神経組織再生のための可溶性および不溶性ビオチン化タンパク質の発現、分離、および精製

Bioengineering

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Summary

biotinylatable融合タンパク質を開発することは、研究の様々な分野で多くの潜在的な用途がある。組換えタンパク質工学は、カスタム設計されたタンパク質を高収率で提供する、費用対効果のある単純な手順である。

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McCormick, A. M., Jarmusik, N. A., Endrizzi, E. J., Leipzig, N. D. Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration. J. Vis. Exp. (83), e51295, doi:10.3791/51295 (2014).

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Abstract

組換えタンパク質工学は、 大腸菌(E.coli)発現ほぼ40年のためのシステム、今日Eを利用している大腸菌はまだ最も広く使用されている宿主生物である。システムの柔軟性は、(ストレプトアビジン相互作用のための)ビオチンタグなどの部分と緑色蛍光タンパク質またはチェリーレッドのタンパク質のような大きな機能性タンパク質を付加することができます。また、翻訳後修飾を付与する金属イオンキレート剤、一意的に反応性官能基、分光学的プローブ、および分子などの非天然アミノ酸の組込みは、タンパク質の特性及び機能のより良好な操作を可能にした。その結果、この技術は研究の様々な分野のための重要なユーティリティを提供し、カスタマイズ可能な融合タンパク質を作成します。具体的には、biotinylatableタンパク質配列が原因アビジンおよびストレプトアビジンとビオチンとの間の高親和性相互作用の多くの標的タンパク質に組み込まれている。この追加により、タグ付けされたタンパク質の検出および精製を強化するだけでなく、このような細胞選別などの二次アプリケーションのための道を開くことに支援しています。このように、ビオチン標識分子がbioindustrialおよび生物医学分野で増加し、広範な影響力を示している。本研究の目的のために、我々は、神経成長因子(NGF)およびsemaphorin3A(Sema3Aの)機​​能的領域を含む組換えビオチン化融合タンパク質を設計している。我々は、これらのビオチン化融合タンパク質は、他の活性なタンパク質配列と共に、組織工学および再生の目的のための生体材料に繋留することができる方法を以前に報告した。このプロトコルは、T7 LAC誘導ベクターおよびEを利用し、ミリグラム規模でエンジニアリングbiotinylatableタンパク質の基礎を概説形質転換からのスケールアップおよび精製を開始大腸菌発現宿主、。

Introduction

タンパク質は、最終的に適切な組織形成、組織を導く、多くの生物学的機能に関与している生体分子の広い範囲をカバーする。これらの分子は、人体内の均衡を維持し、規制アップ及び/またはダウンレギュレーション遺伝子および他のタンパク質を制御するシグナル伝達経路の数千を開始する。単一のタンパク質の破壊は、壊滅的な障害または疾患の発症につながることができた信号のこのウェブ全体に影響します。ラボで個々のタンパク質を設計することは、これらの悪影響に対処するための一つの解決策を提供しており、低分子薬物に代わるものを提供しています。 1977年には、14個のアミノ酸ソマトスタチン配列をコードする遺伝子は、E.を使用して作成された第一の操作されたポリペプチドの一つであった大腸菌 1。まもなく1979年の後、インスリンは、形質転換、プラスミドpBR322にクローニングし、発現させ、精製した2。それ以来、組換えタンパク質は、解像度の複数のフィールドに自分の影響力を拡大しているearch などの生体材料、ドラッグデリバリー、組織工学、バイオ医薬品、農業、産業用酵素、バイオ燃料として(レビューは参考文献3-8を参照してください)。これは、技術には、目的のために、化学的部分またはタンパク質配列の特定のアプリケーションの添加を介して提供し、これらに限定されないが、タンパク質同定、安定化および精製を標的とすることが汎用性によるところが大きい。

組換えDNA技術によって、組換えタンパク質は、哺乳動物、植物、昆虫、酵母、真菌、または細菌を含む真核生物および原核生物宿主系の種々の発現させることができる。各ホストは異なる利点を提供し、通常は最高のシステムは、タンパク質機能、収率、安定性、全体的なコスト、および拡張性に基づいて決定される。細菌細胞は、多くの場合、真核生物宿主( すなわちグリコシル化、ジスルフィドブリッジ、Eを提供する翻訳後修飾のメカニズムを欠いている TC。)5。しかしながら、これらのホストは、典型的にはより高価で時間のかかる09であり、その結果、哺乳動物および昆虫システムは、通常、真核生物のタンパク質のより良好な相溶性および発現をもたらす。従って、E.細胞は、安価な増殖条件および遺伝子発現機構において急速に拡大しているため、大腸菌は、よく理解されている5,9は、我々の発現システムのための好まれる宿主である。さらに、このシステムは、翻訳後修飾10の欠如にもかかわらず、機能的なタンパク質の生産を目的とし、その結果のためのスケールアップが容易である。 E.この株は、高い形質転換効率に基づいた優れたプラスミド収量を提供していますので、 大腸菌 K12株は、クローニングのために、このプロトコルで選択される。さらに、E.この宿主株は、制御されたタンパク質の発現および安定性11を提供するT7 RNAポリメラーゼ遺伝子が含まれているため、 大腸菌 BL21株は、発現のために利用される。

