भाजित और पूल संश्लेषण और पेप्टाइड तृतीयक Amide लाइब्रेरी की विशेषता

Chemistry

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Summary

पेप्टाइड तृतीयक amides (पीटीए) शामिल हैं, लेकिन पेप्टाइड्स, peptoids और एन methylated पेप्टाइड्स तक सीमित नहीं हैं कि peptidomimetics की एक superfamily हैं. यहाँ हम पीटीए की एक एक मनका एक यौगिक पुस्तकालय synthesize करने के लिए विभाजन और पूल और उप मोनोमर रणनीतियों दोनों को जोड़ती है जो एक कृत्रिम विधि का वर्णन है.

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Gao, Y., Kodadek, T. Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library. J. Vis. Exp. (88), e51299, doi:10.3791/51299 (2014).

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Abstract

Peptidomimetics प्रोटीन ligands के महान स्रोत हैं. इन यौगिकों के oligomeric प्रकृति मिश्रित रसायन का उपयोग करके ठोस चरण पर बड़ी सिंथेटिक पुस्तकालयों का उपयोग करने के लिए सक्षम बनाता है. Peptidomimetics की सबसे अच्छी तरह से अध्ययन वर्गों में से एक peptoids है. Peptoids synthesize करने के लिए आसान कर रहे हैं और proteolysis प्रतिरोधी और सेल पारगम्य होना दिखाया गया है. पिछले दशक के दौरान, कई उपयोगी प्रोटीन ligands peptoid पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के माध्यम से पहचान की गई है. हालांकि, peptoid पुस्तकालयों से पहचान ligands की सबसे दुर्लभ अपवाद के साथ, उच्च आत्मीयता प्रदर्शित नहीं करते. इस peptoid अणुओं में chiral केन्द्रों और गठनात्मक की कमी की कमी के हिस्से में होने के कारण हो सकता है. हाल ही में, हम पेप्टाइड तृतीयक amides (पीटीए) का उपयोग करने के लिए एक नई सिंथेटिक मार्ग का वर्णन किया. पीटीए शामिल हैं, लेकिन पेप्टाइड्स, peptoids और एन methylated पेप्टाइड्स तक सीमित नहीं हैं कि peptidomimetics की एक superfamily हैं. Α कार्बन और मुख्य श्रृंखला नाइट्रोजन परमाणुओं दोनों पर पक्ष श्रृंखला के साथ,इन अणुओं की रचना बहुत sterical बाधा और allylic 1,3 तनाव से विवश कर रहे हैं. (चित्रा 1) हमारे अध्ययन से इन पीटीए अणुओं अत्यधिक समाधान में संरचित कर रहे हैं और प्रोटीन ligands की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम इन अणुओं उच्च आत्मीयता प्रोटीन ligands की एक भविष्य स्रोत हो सकता है. यहाँ हम एक नमूना पीटीए की एक मनका एक यौगिक (OBOC) पुस्तकालय synthesize करने के लिए विभाजन और पूल और उप मोनोमर रणनीतियों दोनों की शक्ति के संयोजन कृत्रिम विधि का वर्णन है.

Introduction

Peptidomimetics प्राकृतिक पेप्टाइड्स की संरचना की नकल है कि यौगिक हैं. वे proteolysis 1-3 खिलाफ सेल पारगम्यता और स्थिरता सहित प्राकृतिक पेप्टाइड्स, से जुड़ी समस्याओं में से कुछ पर काबू पाने, जबकि bioactivity बनाए रखने के लिए तैयार कर रहे हैं. कारण इन यौगिकों के oligomeric प्रकृति को, बड़े सिंथेटिक पुस्तकालयों आसानी मोनोमेरिक या उप मोनोमेरिक सिंथेटिक मार्गों 4-7 के माध्यम से पहुँचा जा सकता है. Peptidomimetics की सबसे अधिक अध्ययन वर्गों में से एक peptoids है. Peptoids एक उप मोनोमर रणनीति 8, 9 का उपयोग आसानी से संश्लेषित किया जा सकता है कि एन alkylated glycines की oligomers हैं. कई उपयोगी प्रोटीन ligands सफलतापूर्वक प्रोटीन लक्ष्य 1, 10-14 के खिलाफ बड़े सिंथेटिक peptoid पुस्तकालयों स्क्रीनिंग से पहचान की गई है. बहरहाल, peptoid पुस्तकालयों से पहचान की 'हिट' शायद ही कभी प्रोटीन लक्ष्य 1,10-14,22 की दिशा में बहुत अधिक समानता संग्रह. एक माjor peptoids और प्राकृतिक पेप्टाइड्स के बीच अंतर peptoids की सबसे आम तौर पर कारण chiral केन्द्रों और गठनात्मक की कमी की कमी के लिए माध्यमिक संरचना के रूप में करने की क्षमता की कमी है. इस समस्या को हल करने के लिए, कई रणनीतियों काफी हद तक मुख्य श्रृंखला नाइट्रोजन परमाणुओं 15-22 पर निहित पक्ष श्रृंखला के संशोधन पर ध्यान केंद्रित, पिछले एक दशक में विकसित किया गया. हाल ही में, हम पेप्टाइड तृतीयक amides 23 बनाने के लिए एक peptoid रीढ़ की हड्डी पर प्राकृतिक एमिनो एसिड पक्ष श्रृंखला शुरू करने की एक नई सिंथेटिक मार्ग विकसित किया है.

पेप्टाइड तृतीयक amides (पीटीए) शामिल हैं, लेकिन पेप्टाइड (नि. = 2 एच), peptoids (नि. = 1 एच) और एन methylated पेप्टाइड्स तक सीमित नहीं हैं कि peptidomimetics की एक सुपर परिवार हैं (आर 1 ≠ एच, 2 आर मुझे =) . हमारे सिंथेटिक मार्ग स्वाभाविक रूप पर दाहिनी ओर और पक्ष श्रृंखला के स्रोत के रूप में एमिनो एसिड होने वाली रोजगार (चित्रा 1 देखें)45, कार्बन, और एन प्रतिस्थापन प्रदान करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्राथमिक amines. इसलिए, सरल पेप्टाइड्स, peptoids या एन methylated पेप्टाइड्स की तुलना में एक बड़ा रासायनिक अंतरिक्ष का पता लगाया जा सकता है. परिपत्र dichroism स्पेक्ट्रा कि पीटीए अणुओं अत्यधिक समाधान में संरचित कर रहे हैं पता चला है. पीटीए प्रोटीन परिसरों में से एक की विशेषता स्पष्ट रूप से पीटीए के गठनात्मक की कमी बाइंडिंग के लिए आवश्यक हैं कि पता चलता है. हाल ही में, हम भी पीटीए अणुओं में से कुछ उनके peptoid और पेप्टाइड समकक्षों की तुलना में सुधार सेल पारगम्यता के अधिकारी उस खोज की है. हम इन पीटीए पुस्तकालयों प्रोटीन लक्ष्य के लिए उच्च आत्मीयता ligands का एक अच्छा स्रोत हो सकता है. इस पत्र में, हम एक नमूना इन यौगिकों के युग्मन और दरार के लिए कुछ सुधार शर्तों के साथ विवरण में एक मनका एक यौगिक (OBOC) पीटीए पुस्तकालय का संश्लेषण पर चर्चा करेंगे.

