours aiguë, chronique progressive ou récurrente maladie de versement.

35-55 peptide 10 qui se traduit par une EAE monophasique avec des premiers symptômes après 9-14 jours, au maximum de la maladie environ 3-5 jours après l'apparition de la maladie et la récupération lente et partielle symptôme au cours des 10-20 prochains jours. Comme le potentiel immunogène de peptide MOG 35-55 seule n'est pas suffisante pour induire la maladie, des adjuvants tels que CFA sont nécessaires. On suppose que les composantes du CFA activer des phagocytes mononucléaires induisant la phagocytose de ces molécules et la sécrétion de cytokines. Il en résulte dans le prolongement de la présence d'antigènes et un transport plus efficace de celles-ci au système lymphatique. EAE induction est facilitée par l'application de la toxine de pertussis (PT) qui a entre autres été proposé de modulerla barrière hémato-encéphalique et la réactivité immunologique se 11. Après l'induction de la maladie, une attention particulière doit être prise pour l'évaluation quotidienne de la souris pour les symptômes de la maladie.

Protocol

1. Observations générales pour l'expérimentation de souris

  1. Toutes les expériences utilisant des souris doivent être effectués en conformité avec les directives du comité de protection des animaux et l'utilisation respective.
  2. Gardez les souris dans des conditions exemptes d'agents pathogènes et leur permettre d'avoir accès à la nourriture et de l'eau ad libitum. Remarque: Il est important d'utiliser l'âge et du sexe des souris assortie dans les groupes expérimentaux, car la susceptibilité à la maladie peut varier avec l'âge et le sexe.
  3. Selon les conditions expérimentales choisies, un groupe témoin fictif immunisé peut être considéré où MOG 35-55 peptide est remplacé par PBS sans antigène ou un peptide nonencephalitogenic.
  4. S'il vous plaît examiner les aspects méthodologiques avant des expériences de départ (voir également ci-dessous). Nous vous recommandons d'associer un ou deux observateurs indépendants pour EAE notation.

2. Préparation de MOG 35-55 Emulsion

  1. 200 ul d'un rapport 1:1 de MOG 35-55 solution de peptide et CFA doit être injecté à chaque souris. Il ya une certaine perte de l'émulsion visqueuse lors de la préparation et l'injection. Par conséquent, préparer 1,5-2x de la quantité nécessaire. Calculer le volume total de l'émulsion et de diviser par 2 pour les montants nécessaires à la fois solution MOG 35-55 peptide et CFA.
  2. Diluer MOG 35-55 lyophilisée dans le trou DDH 2 O à une concentration finale de 2 mg / ml. Nous utilisons habituellement 200 pg MOG 35-55 peptide par la souris. Ce montant est contenu dans 100 ul de la solution mère. La solution de peptide doit être conservé à -20 ° C.
  3. Placer le contenu du flacon de 1 desséchée par Mycobacterium tuberculosis H37Ra (100 mg) dans un mortier.
    1. Rez-de mortier et un pilon pour obtenir une poudre fine.
    2. Ajouter 10 ml des adjuvants de Freund incomplet pour obtenir une solution mère à 10 mg / ml CFA qui peut être conservé à 4 ° C.
    3. Avant la vaccination, diluer CFA solution stock d'esprith IFA à une concentration finale de 2 mg / ml. Bien mélanger avant chaque utilisation pour remettre en suspension la matière particulaire et envisager une perte de volume de la solution visqueuse pendant les préparations expérimentales.
    4. Mélanger 1:1 avec MOG 35-55 solution peptidique jusqu'à ce que la concentration finale de 1 mg / ml est atteinte.
      ATTENTION: Mycobacterium tuberculosis tué par la chaleur stimule la réponse immunitaire innée. Éviter l'inhalation, l'ingestion et contact avec la peau et les yeux.
  4. Prérefroidir solutions sur la glace.
    1. Dresser 1 ml de 2 mg / ml CFA et 1 ml de 2 mg / ml solution MOG 35-55 en deux seringues de 2 ml. Calculer le nombre de seringues nécessaires en fonction du nombre d'animaux immunisés.
      ATTENTION: Strictement éviter couture lors de la préparation de l'adjuvant car il peut causer des granulomes ou induire des réactions auto-immunes.
    2. Utilisez une canule 27 G pour la solution 35-55 MOG et une canule 20 G pour CFA. Éviter les bulles d'air et connecter les deux seringues avec auhree-way-valve.
    3. Envoyer l'émulsion d'une seringue à l'autre et bien mélanger pendant au moins 10 min en tant que bonne émulsification est une étape critique. Proche-fermer le three-way-valve pour soutenir émulsification. La solution doit être blanc, rigide et visqueuse sans séparation de phases.
    4. Émulsion peut être stockée pendant plusieurs jours avant immunisation. Attendez au moins 30 minutes après la préparation des émulsions d'observer si elles sont stables. Avant la vaccination, aspirer la solution dans l'une des deux seringues et connecter un G canule 27.