10トン ">ホスト選択後、さらなる注意が組換えタンパク質を合成することは、バクテリオファージT7転写および翻訳シグナルの指示の下でクローン化され、標的DNA配列で始まる。選択され、制御されたタンパク質の発現を促進するために理想的な発現ベクターを選択する際に注意しなければならず発現は、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子12の染色体コピーを含有する宿主細胞において誘導される。プラスミドベクターpBR322に由来するこれらのベクターは、(レビューのためには、13を参照する参照)、しっかりと最初にStudierら14によって開発されたT7プロモーターによって制御され、付加的に提供されているlacオペレーター 、およびlacプレッサー(LAC1)15,16の包含を介して制御組換えタンパク質工学では、この発現系は、異なる標的DNA配列を挿入することにより、所望のタンパク質の特定のアミノ酸配列を調整するまたは融合タンパク質を作成する機能を提供合わせたドメインから構成されるシングルタンパク質からのS。さらに、いくつかのベクターシリーズはN又はC末端上に配置するペプチドタグ修飾を含む。我々の設計のために、ヒスチジン(His)タグは、精製の ​​ためのDNA標的配列に加え、15個のアミノ酸配列は、ビオチン化biotinylatable 17,18のために含めた。このプロトコルでは、アンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドは、我々のbiotinylatable融合タンパク質配列を運ぶために選択した。発現はT7のlacプロモーターを介してこのベクター中に制御され、容易にイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導される。

テスト式(小スケールの培養物)を、精製手順のいずれかを処方するために可溶性または不溶性の形態で発現することができる標的タンパク質の存在および溶解度を決定するために使用される。細菌細胞内で発現される可溶性タンパク質は、その天然の構造体19を維持するために自発的なフォールディングを受けることになる。通常、ネイティブ構造は熱力学的に有利である。多くの場合、宿主の代謝活性は、不溶性タンパク質産生および不溶性タンパク質凝集体からなる封入体の形成をもたらすシステムにストレスを与え、標的タンパク質に資するものである。従って、標的タンパク質は20生物学的に不活性な、一般的にそれらをレンダリングする、変性させる。両方のテスト式は、アップスケーリングされ、および単離手順は、標的タンパク質の溶解度によって決定される。追加の再生またはリフォールディングステップは不溶性タンパク質のために必要である。得られた組換えタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製することができる。

家の中での組換えタンパク質産生は、標的タンパク質のミリグラム本培養のリットルあたり単離することができるので、市販品よりもコストの利点を提供する。必要な機器のほとんどは、一般的な生物学的または化学実験室で提供されています。タンパク質工学の作成を可能に常に市販されていない追加された機能を持つカスタムの融合タンパク質の。 図1は、組換えタンパク質を工学に関わる主な手順を示している。この発現系では、我々は、インターフェロン-γ、血小板由来増殖因子、および骨形成タンパク質21〜23のような多くのbiotinylatableタンパク質を、作成しているが、我々は我々が軸索ガイダンス、NGF(29 kDaのために設計された二つのタンパク質に焦点を当てます)とのSema3A(91 kDa)の10(レビューのための基準24を参照)。ビオチン化はよく知られているビオチン-ストレプトアビジン相互作用利用して25-27標識タンパク質の同定、単離および固定化のための一般的な技術である。生物物理学的なプローブ28,29、バイオセンサ30と、量子ドット31は、10 27 -15 MのオーダーのK dで、ビオチン-ストレプトアビジン結合の高い親和性を利用するシステムのいくつかの例である。 E.大腸菌バイオスズリガーゼ、BirAをは、ビオチンタグの付いたシーケンス18,32内で見つかったリジン側鎖へのビオチンの共有結合を助ける。材料や生体分子へのテザリングビオチンは、複数の組織工学適用21,33-35用セルに成長因子の持続性送達を生産している。したがって、これらのカスタム設計biotinylatableタンパク質を設計することは複数の研究の利益を超越することができる強力なツールです。

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Protocol

1。標的タンパク質の設計

  1. バイオテクノロジー情報のウェブサイトのためのナショナルセンターを使用して(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)考慮対象種と任意のスプライスバリアントを取る目的のタンパク質のアミノ酸配列を得る。タンパク質の関心の活性領域に対応するアミノ酸配列を選択します。
    注:Sema3Aのために、アミノ酸21から747を選択した。融合タンパク質は、バルスター、アミノ酸1-90の配列は、NGFのアミノ酸122から241に添加したNGFを用いて設計した。
  2. 、Hisタグ(ENLYFQG)の除去のために、K(GLNDIFEAQKIEWHE)でのタンパク質のビオチン化のためのビオチンタグ付けされたシーケンスを6X-Hisの精製のためのタグ(HHHHHH)、タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ切断部位:N末端にフォロー·シーケンスを追加そして適切なタンパク質リフォールディング(EFPKPSTPPGSSGGAP)のための部屋を許可するギャップの可撓性のヒンジ。
    注:これらの配列は、所望の融合PROTによって異なる場合がありますEIN。
  3. 所望の宿主種及び合成のための遺伝子の設計/最適化のために企業への完全なアミノ酸配列を送信する。キットや商業サービスを利用してを使用してのBamHI-NotI部位を使用して、選択したベクターにサブクローニング。