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Protocol

1. भाजित और पूल संश्लेषण की मूल बातें

कुशलतापूर्वक ठोस चरण पर यौगिकों की एक बड़ी संख्या उत्पन्न करने के लिए, विभाजन और पूल संश्लेषण अक्सर एक सामान्य रणनीति के रूप में कार्यरत है. चित्रा 4 में दिखाया गया है, tentagel मोती तीन भागों में पहली विभाजित कर रहे हैं. प्रत्येक भाग में मोती पर पहले छाछ पैदा करने, एक अलग अभिकर्मक के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है. पहली प्रतिक्रिया के बाद, सभी तीन भागों, एक साथ जमा मिलाया, और फिर तीन भागों में फिर से विभाजित कर रहे हैं. प्रत्येक भाग में फिर से मोती पर दूसरे अवशेषों पैदा करने, एक अलग अभिकर्मक के साथ प्रतिक्रिया होगी. दो विभाजन और पूल कदम के बाद, नौ यौगिकों उत्पन्न कर रहे हैं.

उप मोनोमर संश्लेषण में, मोतियों पहले युग्मन अभिकर्मक की उपस्थिति में विभिन्न ब्रोमो एसिड के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए कई भागों में बांटा जाता है. विलायक से धोने के बाद, सभी मोती तो फिर अलग से प्रतिक्रिया करने के लिए कई भागों में विभाजित, एक साथ और मिश्रित जमा किया जाएगाप्राथमिक amines. Amination के बाद, सभी मोती एक साथ जमा कर रहे हैं और प्रत्येक मनका पर एक पूर्ण मोनोमर को पूरा करने, अच्छी तरह से धोया. वांछित विविधता पर पहुंच गया है अब तक इस प्रक्रिया को दोहराया जा सकता है.

प्राकृतिक एमिनो एसिड से एसिड ब्रोमाइड के 2. तैयारी

.. एसिड ब्रोमाइड और प्राथमिक amines के साथ 2 amination (चित्रा 2) के 1 युग्मन: उप मोनोमर संश्लेषण में, प्रत्येक monomer के संश्लेषण के दो अलग चरणों में बांटा गया है. एक पेप्टाइड तृतीयक एमाइड synthesize करने के लिए, अल्फा कार्बन पर पक्ष श्रृंखला के साथ chiral एसिड समन्वय से युक्त प्राकृतिक एमिनो एसिड से तैयार हो जाएगा. यहाँ हम उच्च स्टीरियो निष्ठा के साथ इसी एसिड ब्रोमाइड में एक प्राकृतिक एमिनो एसिड बदलने की विधि का वर्णन. हम एक उदाहरण के रूप में alanine का उपयोग करें; सेरीन, threonine, एसपारटिक एसिड, glutamic एसिड, asparagine, glutamine, ग्लाइसिन, एसीवी isoleucine सहित अन्य अमीनो एसिड, फेनिलएलनिन भी इसी तरह conditio के तहत ब्रोमो एसिड के रूप में तब्दील किया जा सकता हैएनएस. फिनोल, guanidine और amine जैसे कार्य समूहों के साथ अमीनो एसिड की कुछ परिवर्तन से पहले संरक्षित करने की जरूरत है कि ध्यान दें. प्रतिक्रिया सेटअप 3 चित्र में दिखाया गया है.

सुरक्षा एहतियात: HBR, नैनो 2 और अन्य संक्षारक / जहरीले रसायनों, सुरक्षा चश्मे, प्रयोगशाला कोट, और रासायनिक प्रतिरोधी दस्ताने जैसे उचित सुरक्षा उपकरणों को शामिल निम्नलिखित प्रतिक्रियाओं की जरूरत है के लिए. सभी प्रतिक्रियाओं अनुभवी रसायनज्ञ द्वारा एक धूआं हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए.