3. Préparation de la toxine coquelucheuse

  1. Différentes quantités de toxine de pertussis peut être trouvé dans la littérature, qui dépend également de la voie d'administration (par exemple par voie intraveineuse ou intra-péritonéale). Notre laboratoire utilise 400 ng de toxine de la coqueluche dans 200 ul de PBS par voie intrapéritonéale au jour de l'immunisation et deux jours plus tard. ATTENTION: toxine coqueluche a de nombreux effets biologiques. Éviter l'inhalation, l'ingestion et contact avec la peau et les yeux.
  2. Reconstituer 50 pg de toxine de la coqueluche dans 500 ul ddH 2 O pour une solution stock de 100 pg / ml. Stocker à 4 ° C.
  3. Diluer avec du PBS 01 heures 50. 200 pi contiennent maintenant 400 ng de PBS. Préparer la quantité nécessaire de seringues et d'envisager un excédent de volume supplémentaire de ~ 100 pi pour chaque moyeu de l'aiguille.

4. L'immunisation des animaux

  1. S'il vous plaît se référer au comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle des critères spécifiques pour l'euthanasie nécessaire à court terme. Notre laboratoire utilise brève narcotisation avec de l'isoflurane tandis que d'autres protocoles tels que l'injection de kétamine / xylazine ou halothan peuvent également être possible. Attendez que l'anesthésie et d'utiliser un pied pincement de l'orteil avant d'évaluer le niveau de l'anesthésie.
  2. Assurez-vous que la vaccination est effectuée par une personne expérimentée pour minimiser le stress pour les animaux et pour assurer l'immunisation optimale.
  3. Injecter 100 pi de lutte contregen / CFA émulsion sous-cutanée dans deux sites différents sur chaque flanc arrière. Assurez-vous que un bulbe formes de masse sous la peau qui devraient persister tout au long de l'expérience.
  4. Injecter 200 ul de la toxine de pertussis intraperitonelly.
  5. Veiller à ce que chaque souris peuvent facilement être identifiés pour l'évaluation quotidienne, par exemple par un marquage de couleur sur la base de la queue.
  6. Administrer une deuxième dose de la toxine pertussis sur deux jours après la vaccination.