2。寒天プレートを作る

注意:これは、抗生物質など 、プレート、バッファの全株式を(温度及び時間)が適切に保存されていることが非常に重要であり、(滅菌)プロテアーゼの無料のまま。

  1. ガラス培地ボトルにおいては20g / Lと場所で1.5重量%の寒天および溶原性ブロス(LB)を秤量。 500ミリリットルボトルは約15枚になります。
  2. 体積、超純水を加えよく混ぜ、オートクレーブ。
  3. ボトルはタッチに冷却し、適切な抗生物質を追加してみましょう。ボトルがあまりにも多くを冷却し、溶液が凝固し始めた場合は、電子レンジで再加熱、寒天の早期固化を避ける。
    注意:私たちのプラスミドは、アンピシリン耐性GENが含まれていますE。したがって、すべてのステップは、100μg/ mlのアンピシリンを含む必要があります。 E.大腸菌クローニングK12株は、テトラサイクリン(12.5μg/ ml)を、抗生物質を必要とします。 BL21細菌細胞は、追加の抗生物質を必要としません。
  4. 90ミリメートルペトリ皿にソリューションの25〜30ミリリットル入れて乾燥させる時間を与える。
  5. 適切な抗生物質およびパラフィルムで4℃、またはジッパーのついた袋に保管して逆さまにラベル一品。
    注意:プレートを約1ヶ月に適しています。

3。ビオチンタグ付きプラスミドのクローニング

注意:条件を無菌的に行われています。

  1. ペレット化するために、3分間6000×gでプラスミドベクターをスピンダウンし、滅菌超純水を10μlを加える。
  2. 化学的にコンピテント50μlのを削除-80°Cから、すぐに大腸菌高い形質転換効率細胞は、5〜10分間氷上に置きます。
  3. 0.5〜1 ng/50でベクター溶液1μlを追加56; 50μLEにL細胞大腸菌の細胞および-80℃に残っているプラスミドを配置
  4. 5分間氷上にベクターを含有する細菌細胞を配置します。
  5. バック2分間氷上に42℃の水浴と場所細胞中の熱ショック30〜45秒のための細胞およびベクターの混合物。
  6. カタボライト抑制(SOC)培地(2%のVバクトトリプトン/ W、0.5%W / Vバクト-酵母エキス、8.56のNaCl、2.5のKCl、20mMの硫酸マグネシウム、20 mMのグルコースを含む超最適な培養液を250μlを追加超純水、をpH = 7.0)で、30分間、37℃で250rpmで振とうする。
    注:SOCがオートクレーブ処理されるものではなく、フィルタは0.22μmのフィルターを通して滅菌すること。
  7. 乾板前細胞を​​播種する10〜15分。
  8. ピペット25、50、およびアンピシリン(100μg/ ml)をテトラサイクリン(12.5μg/ ml)を抗生物質を含む別々の寒天プレート上に細胞溶液100μL。寒天プレート上に均一にソリューションを配布するためにガラスビーズを使用してください。
  9. <李は> 15〜18時間、37℃でプレートを逆さまをインキュベートする。
  10. プレート上の小さな個々の細菌コロニーを確認し、さらに使用する( 図2A)まで4℃で逆さまに保管してください。
    1. 全くコロニーは存在しない場合:
      1. バッファおよび消耗品の鮮度や無菌性を確認してください。
      2. Eに追加されたプラスミドの量を増やす大腸菌 K12株。
    2. 大きなコロニーが存在するかまたはコロニー( 図2Bおよび2C)の異常増殖がある場合、低い音量で、無菌接種ループまたは板細胞を使用して、新しい寒天プレートをrestreak。
  11. 接種5ミリリットル形質転換の単一コロニーをアンピシリン(100μg/ ml)をテトラサイクリン(12.5μg/ ml)を、抗生物質を含むLB 大腸菌細胞 。成長アップの細胞を一晩250〜300 rpmで37℃で。
  12. 翌日、一晩グロから標的ベクターを単離するために、プラスミド単離キットを使用しwはアップさらに使用するまで-80℃で、店舗精製プラスミド。
    1. オプション :260および280nmで得られた吸光度の測定値を用いて、プラスミドの純度や濃度を確認してください。