  1. एक 1 एल, 30% HBR समाधान तैयार करने के लिए 630 मिलीलीटर 48% HBR समाधान में 370 मिलीलीटर पानी जोड़ें. एक 1 एल स्नान कंटेनर में 500 मिलीलीटर इथाइलीन ग्लाइकॉल जोड़ें; -10 डिग्री सेल्सियस तापमान बनाए रखने के लिए सूखी बर्फ जोड़ सावधानी: 48% HBR समाधान देखभाल के साथ संभाल, दृढ़ता से अम्लीय और संक्षारक है. उपयोग से पहले एमएसडीएस पढ़ें.
  2. एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ एक 250 मिलीलीटर तीन गर्दन दौर नीचे कुप्पी D-alanine (8.9 ग्राम, 0.1 mol) और KBR (11.9 ग्राम, 0.1 mol) जोड़ें. 100 मिलीलीटर, और टी में तैयार 30% HBR जोड़ेंवह पिछले चरण. 2.1 चरण में तैयार इथाइलीन ग्लाइकॉल स्नान में कुप्पी रखो और -10 डिग्री सेल्सियस तापमान रखना 3 चित्र में दिखाया के रूप में 10 मिनट के लिए कुप्पी के नीचे से एक लंबी सुई के माध्यम से बुलबुला आर्गन. 300 rpm पर चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ समाधान हलचल.
  3. 20 मिलीलीटर पानी के साथ एक 100 मिलीलीटर बीकर में नैनो 2 (8.28 जी, 0.12 mol) भंग. छोड़ने कीप equalizing दबाव में समाधान जोड़ें और एक पट साथ छोड़ने कीप मुहर. धीरे धीरे छोड़ने कीप के वाल्व पर बारी और नैनो 2 समाधान कुप्पी में छोड़ देते हैं. प्रति सेकंड लगभग 2 बूंदों के टपकने दर को समायोजित करने के लिए वाल्व नियंत्रण. 300 rpm पर सरगर्मी रखें और कुप्पी के नीचे से बुदबुदाती आर्गन रखना. सभी नैनो 2 जोड़ा जाता है जब तक कुप्पी -10 डिग्री सेल्सियस पर इथाइलीन ग्लाइकॉल स्नान में रखा जाना चाहिए. सावधानी: इस कदम नैनो 2 समाधान के अलावा दौरान गर्मी और गैस उत्पन्न करता है. टपकता दर चुनाव सावधानी से किया जाना चाहिएtrolled और पूरी व्यवस्था आर्गन आउटलेट के माध्यम से खुला होना चाहिए.
  4. 3 अधिक घंटे के लिए सरगर्मी रखें और तापमान कमरे के तापमान -10 डिग्री सेल्सियस से ऊपर गर्म करते हैं. परिणामस्वरूप समाधान हल्के पीले करने के लिए स्पष्ट किया जाना चाहिए; रंग भी अंधेरा है, तो अतिरिक्त नाइट्रोजन आक्साइड और प्रतिक्रिया के दौरान उत्पन्न संभव BR 2 दूर करने के लिए वैक्यूम लागू होते हैं.
  5. एक निकालने कीप का उपयोग 3x 35 मिलीलीटर Diethyl ईथर के साथ समाधान से उत्पाद निकालें. जैविक चरण का मिश्रण है और संतृप्त नमकीन पानी से धो. जैविक चरण भी पहले यह अंधेरा है, तो रंग निकालने के लिए नमकीन पानी से धोने के लिए 3 NaHCO की एक छोटी राशि के साथ धोया जा सकता है. एसओ 4 से 6 घंटे के लिए ना 2 से अधिक जैविक चरण सूखी.
  6. अतः 4 ना 2 बाहर तक और वैक्यूम के अंतर्गत विलायक लुप्त हो जाना, कच्चे उत्पाद पीला तेल पीला करने के लिए स्पष्ट रूप से प्राप्त किया जाना चाहिए. क्रूड उत्पाद आगे 115 डिग्री सेल्सियस पर आसवन द्वारा शुद्ध किया जा सकता है, 3 मिमी पारा, या द्वारा03:01 हेक्सेन के साथ सिलिका स्तंभ: एथिल एसीटेट.
  7. शुद्ध उत्पाद, स्पष्ट तेल, 6.6 जी (74% उपज), घनत्व = 1.69 मिलीग्राम / छ, [α] D20 = 24 ° (मेथनॉल), 4.41 (क्यू δ 1 एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, CDCl 3) के रूप में प्राप्त किया जाता है जम्मू = 7.0 हर्ट्ज, 1h), 1.86 (घ, जम्मू = 7.0 हर्ट्ज, 3H). की (एस)-2-bromopropanoic मामले में (डी 4-एल alanine से तैयार) एसिड डी 4, शुद्ध उत्पाद स्पष्ट तेल के रूप में प्राप्त किया जाता है, 78% उपज, घनत्व = 1.72 मिलीग्राम / छ, [α] D20 = -19 ° (मिथेनॉल). 1 एच एनएमआर, कोई महत्वपूर्ण एच संकेत मनाया जाता है. ईएसआई एमएस - [एम -1] - = 155.1 (154.97 उम्मीद). के लिए (एस)-2-Bromo-4-methylpentanoic शुद्ध उत्पाद, 89% उपज, स्पष्ट तेल के रूप में [α] D20 = 37 ° (मेथनॉल), 1 एच प्राप्त किया जाता है (एक ही प्रक्रिया का उपयोग एल leucine से तैयार) एसिड एनएमआर 4.30 δ (400 मेगाहर्ट्ज, CDCl 3) (टी, जम्मू = 7.7 हर्ट्ज, 1h), 1.94 (डीडी, जम्मू = 10.8, 3.9 हर्ट्ज, 2H), 1.81 (टीटी, जम्मू = 13.2, 6.5 हर्ट्ज, 1h), 0.96 (DD, जम्मू = 18.2, 6.6 हर्ट्ज, 7). (एस)-2-Bromo-3-Phe के मामले मेंnylpropanoic एसिड (एक ही प्रक्रिया का उपयोग एल फेनिलएलनिन से तैयार) शुद्ध उत्पाद हल्के पीले तेल के रूप में प्राप्त किया जाता है, 72% उपज, [α] D20 = 17 ° (मेथनॉल), 1 एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, CDCl 3) δ 7.38 - 7.19 (एम, 5H), 4.42 (डीडी, जम्मू = 8.1, 7.3 हर्ट्ज, 1h), 3.47 (डीडी, जम्मू = 14.2, 8.2 हर्ट्ज, 1h), 3.25 (डीडी, जम्मू = 14.2, 7.2 हर्ट्ज, 1h).

ट्रांसअमाइनेज का प्रयोग Alanine की 3. समस्थानिक लेबल

मिश्रित पुस्तकालय संश्लेषण में, विशेष रूप से एक मनका एक यौगिक (OBOC) पुस्तकालयों के विभाजन और पूल संश्लेषण में, प्रत्येक मनका से प्राप्त किया जा सकता है कि परिसर की राशि अपेक्षाकृत छोटा है. (आम तौर पर 1 pmol nmol 10). इसके अतिरिक्त, मास स्पेक्ट्रोमेट्री व्यापक रूप से अपनी उच्च संवेदनशीलता को अंतिम यौगिक की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए प्रयोग किया जाता है. अंतिम पीटीए उत्पादों की chiral केन्द्रों पर पूर्ण त्रिविम निर्धारित करने के लिए जन स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करने के लिए, ब्रोमो एसिड enantiomers isoto होना चाहिएpically उपयोग करने से पहले लेबल. यहाँ हम लेबल एल alanine को ट्रांसअमाइनेज और डी 2 हे के उपयोग की विधि का वर्णन.

  1. एक 50 मिलीलीटर पॉलीथीन ट्यूब में डी ओ 2 के 10 एमएल के साथ एल alanine (300 मिलीग्राम, 3.36 mmol) भंग. सह सब्सट्रेट के रूप में α-ketoglutarate (10 मिलीग्राम, 0.068 mmol) जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए ट्यूब को गर्म और एक 1 एम NaOD soution का उपयोग 8.5-8.7 को पीडी को समायोजित. नोट: पीडी पीएच परीक्षण स्ट्रिप्स द्वारा निर्धारित किया जाता है. पारंपरिक इलेक्ट्रो पीएच मीटर एच + के लिए चयनात्मक कांच इलेक्ट्रोड से सुसज्जित दे सकता है गलत डी + के लिए पढ़ा.
  2. , 8.7 पिछले चरण से तैयार 37 डिग्री सेल्सियस समाधान - पीडी 8.5 (सुअर दिल, Roche Diagnostics, इंडियानापोलिस में से 0.1 मिलीग्राम, चुनाव आयोग 2.6.1.2) alanine ट्रांसअमाइनेज जोड़ें. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ट्यूब डाल दिया और हल्के झटकों के साथ रात भर सेते हैं, 10 से 30 आरपीएम पसंद किया जाता है.
  3. रात ऊष्मायन के बाद, डी 2 हे समाधान के 0.5 मिलीलीटर ले और 1 एच एनएमआर द्वारा प्रतिक्रिया प्रगति की जाँच करें. एक के सभी प्रोटॉन संकेतlanine, 3.76 δ (क्यू, जम्मू = 7.2 हर्ट्ज, 1h), 1.46 (घ, जम्मू = 7.3 हर्ट्ज, 3H), 1 एच एनएमआर 400 मेगाहर्ट्ज, बहुत कारण deuteration को दबा दिया जाना चाहिए. पहले 23 में वर्णित के रूप में प्रोटॉन की 98% से अधिक ड्यूटेरियम के लिए विमर्श किया जाना चाहिए. नोट: डी 2 प्रतिक्रिया बड़े पैमाने पर किया जाता है, तो हे आंशिक रूप से (> 200 मिलीलीटर डी ओ 2) आसवन द्वारा ठीक किया जा सकता है. आम तौर पर, डी 2 ओ के 80% से 60% समाधान से आसुत किया जा सकता है.
  4. तरल नाइट्रोजन के साथ ऊपर समाधान रुक और सफेद deuterated एल alanine पाउडर प्राप्त करने के लिए एक lyophilizer का उपयोग कर यह lyophilize.