5. Surveillance de l'EAE

  1. Poids et score clinique doivent être évalués tous les jours. L'apparition de l'EAE normalement une corrélation avec la perte de poids, qui peut être utilisé comme un indicateur d'activité de la maladie. S'il vous plaît se référer à la protection des animaux et utiliser comité de prédéfinir des critères lorsque les souris individuelles doivent être prises sur les expériences. Ce doit être envisagée lorsque la perte de poids supérieure à 20% du poids corporel initial ou lorsque des signes cliniques sévères (EAE score 7 ou pire) se produisent. S'il vous plaît se référer à la redirectives respectifs de la protection des animaux et l'utilisation comité respectif pour les valeurs maximales autorisées.
  2. Lorsque les souris ont des symptômes cliniques de l'EAE, il est important de s'assurer que la bouteille d'eau peut encore être atteint et que la nourriture est placée sur le sol de la cage.
  3. Symptômes de notation différents peuvent être utilisés. Dans notre laboratoire, une échelle de 0-10 est établi.
Grade Signe clinique Commentaire
0 Aucun signe clinique Démarche normale, queue se déplace et peut être soulevé, la queue s'enroule autour d'un objet rond si la souris est maintenu à la base de la queue
1 Queue partiellement mou Démarche normale, bout de la queue pend
2 Queue paralysé Démarche normale, queue tombante
3 Parésie des membres postérieurs, mouvement non coordonné Démarche non coordonnée, queue boite, membres postérieurs répondre à pincer
4 Un membre postérieur paralysé Démarche non coordonnée avec l'un des membres postérieurs traîner, queue boite, un membre postérieur ne répond pas à pincer
5 Les deux membres postérieurs paralysés Démarche non coordonnée avec les deux membres postérieurs traînant, queue boite, les deux membres postérieurs ne répondent pas à pincer
6 Paralysie des membres postérieurs, la faiblesse dans les membres antérieurs Démarche non coordonnée avec les membres antérieurs du mal à tirer corps, membres antérieurs réflexe après le pincement, la queue boite
7 Paralysie des membres postérieurs, un membre antérieur paralysé Souris ne peut pas se déplacer, un membre antérieur répond à pincement de l'orteil, la queue boite
8 Paralysie des membres postérieurs, les deux pattes avant paralysées Souris ne peut pas se déplacer, les deux pattes avant ne répondent pas à pincement de l'orteil, la queue boite
9 Moribond Aucun mouvement, la respiration altérée
10 Décès

Tableau 1. Du système de notation clinique.

Representative Results

Après immunisation, les souris doivent être évalués quotidiennement pendant les changements de poids et les symptômes cliniques. l'apparition de la maladie est généralement corrélé avec une réduction de poids qui pourrait commencer 1-2 jours avant que les symptômes EAE sont visibles. Les signes cliniques de l'EAE commencent généralement entre 9 et 14 jours après la vaccination. Comme les lésions sont principalement localisées dans la moelle épinière dans MOG-EAE dans C57BL / 6, ils développent généralement des symptômes principalement motrices dans un caudale à motif rostrale. Un exemple d'image d'une souris immunisée avec des symptômes d'EAE (score 6) est représentée sur la figure 1A. Certains symptômes EAE atypiques pourraient également survenir tels que rouler de manière axiale-rotation, l'apparence ou hypersensibilité voûté qui ne sont pas reflétés dans le EAE classique score représentés dans le tableau 1. Comme les symptômes moteurs sont la caractéristique principale de ce modèle, ce score ne nous donnent une bonne indication de la gravité de la maladie. Différents systèmes de surveillance (par exemple score à 0 -5 ou 0-6) et plus de scores composites complexes à évaluer différents déficits ont également été publiés. S'il vous plaît noter que les souris présentant des symptômes graves doivent être prises hors de l'expérience selon le comité de protection des animaux et l'utilisation respective. Souris montrent généralement la récupération partielle des symptômes au cours des 10-20 prochains jours. Une évolution de la maladie représentant est représenté sur la figure 1B. Il existe différents points dans le temps au cours de l'EAE qui présentent un intérêt pour l'évaluation des paramètres de résultats. Certains essais typiques qui peuvent souvent être trouvées sont décrits très brièvement. Au maximum de la maladie, les souris peuvent être évalués pour la production de cytokines ou la prolifération après re-stimulation des cellules immunitaires isolées avec MOG 35-55 peptide in vitro (dosage de rappel de MOG). Les cellules immunitaires peuvent également être isolés à partir du cerveau et de la moelle épinière provenant de souris EAE avec des symptômes et traitées ultérieurement, par exemple par cytométrie en flux. L'analyse histologique de coupes de la moelle épinière peut être effectuée à la maladie mAximum pour la charge de la lésion et de la démyélinisation, tout à l'heure plus tard les points marqueurs pour la neurodégénérescence et la mort des cellules neuronales pourrait être d'intérêt.

