における機能のパフォーマンスを評価する

Behavior

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Summary

神経筋疾患のための臨床試験における主要評価項目は、通常、筋肉の機能を向上させることができる。従って、マウスモデルにおいて、臨床的にあらかじめ筋性能に対する潜在的な治療化合物の効果を評価することは非常に重要である。ここでは、この問題に対処するためのいくつかの機能テストを記述します。

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Aartsma-Rus, A., van Putten, M. Assessing Functional Performance in the Mdx Mouse Model. J. Vis. Exp. (85), e51303, doi:10.3791/51303 (2014).

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Abstract

デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は、治療法は利用できないため、重度かつ進行性の筋消耗障害である。それにもかかわらず、いくつかの潜在的な医薬化合物および遺伝子治療アプローチは、臨床試験に進んでいる。筋肉機能の改善は、これらの試験で最も重要なエンドポイントであると、強調の多くは、信頼性の設定に置かれた、再現性、および機能テストを行うことが容易で事前に臨床的に筋機能を評価するため、強さ、状態、および調整でDMD のMDXマウスモデル。両方の浸潤性および非侵襲性のテストが用意されています。病気を悪化しないテストは、疾患の自然経過および治療 ​​的介入( 例えば 。前肢握力試験、ワイヤまたはグリッドとロータロッド走行のいずれかを使用して2つの異なる吊り試験)の効果を決定するために使用することができる。あるいは、強制トレッドミル走行は、疾患の進行を増強および/または評価するために用いることができる疾患病理に対する治療的介入の保護効果。ここでは、信頼性と再現性のある方法でこれらの最も一般的に使用される機能テストを実行する方法について説明します。標準作業手順に基づいて、これらのプロトコルを使用すると、異なる研究所間でのデータの比較が可能になります。

Introduction

デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は1:5,000新生児の男の子に影響を与える最も一般的な神経筋疾患である。この重度および進行性の筋消耗疾患は、オープンリーディングフレームを破壊し、機能性ジストロフィンタンパク質の合成を防止するDMD遺伝子の変異によって引き起こされる。ジストロフィンを欠損する筋線維は、誘発された損傷を行使する脆弱性が存在します。筋肉の再生能が消耗すると、損傷を受けた筋肉の慢性炎症に起因する、繊維は、その後、機能の損失につながる、結合組織および脂肪で置換されている。一般的には、DMD患者は、二十年の初期の下肢の歩行を失う。その後、また腕や肩帯の筋肉が影響を受けている患者は、しばしば脊髄を支える筋肉の非対称弱体化に胸腰椎脊柱側弯症を開発しています。補助換気は一般的に十代後半や20代前半が必要である。呼吸や心臓の障害リード第三又は第四十年1死まで。

原因遺伝子は、25年以上前に2が発見されたが、DMDのために利用可能な治療法はありません。ただし、健康管理を改善し、コルチコステロイドの使用は、西洋の世界3で平均寿命を増加している。 mdxマウスのような動物モデルを用いて、前方の潜在的な治療戦略の発見への主要な工程が行われている。 mdxマウスは、最も一般的に使用されるDMDのマウスモデルである。それは、マウスDMD遺伝子のエクソン23に点変異を有し、その結果、ジストロフィン4を欠いている。ここ数年、多くの提案された戦略は、臨床試験5-9に進んでいる。これらの試験では、筋機能の改善は、検査の前臨床段階でのマウスで筋機能に対する化合物の利点をテストすることの重要性を根底に、主要評価項目である。

DMDのような患者はまた、mdxマウスのジストロフィン陰性筋線維が誘発される損傷を行使する脆弱であり、それらの筋肉機能をC57BL/10ScSnJ野生型マウスと比較して損なわれている。この障害は、機能テストの様々な評価することができる。これらのテストのいくつかは、非侵襲的であり、筋肉の病理( 例えば 、前肢握力、テスト、ロータロッドランニングをぶら下げ)に干渉しない。したがって、それらは、疾患の自然経過を監視したり、疾患の進行に対する化合物の効果を決定するために使用することができる。 mdxマウスにおける筋機能に対する化合物の影響の深さの画像を得るために、これらのテストの全てからなる疾患の進行を妨げない機能的なテスト体制は、10を使用することができます。

あるいは、強制トレッドミル走行を意図的に疾患の進行を悪化させ、化合物11の保護能力を試験するために使用することができる。トレッドミルにもすることができます彼らは治療群13の性能の大きな違いを確実に後続の機能試験であまりうまく機能するように枯渇するまでの時間を実行しても12を測定したり、疲労MDXマウスためのツールとしてされているアウトカム指標として使用されます。機能テストを選択するときには、病気の進行への影響は、mdxマウス 14のようなジストロフィーマウスをテストする場合は特に注意が必要です。

ここでは、TREAT-NMDネットワークから利用可能な標準的な操作手順に基づいて、信頼性と再現性のある方法で最も一般的に使用される機能テストを実行する方法を詳細に説明します。 TREAT-NMDここをクリックし