Peptoid Linker क्षेत्र की 4. संश्लेषण

लिंकर क्षेत्र पीटीए पुस्तकालय संश्लेषण के लिए आवश्यक नहीं है. हालांकि, MALDI जन स्पेक्ट्रोस्कोपी के निचले आणविक वजन रेंज (100-600) में उच्च पृष्ठभूमि से बचने के लिए और यौगिकों के आयनीकरण में सुधार करने के लिए, कई ध्रुवीय अवशेषों के साथ एक peptoid लिंकर अक्सर प्रयोग किया जाता है. इस लिन peptoidकेर मानक peptoid संश्लेषण की प्रक्रिया के माध्यम से संश्लेषित किया जा सकता है. (चित्रा 5 में दिखाया गया है) यहाँ हम linker के रूप में एन methoxyethyl ग्लाइसिन के एक pentamer synthesize होगा.

  1. हल्के झटकों के साथ एक 12 मिलीलीटर सिरिंज रिएक्टर में 3 घंटे के लिए 10 मिलीलीटर DMF में राम linker (1 ग्राम, 0.27 mmol / छ) के साथ 90 माइक्रोन Tentagel मोती पक्की.
  2. रिएक्टर से DMF नाली और रिंक एमाइड linker से Fmoc समूह deprotect को 10 मिलीलीटर 20% piperidine DMF समाधान जोड़ने. 30 मिनट के लिए 20% piperidine समाधान के साथ मोती हिलाएँ. सभी piperidine दूर करने के लिए DMF 5x के साथ धोएं.
  3. सिरिंज से कुछ मोती बाहर ले जाओ और chloranil परीक्षण के साथ परीक्षण. Fmoc सफलतापूर्वक deprotected है अगर मोती गहरे भूरे (प्राथमिक amine के लिए सकारात्मक chloranil परीक्षण) बारी चाहिए.
  4. . निम्नलिखित समाधान तैयार: 1 20 मिलीग्राम, 2 एम bromoacetic एसिड / DMF समाधान; 2 20 मिलीग्राम, 2 एम डीआईसी / DMF समाधान. 3. 10 मिलीलीटर, 1 एम methoxylethylamine / DMF समाधान.
  5. करने के लिए 2 एम bromoacetic एसिड / DMF समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ेंमोती, धीरे से मिलाने. फिर 5 जोड़ मोतियों के लिए 2 एम डीआईसी / DMF समाधान के मिलीलीटर; सवार के साथ सिरिंज सील और शेखर पर डाल दिया. 10 मिनट के लिए हिला.
  6. अच्छी तरह से DMF साथ मोती धो लें. मोतियों के लिए कदम 4.4 से तैयार 1 एम methoxyethylamine / DMF समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें. सवार के साथ सिरिंज को सील करने और 30 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर इसे हिला.
  7. DMF 5x साथ मोती धो लें. सकारात्मक (मोती नीले हो), तो chloranil परीक्षण के साथ कुछ मोतियों की जाँच करें, तो अगले कदम के लिए जारी है. अन्यथा, कदम 4.6 दोहराएँ.
  8. दोहराएँ 4.5-4.7 कदम, pentamer पूरा करने के लिए 4x.

. (नि.) के साथ पीटीए लाइब्रेरी के 5 भाजित और पूल संश्लेषण - और (एस)-2-bromopropionic एसिड

यहाँ हम कदम 4.8 से मोतियों की 1 ग्राम का उपयोग कर 9261 यौगिकों का एक सैद्धांतिक विविधता के साथ एक छोटे से पीटीए पुस्तकालय के संश्लेषण का वर्णन. एक 90 माइक्रोन tentagel मनका ग्राम प्रति लगभग 2.9 करोड़ मोती होता है कि नोट; इसलिए की अतिरेकपुस्तकालय 2.9 x 10 6/9261 = 312 प्रतियां होगा. हम amination के लिए (विवरण के लिए चित्रा 5, A1 ~ उ 7) एसिड होता है, और 7 अलग amines के रूप में (एस) लेबल bromoacetic एसिड, (नि.)-2-bromopropanoic और समस्थानिक-2-bromopropanoic एसिड डी 4 का उपयोग करेगा. सिरिंज रिएक्टरों और एक निर्वात कई गुना संश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.