4。発現宿主へのプラスミドの変容

注意:条件を無菌的に行われています。

  1. E.のためのステップ3.2から3.10を繰り返します以下のように変更した大腸菌 BL21細胞:
    注:BL21細胞は、従って、形質転換のための唯一のアンピシリン寒天プレートに添加され、任意の付加的な抗生物質を必要としない。
    1. 50μlのEにステップ3.12から0.5〜2 ng/50μLの細胞を単離したプラスミドの2-5μl加え大腸菌発現宿主細胞。
    2. 60〜90秒間の熱ショック細胞。
    3. 60分の代わりに30分間、250rpmでSOC培地を含有する溶液を振る。
  2. アイドルマスターとペトリ皿から形質転換された細菌細胞の単一のコロニーを摘み取るニトリルアプリケータスティックと場所の適切な濃度のアンピシリン(100μg/ ml)を、5 mlのLBブロスを含有する試験管中。
  3. 250 rpmで37℃で一晩シェーカーで試験管を置きます。
  4. 翌朝、一晩増殖アップの200μLを取り、100μg/ mlのアンピシリンを含む5 mlのLBに追加します。
  5. 750μlの培養液に250μlの50%グリセロール(滅菌)で残りのセルを下に凍結し、-80℃に保つ
    注:新しいテスト式とスケールアップの手順は、凍結細胞の削れを取得するために、無菌のアプリケータースティックを使用して、適切な抗生物質を含むLBを接種することによって行うことができます。
  6. 37℃で250〜300 rpmで振盪器に置き試験管光学密度(OD)を、600nmの吸光度で0.7〜0.8の間で測定されるまで。
  7. 1mMの最終濃度でIPTGを用いて細胞を誘導する。
  8. 300 rpmで37℃でさらに4時間振る。代わりに細胞もできます250〜300 rpmで18℃で一晩振とうする。これは、標的タンパク質に応じて、プラスミドを高収率で生成することができる。
  9. テスト式のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)分析
    1. 1.5ミリリットルチューブに文化や場所を500μlを取る。 5分間13〜15×gでスピンダウン。上澄み液を捨て、ラベル「可溶性を。 "ローディングダイ(50μL2 - メルカプトエタノール、950μlのレムリ試料緩衝液)200μlの中でボルテックスで再懸濁ペレット。
      注:水溶性細菌ペレットを、組換えタンパク質が細菌細胞の細胞質領域内にあるかどうかを決定するために使用される。ペレットを必要になるまで、染料をロードせずに-80°Cで保存することができる。形質転換された又は誘導されていない対照細菌培養物は、可溶性ならびに比較のために処理することができる。
    2. 1.5ミリリットルチューブに文化と場所の千μLを取る。 5分間13〜15×gでスピンダウン。上澄み液を捨て、ラベル「不溶性を。 "
      注:不溶性ペレットを、細菌細胞の封入体中に見出されるタンパク質を放出するために、以下の手順変性を受ける。必要になるまでペレットを-80°Cで保存することができる。形質転換された又は誘導されていない対照細菌培養物は、不溶性ならびに比較のために処理することができる。
      1. 200μlのバグバスターに不溶性ペレットを再懸濁し、30分間室温で残す。
      2. 5分間13〜15×gで再びサンプルをスピンダウンし、上清50μlを取り、新しい「不溶性」1.5mlチューブに追加します。
      3. この新しいサンプルにローディング色素の50μlを加える。
    3. SDS-PAGE分析のためにタンパク質を変性するために5分間、可溶性および不溶性の両方のサンプルを沸騰させる。
    4. 標準ラダーと電気泳動ゲルに各サンプルをロードします。
    5. 可視化するために、タンパク質サンプルを使用staininG試薬、同社のプロトコルに従ってください。
    6. SDS-PAGEゲル上(注4.9.1および4.9.2を参照)タンパク質は、これらの2車線を比較するだけでなく、水溶性と不溶性の制御車線にレーンを比較することにより、可溶性および/ ​​または不溶性画分に発現するかどうかを判断します( 図2)。濃いバンドは、可溶性または不溶性のレーン中のタンパク質の分子量を中心に表示されます。これは、分離手順は、議定書6で使用するかを決定します。
      注:下記のプロトコル6において使用される単離を行うことができる、またはタンパク質がこの方法は、組換えタンパク質を高収率で生成する単離決定するために、両方の方法で単離することができ、どちらもバンドがこれらの領域の両方に存在する場合(図3)。 。
    7. 4時間および一晩の誘導を行った場合、本方法は、スケールアッププロセスのための最高のタンパク質産生( 図2)を有する誘導を決定する。
  10. 5。スケールアップ手順本培養

    1. 1時間液体サイクルで超純水とオートクレーブの1.8リットルのテリフィックブロスの85.7グラム、50%のグリセロール28.8ミリリットルと増殖培地を準備します。
    2. ステップ4.5で作成した凍結細胞ストックから一晩培養を開始します。
      注意:条件を無菌的に行われています。
      1. 無菌125ミリリットルの三角フラスコに100μg/ mlの、20のLB mlのアンピシリンの最終濃度で混ぜる。
      2. 無菌アプリケータースティックを使用すると、 形質転換のスクラップを取る大腸菌細胞とフラスコにアプリケーターをドロップします。泡ストッパーまたは綿とアプリケータースティックとプラグフラスコを取り外し、無菌性を維持するためにアルミホイルでカバーしています。
      3. 37℃、250rpmで一晩振盪
    3. 本培養
      注意:条件を無菌的に行われています。
      1. 無菌増殖培地1.8リットル中に一晩培養を注ぎ、10でアンピシリンを追加0μg/ mlのパスツールピペットを用いて、滅菌消泡204の6から8滴。
      2. エアレーション石を通して文化に圧縮空気バブリングをフィルタリング0.2ミリメートルと37℃の水浴に置き培養。
      3. OD 600nmが 0.7〜0.8に達すると、IPTG(1 mM)をして誘導し、誘導はステップ4.9でのSDS-PAGEからの可溶性/不溶性の結果に応じて、18℃で37℃、または一晩4時間のどちらかで発生することができます。
    4. E.の収集大腸菌細胞
      1. 4℃で14,000×gで15分間1リットルの遠心ボトル(2本/文化)で細胞培養をスピンダウン
      2. 上澄みを捨て、薄いヘラを使用して、細菌は2 50ミリリットルチューブにペレットスクープ。細胞は、数分間の遠心分離によって再度ペレット化することができる。
        注:各1.8 Lの培養は2細菌ペレット、各50ミリリットルの遠心管中で1になります。
      3. タンパク質の単離まで-80℃で保管してペレット。
      </李>