Figure 1
Figure 1. Résultats Représentant EAE. A. image représentative d'une vaccinés souris C57BL / 6 avec des symptômes EAE (EAE Note 6). Cours de la maladie B. Représentant après la vaccination de plus de 30 jours. Les données sont présentées sous forme de moyenne et écart-type de la moyenne (n = 5). Cliquez ici pour agrandir l'image .

Discussion

Une multitude de différents modèles de EAE avec des protocoles d'immunisation active a été décrite au cours des dernières décennies. Alors que les modèles de rats ont été largement utilisés jusqu'à récemment, les souris sont maintenant l'organisme modèle le plus populaire pour la recherche EAE. Cette évolution est notamment due au répertoire large et de plus en plus de souris transgéniques disponibles. L'immunisation de souris C57BL / 6 avec MOG 35-55 peptide est l'un des modèles les plus largement distribués EAE et peut être considéré comme un modèle animal du puits à usage fiable, reproductible et. Dans de nombreux laboratoires neuroimmunologiques, MOG 35-55 EAE induite est établi comme le modèle de choix tandis que d'autres modèles EAE sont utilisés pour des questions plus spécifiques expérimentales.

Un point essentiel à considérer est la planification des paramètres expérimentaux pour s'assurer que les expériences EAE sont effectuées méthodologiquement correcte. Pour la validité interne, la notation en aveugle des symptômes de la maladie est fortement recommandée. Experiencesgroupes imental devraient être l'âge, le poids, le sexe et appariés et souris doivent être répartis de façon aléatoire à des groupes de traitement. Les expériences doivent toujours être effectuées en conformité avec la réglementation de protection des animaux. Études EAE sont souvent de faible puissance et ne prennent pas en compte les erreurs statistiques de type II. Par conséquent, avant d'expériences, calcul de la taille de l'échantillon doivent être effectués. La taille des groupes nécessaires dépendent de la taille de l'effet attendu. Consultation d'un expert pour l'analyse statistique pourrait être considéré avant de commencer les expériences EAE.

Certaines limitations du protocole doivent être gardés à l'esprit. Plus important encore, l'interprétation des données aeae est compromise par le mode d'immunisation avec l'utilisation de l'adjuvant et de la toxine pertussis qui ont à la fois une influence supplémentaire sur la réaction immunologique. Il convient également de considérer que le modèle MOG 35-55 EAE montre principalement une cellule T CD4 + conduit réponse immunologique. Cellules T CD8 + et les cellules B jouentun rôle moins important et d'autres protocoles doivent être considérés lors aborder ces types cellulaires. L'évolution de la maladie est aiguë attendue, monophasique et auto-limitée. Alternativement, une évolution de la maladie récurrente-rémittente peut également être réalisée dans des modèles EAE alternatives. Une autre limite importante de ce protocole est d'une certaine préférence pour la composante immunologique de la physiopathologie MS. Au cours des dernières années, il est devenu de plus en plus clair que MS a une forte composante neurodégénérative. La mort des oligodendrocytes et neurones entraîne une accumulation progressive des déficits neurologiques. Il doit être pris en compte que le modèle EAE peut ne pas être entièrement adapté pour répondre aux questions d'expérimentation concernant les mécanismes de neurodégénératives de l'inflammation auto-immune. Modèles animaux de substitution avec un accent sur ​​la pathologie du système nerveux central peuvent être considérées comme - par exemple le modèle de cuprizone qui compromet démyélinisation toxique sans implication du système immunitaire périphérique.