  1. कदम 4.8 से सिरिंज से DMF;: 01:01 डीसीएम की 10 मिलीलीटर जोड़ें तीन 5 मिलीलीटर सिरिंज रिएक्टरों में समान रूप से सभी 1 जी मोती विभाजित करने के लिए एक छोटा पिपेट टिप के साथ एक 1000 μl विंदुक का उपयोग करें. ((एस)-2-bromopropanoic एसिड डी 4) बी (bromoacetic एसिड), आर ((नि.)-2-bromopropanoic) और एस के रूप में उन्हें लेबल. डीसीएम 3X के साथ सभी 3 सीरिंज धो लें, और निर्जल THF 3X के साथ अनुसंधान और एस के साथ लेबल सीरिंज धोने, DMF 3X के साथ बी के साथ लेबल सिरिंज धो लो.
  2. सिरिंज आर और एस. Bromopropanoic एसिड की बीटीसी युग्मन.
    1. एक ताजा बीटीसी / THF समाधान तैयार करें. एक जोड़ेंpproximately एक धूआं हुड में शीशी में बीटीसी की 200 मिलीग्राम, टोपी के साथ इसे सील. शीशी में बीटीसी की राशि वजन. जरूरत विलायक की राशि की गणना और एक 20 मिलीग्राम / एमएल बीटीसी / THF समाधान बनाने के लिए शीशी में निर्जल THF जोड़ें.
    2. ब्रोमो एसिड / बीटीसी मिश्रण तैयार करें. (नि.)-2-bromopropanoic एसिड (89 μl, 0.95 mmol) जोड़ें और (एस)-2-bromopropanoic अलग दो छोटी शीशियों में एसिड डी 4 (89 μl, 0.95 mmol). प्रत्येक शीशी, ऊपर 20 मिलीग्राम / एमएल बीटीसी / THF समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें. दो शीशियों को सील करने और 20 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में डाल दिया.
    3. अलग से अनुसंधान और एस सिरिंज से 1,125 μl, 2:1 THF / DIPEA (750 μl THF, 375 μl DIPEA, 2.2 mmol) जोड़ें. पिपेट टिप के साथ मोती मिलाएं. उन्हें 5 मिनट के लिए बैठते हैं.
    4. , दो कदम 5.2.2 से ब्रोमो एसिड / बीटीसी मिश्रण ठंडा लो प्रत्येक शीशियों को 2,4,6-Trimethylpyridine (356 μl, 2.7 mmol) जोड़ें. सफेद अवक्षेप तुरंत बनेगी. सीधे इसी निलंबन लागू करेंजितनी जल्दी हो सके और उसके बाद 2 घंटे के लिए 120 आरपीएम के तहत मिलाने के लिए एक प्रकार के बरतन पर डाल basified मोती (चरण 5.2.3 में सिरिंज आर और एस) के लिए.
      नोट: सिरिंज रिएक्टरों में समाधान प्रतिक्रिया के पूरे कोर्स के दौरान एक पीला पीले निलंबन होना चाहिए. एक काले रंग एसिड क्लोराइड समाधान के प्रारंभिक अलावा दौरान जारी की अत्यधिक गर्मी का एक संकेत है. यह आगे नीचे ठंडा करके हल या ब्रोमो एसिड / बीटीसी मिश्रण पतला किया जा सकता है.
  3. सिरिंज बी. जिला उद्योग केंद्र के साथ Bromoacetic एसिड युग्मन
    1. एक ताजा 20 मिलीलीटर, 2 एम bromoacetic एसिड / DMF समाधान तैयार करें. एक 20 मिलीलीटर, 2 एम डीआईसी / DMF समाधान तैयार करें.
    2. 2 एम bromoacetic एसिड / DMF समाधान के मिलीलीटर बी सिरिंज से 2 जोड़ें, धीरे से मिलाने. 2 एम डीआईसी / DMF समाधान के मिलीलीटर बी सिरिंज से 2 जोड़ें, धीरे से मिलाने.
    3. सिरिंज आर और एस के रूप में एक ही प्रकार के बरतन पर सिरिंज बी रखो
  4. 2 घंटे के बाद, एक प्रकार के बरतन से सिरिंज आर, एस और बी ले. डीसीएम 5x के साथ अच्छी तरह से सभी तीन सीरिंज धो लें. फिर DMF 5x से धो लें. कि सिरिंज आर और एस पहले डीसीएम या THF से धोया जा रहा से पहले DMF साथ धोया नहीं जा सकते हैं.
  5. पूल सीरिंज आर, एस और बी से सभी मोती एक 12 मिलीलीटर सिरिंज रिएक्टर में. DMF 5x साथ सभी मोती धो लें.
  6. सिरिंज के लिए DMF;: 01:01 डीसीएम की 10 मिलीलीटर जोड़ें , 7 व्यक्ति 2 मिलीलीटर सीरिंज में समान रूप से सभी मोती विभाजित A1-ए 7 के रूप में उन्हें लेबल करने के लिए एक छोटा पिपेट टिप के साथ एक 1000 μl विंदुक का उपयोग करें.
  7. Amination. 10 मिलीलीटर, चित्रा 5 में सूचीबद्ध 7 एमाइंस प्रत्येक के लिए 2 एम प्राथमिक amine / DMF समाधान तैयार करें. पूर्वी वायु कमान के 5 मिलीलीटर जोड़ेंइसी सिरिंज A1-ए 7 ज amine समाधान. रात भर झटकों के साथ एक 60 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सभी 7 सीरिंज सेते हैं.
  8. ऊष्मायन के बाद, DMF के साथ अच्छी तरह से सभी मोती धो लो. प्रत्येक सिरिंज से मोतियों की कुछ ले लो और chloranil परीक्षण के साथ की जाँच करें. मोती 3 मिनट के भीतर हरे (सकारात्मक) की बारी है, तो अगले कदम के साथ आगे बढ़ना. नकारात्मक है, तो नकारात्मक सीरिंज के लिए कदम 5.7 दोहराएँ.
  9. दोहराएँ trimer पूरा करने के लिए 5.1 2x 5.8 के लिए कदम. वैकल्पिक कदम: प्रत्येक चक्र के बाद, हम नीचे के रूप में वर्णित जन स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा संश्लेषण गुणवत्ता की जांच करने के लिए सलाह देते हैं. सभी 9261 यौगिकों अब OBOC पुस्तकालय के रूप में tentagel मनकों पर संश्लेषित कर रहे हैं.
  10. पीटीए की मास स्पेक्ट्रोस्कोपी पुष्टि.
    पीटीए उच्च संरचित oligomers हैं और एन methylated पेप्टाइड्स के कई आम सुविधाओं के अधिकारी. एन methylated पेप्टाइड्स की ठोस चरण संश्लेषण की आम समस्याओं में से एक TFA दरार दौरान एसिड गिरावट है. एसिड गिरावट, cyclosporine के अणुओं की तरह की दरार से दमन करने के लिएठोस समर्थन अक्सर कम तापमान के तहत किया जाता है. हम ठोस समर्थन से अलग पीटीए अणुओं cleaving के लिए विभिन्न cleaving की स्थिति की तुलना में. हम आम तौर पर, कम तापमान और कम TFA एकाग्रता प्रभावी रूप से एसिड गिरावट को दबाने और purer यौगिकों प्रदान कर सकता है, कि पाया.
    1. 10 मिलीलीटर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 01:01 TFA / डीसीएम समाधान तैयार करें. ट्यूब को सील करने और 20 मिनट के लिए एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रख दिया.
    2. डीसीएम 5x साथ cleaved करने की आवश्यकता है कि मोती धो लें. 15 मिनट के लिए डीसीएम में मोती हिला और डीसीएम 5x के साथ फिर से मोती धो लो.
    3. सिरिंज से डीसीएम नाली. अच्छी तरह से प्रति एक 96 अच्छी तरह से थाली, एक मनका में प्रत्येक व्यक्ति मनका हस्तांतरण करने के लिए छोटा टिप के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप और एक विंदुक का प्रयोग करें.
    4. एक कवर पर्ची के साथ 96 अच्छी तरह से थाली को कवर किया. 15 मिनट के लिए एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में थाली रखो.
    5. कदम 5.10.1 से ठंडा 01:01 TFA / डीसीएम समाधान लो और एक मनका होता है कि कुओं में से प्रत्येक के लिए 20 μl जोड़ें. पीठ और पु कवर पर्ची रखोटी -20 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में एक प्रकार के बरतन पर 96 अच्छी तरह से थाली.
    6. 20 मिनट के लिए हिला. बाहर 96 अच्छी तरह से थाली ले लो और कवर पर्ची दूर छील. ब्लोड्राइ इस पर हवा या आर्गन उड़ाने से प्रत्येक अच्छी तरह से TFA / डीसीएम. 10 से अधिक मोती चिपके रहते हैं, तो एक speedvac पूरी थाली से TFA / डीसीएम सुखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस बिंदु पर, नहीं सभी यौगिकों के मोती बंद चिपके रहते हैं, लेकिन cleaved यौगिकों जन स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त से अधिक होना चाहिए ध्यान दें.
    7. एच 2 ओ समाधान प्रत्येक अच्छी तरह से cleaved यौगिकों भंग करने के लिए: 20 μl 06:04 ACN जोड़ें. एक साथ MALDI प्लेट पर 0.6 μl CHCA MALDI मैट्रिक्स के साथ प्रत्येक यौगिक समाधान के 0.6 μl स्पॉट.
    8. प्रत्येक परिसर के आणविक वजन और अनुक्रम (एमएस / एमएस) निर्धारित करने के लिए MALDI मास स्पेक्ट्रोमेट्री का प्रयोग करें.