    6。単離と組換えタンパク質の精製

    タンパク質がステップ4.9からのSDS-PAGE分析をもとに、可溶性領域に位置されている場合は、「ネイティブの分離 "が使用されますが、不溶性のタンパク質「非ネイティブ分離」手続きのために実行されます。注意して​​ください。

    1. 細胞溶解
      1. ネイティブでない
        1. 形質転換削除大腸菌ペレット-80℃の冷凍庫から、それぞれの遠心チューブに20ミリリットルの溶解/洗浄バッファー( 表1)を追加します。
        2. 渦で、それを解凍し、任意の大きな塊を含まない緩衝液に可溶化するまで凍結ペレットを振る。一晩旋回装置上でインキュベートする。翌朝、ペレットは現在のバッファからのタンパク質の変性に起因する粘性スラリーである必要があります。
        3. 30分間室温で20,500×gで、スラリーを遠心分離する。分離のために新しいチューブに上清を移し、ペレットを捨てる。
      2. 形質転換得る-80℃の冷凍庫から大腸菌ペレット。
      3. 30ミリリットルの最終容量に到達するために遠心分離管に溶解バッファー( 表1)を追加し、ボルテックスし、厳格に振ることにより凍結されたペレットを取り除く。氷の上にペレットを配置します。
      4. 1〜2分間、100%の振幅で70%エタノールで超音波処理装置プローブを洗浄します。その後、超純水で繰り返します。
      5. 超音波処理した細菌は、5分(10分の合計経過時間)氷上ながらペレット。
        1. 秒間オフon/30 30秒のパルスで30%の振幅で超音波処理装置を設定します。
        2. 完全に細胞ペレットを分解するために、超音波処理間隔の間に上下にボブ遠心管。合計経過時間の終了時に、目に見える細菌があってはならない糸、粘性スラリーを残してペレット。
        3. 異なるタンパク質アイソレーション間の超音波処理装置プローブを清掃してだけでなく、ステップ6.1.2.3で説明したように70%エタノール、超純水を使用して、ストレージのため。
        30分間、4℃で20,500×gで、スラリーを遠心分離する。分離のために新しいチューブに上清を移し、ペレットを捨てる。
  11. のNi-NTAアフィニティークロマトグラフィー
    1. ネイティブでない
      1. 1ミリリットルを各遠心管(1.8L培養用2ミリリットルの樹脂の合計)に対するNi 2 +-NTA樹脂溶液を加え、旋回装置上で少なくとも1時間、室温でインキュベートする。
      2. アフィニティーカラムにスラリーを注ぎ、完全に廃棄物のビーカーにストップコックバルブを介してドリップするソリューションを可能にします。
      3. 各洗浄のための溶解/洗浄バッファー10mlで10回の洗浄を行ってください。
        1. 最初の2回の洗浄のために、追加の樹脂を除去した後、カラム中に注ぐ遠心チューブに10ミリリットルを追加。追加の洗浄カラムに直接添加することができる。
        2. 各洗浄後、ガラス撹拌棒で樹脂を撹拌する。洗浄液は、廃棄物のビーカーに滴下すると、次の10mlを添加することができる。
      4. 洗浄した後、完全にDRを通じてIPS、近くストップコックバルブ、廃棄物のビーカーを削除して、プロテイン収集のための50ミリリットルの遠心管と交換してください。
      5. 溶出バッファー( 表1)の15ミリリットルを加え、炒めアップ樹脂を、溶液を5分間静置し。ストップコックバルブとコレクト溶出開いた。追加の15ミリリットルを再び繰り返します。
    2. ネイティブ
      1. 以下のパラメータを調整すること以外は、上の非ネイティブアフィニティークロマトグラフィー(6.2.1.1-6.2.1.4をステップ)は、次のとおりです。
        1. 旋回装置上に少なくとも1時間4℃でのNi 2 +-NTA樹脂溶液をインキュベートする。
        2. 適切な洗浄緩衝液( 表1)を使用します。
      2. 溶出バッファー( 表1)の5ミリリットルを加え、5分間樹脂でインキュベートする。
        1. オープンストップコックバルブとソリューションのほとんどが通過滴下するまでの溶出を収集します。
        2. 96ウェルプレートをクリアするために90μL/ウェルのブラッドフォード試薬を追加します。各溶出後にそう10μlのを許可するよく90μlのブラッドフォード試薬を含むへの列から滴下するlution。
        3. ブラッドフォードアッセイは、もはやタンパク質を検出するまで(色はクリアするためにライトブルーとダークブルーからなる)時点で5ミリリットルの溶出緩衝液を加えていない続ける。これは通常4-5溶出量をとります。
  12. 透析/再生は
    1. (再生)非ネイティブにし、4℃でネイティブ透析バッファー( 表1)とストア
      注:透析緩衝液のpHは標的タンパク質の等電点(pI)によって決定される。親指タンパク質のルールとして、そのpI値の上または下に少なくとも1フルポイントをバッファする必要があります。
    2. 適切な分子量カットオフ(NGFおよびSema3Aの50,000 MWCO 25,000 MWCO)を有する透析チューブにネイティブおよび非ネイティブ溶出を転送します。 4℃で4時間、それぞれの透析緩衝液1中の各タンパク質試料を配置し、それぞれの緩衝液2以上と交換4℃で一
      注:タンパク質は、適切なフォールディングと場所を取るために緩衝液交換のために少なくとも4時間毎に緩衝液で透析する必要がある。
    3. 遠心機スピンコンセントレータを使用してより少ない5ミリリットルを透析タンパク質溶出を集中。
      注:タンパク質はさらに高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)を用いて精製することが、再び濃縮することができる。
  13. 予め秤量したマイクロチューブ10〜50 mLのサンプルを凍結乾燥することにより、タンパク質濃度(mg / ml)を決定します。
    1. オプション :タンパク質の濃度は、ランベルト·ベールの法則を用いて280nmで試料の吸光度を測定することにより、将来のアイソレーションで決定することができるように、ε、消衰係数を決定する:lは経路長は、c = 280nmの /εL。

