Split-and-piscina Síntese e Caracterização de Peptídeos Terciário Amide Biblioteca

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como sintetizar bibliotecas combinatórias contendo peptídeos terciários em meio ou unidades PTA. Isso é feito preparando primeiro um submonômero PTA a partir de aminoácidos naturais. O segundo passo é sintetizar uma região de ligação peptídica em um suporte sólido.

Em seguida, uma biblioteca combinatória contendo subunidades de PTA e peptídeos é sintetizada. A etapa final é caracterizar a biblioteca sintetizada para garantir a qualidade da síntese. Em última análise, uma biblioteca combinatória contendo subunidades de PTA restritas de confirmação é sintetizada e tal biblioteca pode ser usada para triagem de alto rendimento para fornecer ligantes de proteínas e levar à descoberta de novos medicamentos.

Portanto, a química que é o assunto deste artigo foi desenvolvida na tentativa de tentar encontrar moléculas que fossem muito mais rígidas do que alguns dos peptídeos e outras coisas com as quais trabalhamos anteriormente. A ideia é que, se alguém identificar bibliotecas de moléculas mais rígidas, elas se ligarão a alvos de proteínas com afinidades muito maiores, achamos que isso era muito, muito importante na tentativa de desenvolver drogas no futuro ou, ou mesmo moléculas de sonda interessantes. A demonstração visual desta síntese de subordem PTA é realmente crítica, pois a síntese é difícil de aprender porque a temperatura e o controle de tempo são realmente críticos para uma síntese bem-sucedida.

Primeiro, adicione 8,9 gramas de dine e 11,9 gramas de brometo de potássio a um frasco de fundo redondo de 500 mililitros e três gargalos com uma barra de agitação magnética. Em seguida, adicione 100 mililitros de uma solução de brometo de hidrogênio a 30% previamente preparada ao frasco. Depois de colocar o frasco em etilenoglicol negativo a 10 graus Celsius, faça borbulhar argônio em banho de gelo seco através de uma agulha longa do fundo do frasco por 10 minutos.

Agitou a solução com a barra de agitação magnética a 300 RPM. Em seguida, adicione uma solução de nitrito de sódio previamente preparada a um funil de gotejamento de equalização de pressão preso ao frasco de fundo redondo de três gargalos e sele-o com um septo. Abrir lentamente a válvula do funil de gota, deixando pingar a solução de nitrito de sódio para o balão.

Controle a válvula para ajustar a taxa de gotejamento para aproximadamente duas gotas por segundo. Após a adição de nitrito de sódio estar completa, continue mexendo a solução por mais três horas, permitindo que a temperatura aqueça de 10 graus Celsius negativos à temperatura ambiente. Se a cor da solução for muito escura, aplique um vácuo para remover o excesso de óxidos de nitrogênio e possível bromo gerado durante a reação.

Uma vez transferida a solução para um funil de extração, extrair o produto três vezes com 35 mililitros de éter datilo. Depois de combinar a fase orgânica e lavar com salmoura saturada, recolher para um balão e secar sobre sulfato de sódio durante seis horas. Após a filtração do sulfato de sódio, evaporar o solvente sob vácuo para obter um óleo límpido a amarelo pálido.

Purificar o produto bruto por cromatografia em coluna de sílica gel com acetato de etila hexano de três a um para marcação isotópica, dissolver 300 miligramas de L alanina com 10 mililitros de água deuterada em um tubo de polietileno de 50 mililitros. Depois de adicionar 10 miligramas de alfa-cetoglutarato como substrato de cos, aqueça o tubo a 37 graus Celsius. Quando terminar, ajuste o pH para 8.5 a 8.7 usando uma solução de óxido de duto de sódio de um molar e tiras de teste de pH.

Em seguida, adicione 0,1 miligramas de alanina transaminase à solução. Coloque o tubo em uma incubadora a 37 graus Celsius e incubado durante a noite com agitação leve de 10 a 30 RPM. Neste ponto, inche um grama de 90 mícrons, 10 para gelar grânulos com ligante Ram em 10 mililitros de dimetilformamida por três horas em um reator de seringa de 12 mililitros com agitação leve, drene a dimetilformamida do reator e adicione 10 mililitros de solução de perine dimetilformamida a 20% pi para proteger o grupo FOC da pista em meio ao ligante.

Depois de agitar as contas com a solução de 20% de Pepperdine por 30 minutos, lave-as cinco vezes com carne dimetil forma para remover todo o Pepperdine. Em seguida, remova algumas esferas da seringa e teste-as com um teste de cloral. Adicione dois mililitros de uma solução de dimetilformamida de ácido bromoacético de dois molares às contas e agite suavemente.

Em seguida, adicione dois mililitros de uma solução de dimetilformamida de dimetilformamida de diop propilpropil-diamina de dois molares às contas. Depois de selar a seringa com um êmbolo, agite as esferas em uma coqueteleira por 10 minutos. Uma vez que as esferas tenham sido bem lavadas com dimetilformamida, adicione dois mililitros de uma solução molar de metoxi etil dimetilformamida previamente preparada.

Depois de agitar as contas e lavá-las cinco vezes com dimetilformamida, verifique algumas das contas com um teste de cloral. Em seguida, adicione 10 mililitros de uma solução de dimetilformamida de dicloro metano um-para-um à seringa usada anteriormente. Divida todas as esferas de um grama uniformemente em três reatores de seringa de cinco mililitros usando uma pipeta de 1000 microlitros com uma ponta de pipeta truncada.