6. Chloranil टेस्ट

  1. प्रत्येक परीक्षा के लिए निम्नलिखित अभिकर्मकों ताजा तैयार करें. समाधान एक: 2% Chloranil (कैस: 118-75-2) DMF में. समाधानबी: 2% एसीटैल्डिहाइड (कैस: 75-07-0) DMF में.
  2. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में परीक्षण से पहले समाधान बी के 100 μl के साथ समाधान के लिए एक के 100 μl मिक्स; में मोती छोड़ देता है और धीरे हिला. मोती 5 मिनट के भीतर नीले रंग की बारी है, तो यह मोतियों की सतह पर माध्यमिक amine की उपस्थिति का संकेत है. प्राथमिक amines के बजाय नीले रंग बदल के एक गहरे भूरे रंग दे.

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Representative Results

यहाँ हम linker के साथ एक पीटीए trimer से तीन प्रतिनिधि MALDI स्पेक्ट्रम दिखा. चित्रा 6A में दिखाया गया है 50% TFA / डीसीएम समाधान का उपयोग कर कमरे के तापमान के तहत cleaved जब, महत्वपूर्ण गिरावट मनाया जाता है. चित्रा 6A में, 593 चोटी और 484 पूरे अणु सफलतापूर्वक मनका पर संश्लेषित लेकिन दरार के दौरान अपमानित किया गया था कि दिखाने के लिए, क्रमशः लिंकर और पीटीए trimer के अनुरूप हैं. ऊपर वर्णित के रूप में कम तापमान शर्त के तहत cleaved जब चित्रा 6B में दिखाया गया है, TFA प्रेरित गिरावट की मात्रा बहुत दबा दिया जाता है. ऐसी दरार के तंत्र को पिछले साहित्य 24 में वर्णित किया गया है, और यह एक oxazolidine मध्यवर्ती के माध्यम से जाने के लिए माना जाता है. पीटीए अणुओं एमएस / एमएस द्वारा अनुक्रम किया जा सकता और चित्रा 6C के रूप में दिखाया विखंडन पैटर्न, पेप्टाइड्स और peptoids के समान है. साथ (एस)-2-bromopropanoic आम तौर पर एसिड डी 4 जी संश्लेषित पीटीए अणुओंकारण ऐसे-2-bromopropanoic (एस) के रूप में एसिड डी 3 अधूरा deuteration उत्पादों (आंकड़े 7A और 7B) की उपस्थिति के एमएस और एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा पर व्यापक शिखर ive. इस अनुक्रमण प्रक्रिया के दौरान (amination दौरान एस से उल्टे) आर chiral केंद्र की उपस्थिति का एक संकेत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हम यह भी है कि पीटीए अणुओं इसलिए कम सोडियम पानी (जैसे dionized पानी के रूप में) और प्लास्टिक तंत्र (चित्रा 7C) पसंद कर रहे हैं, peptoid / पेप्टाइड से अधिक sodiated adducts फार्म की प्रवृत्ति है पाया. द्वारा उत्पाद पीटीए संश्लेषण में देखा जा सकता है कि एक और amination दौरान ब्रोमाइड के उन्मूलन (चित्रा 7C) से गठित acrylamide है. Acrylamide का गठन हो जाने के बाद, अनुक्रम समाप्त होता है. इस समाधान का क्षारकता कम करने के लिए 1 मीटर प्राथमिक amine की एकाग्रता कम करके हल किया जा सकता है. हम प्रत्येक acylation कदम के बाद chloranil परीक्षण प्रदर्शन और जन Spectr उपयोग करने की अनुशंसापुस्तकालय की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक amination कदम के बाद उत्पाद की जाँच oscopy.

चित्रा 1
पेप्टाइड, peptoid, पीटीए और एन methylated पेप्टाइड का आंकड़ा 1. स्ट्रक्चरल तुलना. पीटीए पेप्टाइड (नि. = 2 एच) भी शामिल है, peptoid (नि. = 1 एच) और एन methylated पेप्टाइड (आर 1 ≠ एच, 2 आर मुझे =) . बी) पीटीए के कारण दो α-पक्ष श्रृंखला के बीच sterical बाधा को पार एमाइड बांड रचना पसंद करती हैं. सी) पीटीए की वजह से भी परमाणु विकल्प और α-पक्ष श्रृंखला के बीच 1,3 allylic तनाव के लिए एक पसंदीदा रचना है. के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने.


Peptoid की चित्रा 2. उप मोनोमर संश्लेषण (नि. ­ 1 = एच) और पीटीए (आर 1 ≠ एच). सबसे पहले कदम की amine एसिड acylation है. दूसरे चरण के प्राथमिक amines के साथ amination है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. रिएक्शन सेटअप. एक 250 मिलीलीटर तीन गर्दन दौर नीचे कुप्पी एक सूखी बर्फ / इथाइलीन ग्लाइकॉल स्नान में डाल दिया है. मध्य गर्दन छोड़ने कीप equalizing एक 150 मिलीलीटर के दबाव के साथ जुड़ा हुआ है. बाएँ और दाएँ गर्दन एक प्रवाह नियंत्रण अनुकूलक और एक पट डब्ल्यू के साथ सील कर रहे हैंआर्गन प्रवाह के माध्यम से पारित की अनुमति देता है कि एक लंबी सुई रबर. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. विभाजन और पूल संश्लेषण की मूल बातें. खाली मोती अभिकारक एक साथ अलग से इलाज तीन भागों में विभाजित कर रहे हैं, बी और सी पहली प्रतिक्रिया के बाद, मोतियों के सभी तीन भागों में एक साथ और मिश्रित जमा कर रहे हैं. जमा मोती तीन भागों में फिर से विभाजित है और फिर प्रत्येक व्यक्ति के हिस्से के लिए एक ही अभिकारक के साथ व्यवहार कर रहे हैं. दूसरी प्रतिक्रिया के बाद, 9 विभिन्न यौगिकों संश्लेषित कर रहे हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.