Le protocole décrit à être considéré comme un modèle expérimental neuroimmunological de base et peut être modifiée pour d'autres applications. La procédure expérimentale décrite ci-dessus peut être facilement appliquée à d'autres protocoles EAE par différentes souches de souris ou le type et la quantité de protéines (par exemple, utiliser PLP 139-151 peptide et souris SJL pour une évolution de la maladie EAE récurrente-rémittente qui est particulièrement adapté pour l'évaluation thérapeutique effets sur les rechutes). Le protocole décrit peut également être utilisé pour des expériences de transfert adoptif-EAE (passive). Dans ce modèle, les souris C57BL / 6 sont immunisées avec le peptide MOG 35-55 et CFA comme décrit ci-dessus. En revanche, la toxine de pertussis n'est pas nécessaire. Après 7-15 jours, les rates ou de ganglions lymphatiques sont isolées et les cellules immunitaires sont restimulées in vitro avec le peptide MOG 35-55 et diverses cytokines avant le transfert dans un nouveau groupe de souris C57BL/6se. Ces souris receveuses développer EAE quelques jours plus tôt que sur clasvaccination sique. Dans des conditions in vitro peuvent être modifiés pour des questions immunologiques spécifiques (par exemple, la polarisation en T H 1 ou T H 17 cellules).

Parfois, l'incidence de la maladie est faible ou symptômes faibles pourraient être un défi expérimental. Quelques recommandations pour le dépannage sont:

- Gravité de la maladie peut varier avec différentes quantités de peptide / souris.

- Concentration optimale CFA peut varier de 1 à 5 mg / ml. Considérons un titrage de CFA lors de l'établissement des expériences. S'il vous plaît se référer aux lignes directrices respectives de la protection des animaux et l'utilisation comité respectif pour des concentrations CFA admis que de nombreux règlements interdisent concentrations dépassant CFA 2 mg / ml.

- Différentes méthodes sont décrites pour la préparation de l'émulsion. Des méthodes alternatives comme vortex pendant 1 heure ou ultrasons pourraient être envisagées si mauvaise émulsification est considéré comme possibSource d'erreur LE.

- Âge, le sexe, la saison de l'année et les conditions environnementales au sein de l'animalerie sont des facteurs importants qui influent sur la sensibilité EAE. Il convient de s'assurer que les conditions sont comparables entre les expériences indépendantes.

Comme décrit ci-dessus, le protocole mentionné peut être utilisé comme point de départ pour des expériences EAE adoptifs. Ce modèle est particulièrement adapté pour séparer les effets périphériques du système nerveux central et d'un phénotype génétique (par exemple par le transfert de cellules knock-out encéphalitogènes dans des souris receveuses de type sauvage) et pour des questions immunologiques spécifiques que le phénotype des cellules transférées peut être caractérisé en profondeur. Le dernier développement dans la recherche EAE au cours des dernières années sont des récepteurs de cellules T de souris transgéniques. Ces souris développent des symptômes EAE spontanément, sans influence extérieure contourner le problème de l'adjuvant inoculation. Cependant, ce modèle nécessite de grandes quantités d'animaux pour breeding à assurer la taille des groupes suffisantes. Évaluation des souris knock-out nécessite croisement avant expériences EAE contrairement à æÆ. Comme chaque souris développe des symptômes de la maladie à un jour différent, l'évaluation de nouvelles substances peut être assez compliqué. Par conséquent, la valeur de æÆ classique pour neuroimmunological demeure incontestée.

Disclosures

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le Centre interdisciplinaire pour la recherche clinique (IZKF) Münster (de la graine 03/12, SB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight e.g. Jackson Laboratory, Charles River
MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) e.g. Pepceuticals Ltd Store at -20 °C
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Sigma-Aldrich Co. F5506 Store at 4 °C
Syringes, 1 ml with 26 G 3/8 in needle  e.g. Becton Dickinson & Co. 309625
Syringes, 2 ml e.g. B. Braun 7389
Needles, 25 G 5/8 in and 30 G 1/2 in  e.g. Becton Dickinson & Co., 305122, 305106
Three way valve e.g. B. Braun 16494 C
Pertussis toxin, lyophilized in buffer Enzo Life Sciences Inc. BML-G100 Store at 4 °C
M. tuberculosis H37 RA BD Difco 231141 Store at 4 °C