Depois de lavar as três seringas três vezes com clorometano, lave as seringas marcadas com r e s três vezes com hidrofurina anidra e a seringa marcada com B três vezes com dimetilformamida. Para o acoplamento de tristina do ácido bromo propano NOIC, adicione aproximadamente 200 miligramas de tristina a um frasco para injetáveis em uma capela de exaustão. Uma vez tampado o frasco, pese a quantidade de tristina no frasco.

Em seguida, adicione a quantidade apropriada de tetra hidroferran anidro ao frasco para fazer uma solução de 20 miligramas por mililitro de tetra hidroferran de trifosgênio. Para preparar a mistura de trifosgênio de bromoácidos, adicione 89 microlitros de R dois ácido Bromo propano NOIC e S dois Bromo propano ácido NOIC D quatro em dois pequenos frascos separadamente a cada frasco, adicione cinco mililitros da solução de tristina tetra hidrofurano. Depois de selar os frascos, coloque-os em um freezer negativo de 20 graus Celsius por 20 minutos.

Enquanto isso, adicione 1.125 microlitros de uma solução de dois a um tetra hidro furano di isopropil amina à seringa r e s. Separadamente, adicione 356 microlitros de 2 4 6 trimetil purina a cada um dos frascos contendo as misturas de fosgênio de bromoácidos resfriados que produzem precipitados brancos. Aplique imediatamente a suspensão correspondente diretamente nas esferas ificadas e, em seguida, coloque-as em uma coqueteleira para agitar abaixo de 120 RPM por duas horas.

Para acoplamento de ácido bromoacético com diisopropilcarbodiamina, adicione cinco mililitros de uma solução de dimetilformamida de ácido bromoacético de dois molares à seringa B.Depois de agitar, adicione cinco mililitros de uma solução de dimetilformamida de dipropilcarbodiamina de dois molares à mesma seringa e agite suavemente seguindo este lugar seringa B no mesmo shaker que a seringa r e s. Em seguida, agite as seringas durante duas horas depois de as ter lavado cuidadosamente com diclorometano e dimetilformamida. Agrupe todas as esferas das seringas R, s e B em um reator de seringa de 12 mililitros.

Depois de lavadas cinco vezes com dimetilformamida, adicione 10 mililitros de uma solução de diclorometano dimetilformamida um a um à seringa. Divida todas as esferas uniformemente em sete seringas individuais de dois mililitros usando uma pipeta de 1000 microlitros com uma ponta de pipeta truncada para emanação, adicione cinco mililitros de sete soluções de amina molar previamente preparadas à seringa correspondente. Incube todas as sete seringas em uma incubadora de 60 graus Celsius com agitação durante a noite após a incubação.

Lave as contas que precisam ser clivadas cinco vezes com di clorometano. Depois de agitar as contas 15 minutos e lavá-las novamente com di clorometano, drene o di clorometano da seringa. Em seguida, transfira cada conta individual para uma placa de 96 poços.

Usando um microscópio óptico e uma pipeta com ponta truncada, cubra a placa de 96 poços com uma lamínula e coloque-a no freezer de 20 graus Celsius negativos por 15 minutos. Uma vez que a placa tenha sido removida do freezer, adicione 20 microlitros de uma solução de clorometano TFA DI resfriada previamente preparada a cada um dos poços que contém um grânulo. Recoloque a lamínula e coloque a placa de parede 96 em uma coqueteleira de volta no freezer de 20 graus Celsius negativos.

Depois de agitar por 20 minutos, remova a placa de parede 96 do freezer e retire a lamínula. Seque o diclorometano de cada poço soprando ar sobre ele. Quando clivado sob temperatura ambiente usando uma solução de metano de 50% TFA DI CHLORO, uma degradação significativa é observada.

Os picos 593 e 484 correspondem ao ligante e ao trímero de PTA, respectivamente, mostrando que toda a molécula foi sintetizada com sucesso no grânulo, mas degradada durante a clivagem. Quando clivado sob condições de baixa temperatura, conforme descrito acima, a quantidade de degradação induzida por TFA é bastante suprimida. O mecanismo de clivagem foi descrito na literatura anterior e acredita-se que passe por um intermediário olaína, as moléculas de PTA podem ser sequenciadas por Ms.MS, e o padrão de fragmentação é semelhante a peptídeos e peptídeos.

As moléculas de PTA sintetizadas com S, dois, bromo, propólo, ácido D quatro, geralmente fornecem picos mais amplos em MS e msm. Ms.Spectra devido à presença de produtos de duração incompleta, como S dois bromo propano, ácido NOIC D três, isso poderia ser usado como uma indicação da presença do centro R Chiral durante o procedimento de sequenciamento, as moléculas de PTA também tendem a formar mais aduto do que o peptídeo peptídico. Portanto, água com baixo teor de sódio e aparelhos de plástico são preferidos.

Outro subproduto potencial é a acrilamida formada a partir da eliminação de bromo durante a aminação. Uma vez que a acrilamida é formada, a sequência é encerrada. Isso pode ser resolvido diminuindo a concentração de amina primária para um molar, a fim de reduzir a solução.

Basicidade Uma vez dominada uma biblioteca de bom tamanho, pode ser preparada em dois dias se for executada corretamente. Agora que essa química foi totalmente desenvolvida e a síntese é bastante eficaz, espero que outros pesquisadores adotem essa poderosa tecnologia para fazer miméticos de peptídeos conformacionalmente restritos para o desenvolvimento de medicamentos e desenvolvimento de sondas.