चित्रा 5. लाइब्रेरी संरचना सिंहावलोकन. तीन पीटीए pentamer peptoid linker के बाद संश्लेषित कर रहे हैं. सैद्धांतिक विविधता, 3 3 एक्स 7 3 = 9261. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
चित्रा 6.. ए) Trimer पीटीए कमरे के तापमान के तहत 50% TFA / डीसीएम द्वारा cleaved एक पीटीए trimer की विशिष्ट MALDI जन स्पेक्ट्रा. के रूप में दिखाया पीटीए संरचना, [एम 1] + = 1077, [एम + ना] + = 1,098.9, TFA दरार से पीटीए विखंडन स्पष्ट रूप से स्पेक्ट्रम. बी) Trimer cleav पर देखा जा सकता हैपत्र में वर्णित के रूप में अनुकूलित शर्त के तहत 50% TFA / डीसीएम द्वारा एड. TFA-प्रेरित एसिड गिरावट बहुत पीटीए trimer की. सी) एमएस / एमएस स्पेक्ट्रम दबा दिया जाता है. कमजोर Y7 (916) संकेत मनाया जाता है, इस पीटीए के लिए एक विशिष्ट विखंडन व्यवहार है. स्पेक्ट्रा विश्लेषण किया और mMass 32 द्वारा उत्पन्न. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 7
समस्थानिक लेबल monomer और द्वारा उत्पादों ठेठ साथ पीटीए संश्लेषण की चित्रा 7. MALDI स्पेक्ट्रा. ब्लू द्वारा संश्लेषित पीटीए अणुओं का एक) एमएस स्पेक्ट्रा तुलना: (नि.)-2-bromopropanoic [एम 1] + = 760 [एम + ना] + = 787 [एम + कश्मीर] + = 803 और लाल: (एस) - 2 bromopropanoic एसिड डी 4 [एम 1] + = 764 [एम + ना] + = 783 [एम + कश्मीर] + = 799. बी) ए में दिखाया दो अणुओं के एमएस / एमएस विखंडन पैटर्न). . एक पीटीए के स्पेक्ट्रम: कारण डी 1, डी 2 और डी 3 मसाले (alanine का अधूरा deuteration), द्वारा (एस)-2-bromopropanoic एसिड डी 4 संश्लेषित अणुओं की उपस्थिति के लिए आम तौर पर सी) लाल व्यापक चोटियों दे कि नोट डिमर संश्लेषित और अनुकूलित शर्त के तहत cleaved. ब्लू:. पीटीए डिमर 2 एम methoxyethylamine समाधान के साथ संश्लेषित और सामान्य फ़िल्टर्ड पानी में cleaved इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

पेप्टाइड तृतीयक amides (पीटीए) peptidomimetic oligomers की एक superfamily हैं. अच्छी तरह से अध्ययन पेप्टाइड्स, peptoids और एन methylated पेप्टाइड्स इसके अलावा, इस परिवार के भीतर यौगिकों का एक बड़ा हिस्सा एक किराए के कारण जनरल एन alkylated पेप्टाइड्स का उपयोग करने के लिए कृत्रिम विधि की कमी के कारण, understudied बनी हुई है. यहाँ हम अमीनो एसिड से प्राप्त chiral इमारत ब्लॉकों के साथ पीटीए synthesize करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन. इससे पहले, हम पीटीए अणुओं 23 के संश्लेषण के पुस्तकालयों के लिए एक नई उप मोनोमर मार्ग का उपयोग करने की सूचना दी है. हम पीटीए रीढ़ की हड्डी के माध्यम से गठनात्मक restrains के अधिकारी जो उच्च संरचित oligomers हैं कि पता चला है. विवो में जब जांच की, पीटीए अणुओं सुधार सेल पारगम्यता और इसलिए सुधार गतिविधि 25 से पता चला है. हालांकि, के साथ सभी लाभ के साथ, पीटीए भी एक किराए रुकावट पदों पर माध्यमिक एमाइंस acylation से, कुछ सिंथेटिक चुनौतियों के साथ आते हैं. गठनात्मक प्रदान करता है जो α साइड चेनप्रतिबंध भी निम्न युग्मन कदम के लिए steric बाधा लाता है. इन सिंथेटिक चुनौतियों पर काबू पाने के क्रम में, हम एक व्यापक अनुकूलन अध्ययन का प्रदर्शन किया और इस प्रतिक्रिया के लिए 23 सर्वश्रेष्ठ युग्मन अभिकर्मक के रूप में बीटीसी निर्धारित की.

सिंथेटिक मार्ग का महत्वपूर्ण कदम बीटीसी माध्यमिक amine की acylation मदद की है. इस प्रक्रिया के दौरान, बीटीसी सीटू 26,27 में एक एसिड क्लोराइड की पीढ़ी सक्षम बनाता है. मध्यवर्ती के रूप में सक्रिय एस्टर या एसिड anhydrides या तो फार्म जो अधिकांश अन्य युग्मन अभिकर्मकों, निरंतर पीटीए संश्लेषण के लिए स्वच्छ acylation प्रदान करने में विफल रहा है. पिछले पीटीए इकाइयों का अस्तित्व बहुत कारण steric बाधा को निम्नलिखित पीटीए इकाई के युग्मन दक्षता impairs. इसलिए, कई पीटीए, एक छोटे छोड़ने के समूह के साथ एक अत्यधिक सक्रिय मध्यवर्ती के संश्लेषण के लिए दृढ़ता से पसंद किया जाता है. बीटीसी bes के कामों से हम परीक्षण किया है कि सभी युग्मन शर्तों के अलावा, बगल में एसिड क्लोराइड उत्पन्नहमारे हाथ में टी. हालांकि, यहां तक ​​अत्यधिक सक्रिय एसिड क्लोराइड के साथ, हम पहले से परीक्षण किया जब तक इस तरह के पुस्तकालय संश्लेषण में α-branched प्राथमिक amines के रूप में अत्यधिक sterical रुकावट amines से बचने के लिए सलाह देते हैं. ऐसे मरियल के रूप में सुगंधित amines अक्सर अधूरी प्रतिस्थापन के लिए नेतृत्व और इस प्रकार भी बचा जाना चाहिए. बीटीसी युग्मन चरण के दौरान, समाधान हमेशा नारंगी रंग के लिए एक हल्के पीले होना चाहिए; एक गहरे रंग का समाधान overheating का एक संकेत है और कम उपज और द्वारा उत्पादों की वृद्धि के गठन में हो सकता है. यह आम तौर पर बीटीसी समाधान के आगे ठंडा करके हल किया जा सकता है, प्रतिक्रिया का आकार और सक्रिय बीटीसी / एसिड समाधान के लिए तेजी से हस्तांतरण को कम. बीटीसी के अलावा, एन Ethoxycarbonyl-2-ethoxy -1 ,2-dihydroquinoline (EEDQ) पीटीए संश्लेषण में अच्छी तरह से काम करता है कि एक और युग्मन अभिकर्मक है. कुंजी मध्यवर्ती एक अपेक्षाकृत छोटे छोड़ने के समूह के साथ एक मिश्रित कार्बोनिक एनहाइड्राइड है. EEDQ के मामले में, EEDQ के 3 बराबर तो डीसीएम में एसिड और एपी के साथ एक साथ भंग कर रहा हैकमरे के तापमान पर मोती plied. प्रतिक्रिया सामान्य रूप से हल्के झटकों के साथ 2 घंटे के भीतर किया जाता है. यह प्रतिक्रिया प्रतिक्रिया के दौरान सीओ 2 विज्ञप्ति; इसलिए प्रतिक्रिया प्रणाली बंद नहीं किया जाना चाहिए.