7。精製タンパク質のビオチン化

  1. 万MWCO透析カセットAG中のタンパク質を透析6変更の合計でバッファ毎4時間の変更、10 mMのトリス(pH = 8.0)をainst。
  2. ビオチン化のため2ミリリットルのマイクロ遠心管に(現在は10 mMのトリス緩衝液中)組換えタンパク質を転送します。
  3. ビオチンタンパク質リガーゼキットを用いてビオチン化タンパク質。
  4. 3バッファーで10,000 MWCO透析カセットを用いてPBS液(pH = 7.4)に対してタンパク質を透析2日間、一日が変更されます。
  5. 定量キットを用いたタンパク質の割合ビオチン化を決定します。
  6. 長期保存のために-20℃で、4℃または分量や店頭で6.4とストアで説明したように、再び濃度を決定。

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Representative Results

クローニングとテスト式

めっきが適切に行われると、単一の単離されたコロニーをクローン形質転換された細菌細胞( 図2A)プラッキングの可能性を高めるために形成すべきである。あまりにも多くの細胞を播種する場合は、プレートを37℃以下で変態が長すぎるインキュベートし、コロニーを寒天プレートを被覆または細胞の大きな凝集体( 図2Bおよび2C)を形成してもよく、疑問である。テスト式中、NGFとのSema3Aは、第37℃で4時間誘導し、SDS-PAGE分析は、両方のタンパク質が可溶性画分( 図2D)に位置していたと判定した。タンパク質の発現は、公正、したがって、18℃で一晩誘導と他のテスト式を検討したように見えた。のSema3A( 図2E)との顕著な違いはなかったのに対し、NGFは、可溶性画分でより良い発現をもたらした。

"> 単離、精製およびビオチン化

NGFおよびSema3Aの両方が上記のプロトコールに記載され及び精製FPLCカラムに通すように天然の単離技術を用いて単離した。さらに、これらの組換えタンパク質を単離し、nonnatively精製した。 NGFはテスト式の間、可溶性画分にあったにも関わらず、ネイティブの単離方法は、37℃(4.57ミリグラム/ 2リットルの主培養)と18℃(6.11ミリグラム/ 2リットルの主培養の両方の後にNGFの低収量を生産。 図3A、実線)の誘導。 18℃で、一晩誘導した後、しかし、NGFの高い収率を再生( 図3A、破線10.72±1.8ミリグラム/ 2リットルの主培養)で非ネイティブの分離によって得られた。一方、非ネイティブの分離は8.61±3.1 mgの/ネイティブ単離するための2リットルの主培養( 図3とのSema3Aの生産( 図3B、破線)をもたらした B、 ​​実線)。その結果、NGFは、Sema3Aのは37℃で、誘導の4時間後にネイティブのアイソレーションを受けたのに対し、18℃で一晩誘導後に非ネイティブの条件で単離したFPLCピークを回収し、NGFおよびSema3Aのサンプルを、SDS-PAGE( 図3)を用いて分析した。 Sema3AのためのFPLC出力( 図3B)に見出される追加のタンパク質ピークを収集し、分析SDS-PAGEにより、およびSema3Aの分子量領域に配置されていなかったし。 図3Bに示されたSema3Aのピークがしたように、彼らは細胞ベースのアッセイでは、機能的に動作しなかったため、これらの画分は、ほとんどの場合分解生成物である。タンパク質がBirA酵素を用いてビオチン化し、未反応の種を除去する透析した。ビオチンは、ビオチン定量キットおよび蛍光マイクロプレートリーダーを用いて確認した。