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References

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Comments

5 Comments

  1. Dear Authors - you describe various conditions that contribute to a less than adequate disease response. But, do you have experience with conditions that create an exaggerated response in C57/Blk6 Jax, that result in animals dieing due to severe neurologic signs, rather than stabilizing and recovering as your discussion describes? For the past year, we have been struggling with a model that "used to work" at Harvard, but since moving to the National Cancer Institute, the model fails in that the previously resistant Tbet-/- (Tbx21) mice now develop EAE and both they and the Blk6 proceed to death. We have ruled out/excluded pathogens/commensals (segmented filamentous bacteria, Helicobacter, and norovirus), we have tried to emulate the same husbandry conditions as Harvard (using sterile micro-isolator caging, acidified water, even switching to a different diet)- but to no avail. Do you have any suggestions?

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 24, 2016 - 12:32 PM
  2. Dear Melody,
    these are rather strange experiences and my guess would be that there is a General Problem which renders your mice so over-succeptible to EAE. These changes are not so uncommon and can be rather tricky to solve. My advice would be to:
    - Try a delivery of your mice to another animal Provider (in europe we would for example choose Harlan or Janvier instead)
    - Try another animal housing facility at your University if available - the specific Environment can result in tremendous differences (even if there are no pathogens), People Report that regularly. The microbiome is suspected to be responsible for that while there are no specific tests for that.
    - Of course reduce amount of MOG (100 µg or lower)
    Hope that helps and good luck!
    Best, Stefan

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 25, 2016 - 9:16 AM
  3. Stefan- Thank you for your response. The investigator was using 100ug MOG and dropped it to 50ug, but this has not changed the profiles. We have done replicate studies in different facilities - same problem. Yesterday I found the following intriguing comments on the commercial Hooke EAE CRO site - they stated that you must titrate the pertussis dose for each lab, and if EAE is too severe, lower the dose (see below). Have you ever heard of this before? Does this sound reasonable? If you could give me your email, I can send you some of our mean clinical score graphs and you will see our problem. Here is their web site.
    http://www.hookelabs.com/protocols/eaeAI_C57BL6.html
    "Titration for optimal dosage of pertussis toxin. We strongly recommend that new customers establish the optimal PTX dose by inducing EAE in 10 mice in their own lab. The optimal PTX dose needed to obtain good EAE is typically 100 to 250 ng/mouse for each of the two PTX administrations. Larger doses of PTX are needed if mice experience higher levels of stress. The dose required decreases with mouse age. Even with identical mice and reagents, the PTX dose required varies from lab to lab. Finally, PTX potency varies from lot to lot; this affects the required dose. Hooke tests each lot of PTX in mice; the dilutions recommended in this protocol are the result of our testing.
    To determine the best PTX dose for the lab conditions, adjust PTX concentration to 4 µg/mL; this gives 400 ng PTX in each 0.1 mL dose (6000/1.5*0.1). Immunize 10 mice. Score mice daily starting 7 days after immunization, continuing until 28 days after immunization. (See Appendix A - EAE scoring guide.)

    If EAE is too severe, reduce PTX concentration to ~2.8 – 3.4 µg/mL (280 to 340 ng PTX/dose).
    If EAE is too mild, a higher dose of PTX is required;

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 25, 2016 - 12:03 PM
  4. My email is stefan.bittner@unimedizin-Mainz.de, you can reply directly there.
    I know Hooke kits and to our experience there is no obvious Change compared to self-made Solutions (for some People they work a bit better, for others not) - the main reason why we are not working with them routinously are Price + no flexibility in MOG/CFA composition.
    Pertussis: We never had Problems there and are not doing the testing (perhaps we are just lucky that our ptx is quite stable from Batch to Batch), but i know that other labs are doing the Titration as described by you and it might be a good Point for Trouble-Shooting!

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 27, 2016 - 6:20 AM
  5. Dear Stefan,

    I am trying to induce EAE in a B6/129 mixed background strain of mice. I wonder would the same protocol work?
    Thanks,

    Donghai

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 1, 2016 - 6:41 PM

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