एक और महत्वपूर्ण कदम दरार और पीटीए अणुओं के लक्षण वर्णन है. MALDI-MS/MS (चित्रा 6) के माध्यम से पीटीए अणुओं अनुक्रमण जब एक विशिष्ट एमएस / एमएस विखंडन पैटर्न देखा गया है. यह (चित्रा 6C में बैंगनी में दिखाया गया है और Y6, Y5, Y4, बी 2, बी 3 आयनों की वृद्धि की तीव्रता) पिछले y आयन के एक कम तीव्रता के साथ होते हैं. अनुरूप पैटर्न पिछली रिपोर्ट 28 में एन methylated पेप्टाइड विखंडन से मनाया गया है. कारण मध्यवर्ती oxazolidine की वृद्धि की स्थिरता के लिए, एन methylated पेप्टाइड्स मजबूत बी आयनों 28 दे देते हैं. इसके अलावा, यह अच्छी तरह से, एन methylated पेप्टाइड TFA दरार और MALDI जन स्पेक्ट्रोस्कोपी 24 दोनों के दौरान एसिड अस्थिर जाना जाता है कि28, 29. यंत्रवत अध्ययन की वजह से रीढ़ की हड्डी पर गठनात्मक प्रतिबंध को पूर्ववर्ती अवशेषों की कार्बोनिल ऑक्सीजन परमाणु इस प्रकार मध्यवर्ती 29 oxazolidine के गठन को बढ़ावा देने, दरार स्थल पर कार्बोनिल समूह की निकटता में अक्सर होता है कि दिखाया गया है. उपरोक्त कारणों के लिए, दोनों पीटीए और एन methylated पेप्टाइड्स TFA 26, 30 से नियंत्रित सांद्रता का उपयोग कम तापमान पर ठोस समर्थन से cleaved करने की आवश्यकता है. हमारे अनुभव में, व्यक्तिगत पीटीए अवशेषों के लिए सबसे सुविधाजनक दरार विधि 50% TFA / डीसीएम के एक पूर्व ठंडा, -20 डिग्री सेल्सियस समाधान के साथ -20 डिग्री सेल्सियस पर होता है. यह प्रक्रिया बहुत एसिड अपमानित उत्पादों के गठन को दबा.

इस तकनीक के माहिर के बाद, आदि leucine, फेनिलएलनिन, glutamine, जैसे अन्य प्राकृतिक एमिनो एसिड से प्राप्त पीटीए मोनोमर साथ पुस्तकालय के रूप में अच्छी तरह से संश्लेषित किया जा सकता है. एक उच्च गुणवत्ता पीटीए पुस्तकालय एजी जांच की जा सकतीहमारे पहले प्रकाशित पर मनका प्रदर्शन के प्रोटोकॉल 31 का उपयोग करते हुए विभिन्न प्रोटीन लक्ष्य ainst. स्क्रीनिंग से पहचान यौगिकों मारो जन स्पेक्ट्रोस्कोपी की विशेषता है और ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर आगे की परीक्षा के लिए resynthesized किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgements

लेखकों बहुमूल्य सहायता के लिए डॉ. Jumpei Morimoto और डॉ. टोड Doran धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम NHLBI (NO1-HV-00242) से एक अनुबंध द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4,6 trimethylpyridine ACROS 161950010 CAS:108-75-8
2-morpholinoethanamine Sigma-Aldrich 06680 CAS:2038-03-1  
48% HBr water solution ALFA AESAR AA14036AT CAS:10035-10-6
Acetaldehyde Sigma-Aldrich 402788 CAS:75-07-0  
Acetonitrile Fisher SR015AA-19PS CAS:75-05-8
Anhydrous tetrahydrofuran (THF) EMD EM-TX0277-6 CAS:109-99-9
Benzylamine Sigma-Aldrich 185701 CAS:100-46-9
bis(Trichloromethyl) carbonate (BTC) ACROS 258950050 CAS:32315-10-9
Bromoacetic acid ACROS 106570010 CAS:79-08-3
Chloranil Sigma-Aldrich 23290 CAS:118-75-2
Cyclohexanemethylamine Sigma-Aldrich 101842 CAS:3218-02-8
D2O Cambridge Isotope DLM-4-99.8-1000 CAS:7789-20-0
D-Alanine Anaspec 61387-100 CAS:338-69-2
Dichloromethane (DCM) Fisher BJ-NS300-20 CAS:75-09-2
Dimethylformamide (DMF) Fisher BJ-076-4 CAS:68-12-2
Ethylene glycol Oakwood 44710 CAS:107-21-1
Isopentylamine Sigma-Aldrich W321907 CAS:107-85-7
KBr ACROS 424070025 CAS:7758-02-3
L-Alanine Anaspec 61385-100 CAS:56-41-7
3-Methoxypropylamine Sigma-Aldrich M25007 CAS:5332-73-0
2-Methoxyethylamine Sigma-Aldrich 143693 CAS:109-85-3
N-(3-Aminopropyl)-2-pyrrolidinone Sigma-Aldrich 136565 CAS:7663-77-6 
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) ACROS 115211000 CAS:693-13-0
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Sigma-Aldrich D125806 CAS:7087-68-5
NaNO2 ACROS 424340010 CAS:7631-99-4
NAOD 40% solution in water ACROS 200058-506 CAS:7732-18-5
Piperidine ALFA AESAR A12442-AE CAS:110-89-4
Piperonylamine Sigma-Aldrich P49503 CAS:2620-50-0
Propylamine Sigma-Aldrich 240958 CAS:107-10-8
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537 CAS:76-05-1
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich 39468 CAS:28166-41-8  
α-Ketoglutarate ALFA AESAR AAA10256-22 CAS:328-50-7
Tentagel Resin with RINK linker Rapp-Polymere S30023
Alanine transaminase Roche 10105589001 AKA: Glutamate-Pyruvate Transaminase (GPT)
Incubator New Brunswick Scientific Innova44
NMR Bruker 400 MHz
MALDI mass spectrometer Applied Biosystems 4800 MALDI-TOF/TOF
Lyophilizer SP Scientific VirTis benchtop K
Syringe reactor INTAVIS Reaction Column 3 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml
Vacuum manifold Promega A7231 Vac-Man

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References

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