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図1。 Eを用いたタンパク質工学大腸菌発現系。組換えタンパク質工学の基本的なプロセスはEのクローニングおよび発現のためのプラスミドの設計を必要とする大腸菌 。形質転換コロニーは、抗生物質の使用により選択されています。小テスト式は、標的タンパク質の生産および溶解度を最適化し、識別するために使用される。この手順は、大量のバッチ培養で(リットル規模)へのアップスケーリングされます。クロマトグラフィー法は、所望の人工タンパク質を単離および精製するために使用される。このようなビオチン化などの修飾は、バッチ培養を中または精製後に発生する可能性があります。

図2
図2。ONGFおよびのSema3Aのptimizingテスト式。 形質転換の(A)めっき25μL 大腸菌 K12細胞は小さな単離したコロニーをもたらした。個々のコロニーは、テスト発現のために選択する必要があります。 BL21形質転換細胞に対して同様のコロニー分布が発生する必要があります。 (BC)めっき50μLおよびK12細胞100μlを、それぞれ、細菌コロニーの過密となった。これらのプレートから摘採は、単一の形質転換された細胞から誘導されたコロニーを選択するより低い確率で発生する可能性があります。形質転換細胞の(D)試験式はIPTGで37℃で4時間誘導し、SDS-PAGEは、NGF融合タンパク質(29 kDa)のおよびSema3Aの融合タンパク質(91 kDaの)が可溶性画分に発現されることを示した。しかし、Sema3Aのための式が強化されていません。18℃で、(E)で一晩誘導は、可溶性画分にまだNGFの発現を示す。


FPLCを使用して、NGFとのSema3Aの図3。精製。(A)非ネイティブの分離18℃で一晩誘導後(破線)は、ネイティブの両方4時間で分離、37℃で、一晩、18℃の誘導のに比べて、より良い、NGFの収量が得られた(実線)。 (B)のSema3Aのために、4時間およびネイティブの分離条件の37℃での誘導は、同じ栽培パラメータで非ネイティブの分離と比べて良好な収率が得られた。 SDS-PAGEは、(A)NGFおよび(B)のSema3Aの両方にFPLCピークコレクション(矢印)を示す。ゲル濾過タンパク質標準は、ピークの分子量分布を確認するために実行し、kDa単位FPLCプロットの背景に表示される。

隔離 バッファ コンポーネント
ネイティブでない 溶解/ウォッシュ 6 MのGuHCl、100mMのH 2のNaPO 4、10mMのTris塩基、10 mMイミダゾール、pH値= 8.0
溶出 6 MのGuHCl、200mMの氷酢酸(17.4 M)
透析(再生は) リン酸緩衝食塩水(PBS)
21.7のNaH 2 PO 4、15.3のNa 2 HPO 4、149 mMのNaClを
緩衝液1:PBS、0.2 MのGuHCl、4 Lの超純水中の1.99 mMジチオスレイトール(DTT)でpH = 7.4
バッファ2:4 Lの超純水中のPBS;でpH = 7.4
ネイティブ 溶解の50mMのNaH 2 PO 4、300mMのNaCl、10mMのイミダゾール、pH値= 8.0
ウォッシュ 50 mMののNaH 2 PO 4、300mMのNaCl、20 mMイミダゾール、pH値= 8.0
溶出の50mMのNaH 2 PO 4、300mMのNaCl、250mMイミダゾール、pH値= 8.0
透析 リン酸緩衝食塩水(PBS)
21.7のNaH 2 PO 4、15.3のNa 2 HPO 4、149 mMのNaClを
バッファ1:PBS、4Lの超純水中の1.99のDTT;でpH = 7.4
バッファ2:4 Lの超純水中のPBS;でpH = 7.4

表1。組換えタンパク質分離バッファ。

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Discussion

組換えタンパク質工学は多くの分野にまたがる非常に強力な技術である。これは、カスタム設計のタンパク質の高収量の産生を可能にする、費用対効果の高い、調整可能な比較的簡単な手順である。これは、設計および標的タンパク質を発現することは必ずしも容易ではないことに留意することが重要である。基底発現および組換えタンパク質の安定性を、ベクターの特定の選択に依存E.大腸菌細胞株、ペプチドタグの追加や栽培パラメータ。私たちの具体的な設計基準は、十分に確立さEを利用して大腸菌はタンパク質工学のための株。さらに、プラスミドベクターは、安定な組換えタンパク質発現のためのT7のlacプロモーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む。

高度に精製されたプラスミドサブクローンを取得した後、最初の主要な手順が正常に宿主細胞に標的タンパク質を形質との溶解度を決定することであるタンパク質。テスト式は、標的タンパク質の合成を最適化するのに最適な時期です。これは、プラスミドを含む細菌細胞のより良好な選択を確保するために小さな、単離されたコロニー( 図2A)を抜くことが重要である。このようなコロニーを再配布するrestreakingまたはより短い期間で寒天プレートをインキュベートするなど、トラブルシューティングの戦略は、より良いコロニーの形成を支援することができます。これは、組換えタンパク質の生産は宿主株36へのストレスを誘導することは驚くべきことではない。発現が悪い場合には、この段階では、例えば、抗生物質およびIPTG濃度ならびに誘導時間および温度のような要因が、最適な標的タンパク質を達成するように調整することができる(レビューは37-38を参照)。これは、最高の式は18˚C( 図2E)で一晩の誘導から生じたNGFのために見られた。

Sema3Aのは、ネイティブの条件のためのタンパク質産生をもたらしたがnonnativ電子の分離は、タンパク質産生( 図3B)を示さなかった。 NGFの主培養物を18˚Cで37˚Cでだけでなく、一晩4時間誘導し、ネイティブの条件で単離した。 FPLC精製は18˚C( 図3A)で一晩誘導後nonnatively単離した主培養物と比較NGFの低収量を生産した。封入体中のタンパク質の形成は、一般に、再生が困難な場合があり、常に成功していないので、望ましくないと考えられている。これは、可溶性タンパク質配列39-41の付加を含むタンパク質の溶解度を高めるために技術の開発につながっている。しかし、タンパク質は封入体で単離されている間のコンホメーション状態の形態を有することが示されており、例えば、低級誘導温度などのパラメータは、これらの活性構造の42-46を維持するのに役立つ。タンパク質が不溶型のみで発現することができるとき、それは再通常可能である我々は以前に21を報告しているように非常に少ない歩留まり損失で簡単なテクニックを使用して分離した後、自然のタンパク質を。

我々が正常にエンジニアリングおよびEを使用してbiotinylatableタンパク質を生成する方法を示している約8〜10ミリグラム/ 2 Lの主な文化をもたらすホストとして大腸菌のクローニングおよび発現系には( 図1)新たな組換えタンパク質を製造する際に、イベントの全体の配列が同じであることに注意することは重要であるが、各カスタム·たタンパク質は、精製された生成物の最高収率を生成する方法を決定するためにケースバイケースで扱われるべきである。私たちは、NGFおよびSema3Aのは、同じ栽培システムとどのようにそれらの生産を最適化するために異なる挙動を示すかを示している。さらに、我々は現在、別のEを使用しているステインの重要性を実証し、他の標的タンパク質に対するインビボ 47 ビオチン化することができる大腸菌 B宿主株G組換えタンパク質工学に関する継続的な進歩や修正に十分な情報。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

著者らは、この仕事をサポートして資金調達のためにアクロン大学を承認したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% Chem-Impex International 127 100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol Chem-Impex International 642 250 ml
Acetic acid, glacial EMD AX0073-9 2.5 L
Agar Bioshop AGR001.500 500 g
Ampicillin sodium salt  Sigma-Aldrich A9518 25 g
Antifoam 204 Sigma-Aldrich A6426 500 g
Barstar-NGF pET-21a(+) GenScript USA Inc. 4 µg
BL21(DE3) Competent Cells Novagen 69450 1 ml; Expression Host
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916 500 ml
BugBuster Novagen 70922-3 100 ml
Gel filtration standard Bio-Rad 151-1901 6 vials
Glycerol Bioshop GLY001.1 1 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride Chem-Impex International 152 1 kg
His-Pur Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88222 100 ml
Hydrochloric acid EMD HX0603-3 2.5 L
Imidazole  Chem-Impex International 418 250 g
IPTG Chem-Impex International 194 100 g
Laemmli sample buffer Bio-Rad 161-0737 30 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface Chem-Impex International 270 500 g
LB Broth   Sigma-Aldrich L3022 1 kg
NovaBlue Competent Cells Novagen 69825 1 ml; Cloning Host
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5368-10PAK 10 pack
Potassium Chloride Chem-Impex International 01247 1 kg
Sema3A-pET-21a(+) GenScript USA Inc. 4 µg
SimplyBlue SafeStain Invitrogen LC6060 1 L
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886-1KG 1 kg
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-500 500 g
Sodium phosphate diabasic Sigma-Aldrich S5136-500G 500 g
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S5011 500 g
Terrific Broth Bioshop TER409.5 5 kg
Tetracycline hydrochloride Chem-Impex International 667 25 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x Bio-Rad 1610732 1 L
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503 1 kg
Tryptone, pancreatic EMD 1.07213.1000 1 kg
Yeast extract, granulated EMD 1.03753.0500 500 g
 ÄKTApurifier10 GE Healthcare 28-4062-64 Includes kits and accessories
Benchtop Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE4000 MAXQ 4000
BirA500 Avidity BirA500 Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis Casette Thermo Scientific 66380 Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories 132127, 132129 MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923 GE Healthcare 11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit Invitrogen 1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack C GE Healthcare 18-6083-13
Fraction Collector Frac-950 GE Healthcare 18-6083-00 Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator  VWR 13271-102 Model 1156D
Heating Oven FD Series Binder Model FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg GE Healthcare 17-1069-01 Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti Centrifuge Beckman Coulter 393126
JA 25.50 Rotor Beckman Coulter 363055
JLA 8.1 Rotor Beckman Coulter 969329 Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 Rotor Beckman Coulter 368690
Laminar Flow Hood Themo Scientific 1849 Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate Reader TECAN infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8004 4-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels Bio-Rad 456-9036 Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA Column Bio-Rad 737-2512 49 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep Kit Omega Bio-Tek D6943-01
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 164-5052 250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes VWR 3119-0050 50 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF Concentrators Corning 431488, 431483  20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning Service GenScript USA Inc. Protein Services
Ultrasonic Processor  Cole-Parmer 18910445A Model CV18
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-0236 Model G560

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