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Protocol

ここで説明する実験は、ライデン大学医療センター(LUMC)の動物倫理委員会(12月)により承認された。マウスは、LUMCの動物施設で飼育し、12時間の明暗サイクルで個別換気ケージの中で飼育した。彼らは、水と標準飼料への不断のアクセスを持っていた。

以下に記載の機能試験のいずれかを行う際に、実験条件は厳密にばらつきを低減するように制御されなければならない。パフォーマンスは、年齢や性別で異なるように好ましくは、年齢や性別適合マウスを使用すべきである。同じゴミに属するマウスは実験群の上にランダム化されるべきである。動物は、実験グループを知らされていないのと同じオペレータによってテストする必要があります。試験は、個々のマウスおよび時点間の大きな変動が14すべてについて観察することができるなど 、その日およ ​​び曜日の同じ時間に行われ、臭気を等化する同じ部屋、ノイズされるべきである機能テストは、したがって、6〜8匹のマウス/実験群を使用する必要があります。機能テスト性能も大きく異なる近交系、野生型株との間で異なることができる。そのため、実験およびコントロール野生型マウスでは、常にバックグラウンドに対応している必要があります(MDXマウスの場合C57BL/10ScSnJ野生型株を使用してください)。ここに記載されているすべてのデータは、我々がここにから野生型を参照C57BL/10ScSnJ野生型株、得られている。ここで説明する試験は、 のmdxマウスおよび野生型マウスにおける加齢の少なくとも1〜19ヶ月から長手方向に使用することができる。テストは、関心とタスクを実行する意欲を失ってからマウスを防ぐために、週に複数回繰り返されるべきではありません。

1。前肢握力テスト

前肢の強度を測定するために前肢握力テストを使用。テストは尾15で吊り下げたときに本能的にグリッドを把握するマウスの傾向に基づいており、adapteさからD DMD_M2.2.001.pdf

  1. この装置は、最大セット:プル時にグリッド上でマウスで適用される最大の力を測定する力変換器、グリッドを取り付けます。設定は引きのピークテンションモード(T-PK)であることを確認します。力の単位は、いずれかの情報オブ力、グラム重の力、重量ポンドの力、キログラムオブ力、又はニュートン単位で調整することができる。
    注:私たちは、値の単位としてグラムと働くことを好む。複数のメーターは市販されているが、レバー式力変換器は負レバー効果の物理法則によって影響されるだけ軸方向変換器は、信頼性の高い結果を得た。非柔軟性グリッド又は三角形のいずれかは、直径1〜2mmであるバーを使用することができる。
  2. 試験の前に、体重のための正規化を可能にするために、マウスの体重を評価する。
  3. 値の単位としてグラムを使用してください。各RECOの開始時にメーターをリセットrding。
  4. しっぽをつかんで、グリッドに向けて水平に移動することで、そのケージからマウスを外します。
  5. マウスが両方の前足でしっかりとグリッドを把握していることを確認してください。
  6. その把握が壊れているように、離れてグリッドからマウスを引っ張って、グリッドに印加される最大力は、手動または自動で記録することができ、変換器のディスプレイ上に表示されます。
  7. マウスは、実験者への耐性を示しているにおいて考慮引っ張るだけを取る。唯一の1前足、または後肢を使用しているマウスは、プル時になってされた措置を拒否します。
  8. マウスがグリッドを連続で3回引いて1分以上の休止期間、ケージ内に戻ってみましょう(注)。一連の間休止期間を引き、マウスが回復し、習慣の形成を回避することが必要である。
  9. その後、マウスを引っ張るの4つのシリーズ、短い休息期間が続くそれぞれを実行してみましょう。このように覚書Eは15倍(3引っ張る×5回= 15引っ張る)の合計を引いています。
  10. 最大握力を決定し、収集した15の値から3の最高値の平均をとることによって、体重を標準化。
  11. オプション:最初の2の平均と引っ張る1 +2 +3 = A、4 +5 +6 = B、10 +11 +12 = Cおよび13 +14 +の最後の2シリーズ間の減少分を算出することで疲労を決定します15 = D.式:(C + D)/(A + B)が疲労していないマウスのための1の値を与える。疲労のないマウスが0%の値および前肢が完全に100%の値を有し、疲労しているマウスを有するように、これは、パーセンテージで表すことができる。

2。ハンギングテスト

ぶら下がり試験、バランス調整及び筋条件と評価することができる。これらのテストは、マウスが枯渇16までのワイヤまたはグリッドに掛かったままに熱望しているという知識に基づいています。試験開始時に2つの特徴的な吊りテストがどちらかあります2前肢または四肢のみが、それぞれのワイヤグリッドを使用して、使用されている。ワイヤーグリッドを使って吊り下げ試験はから適応最長中断時間法であるDMD_M.2.1.004.pdfDMD_M.2.1.005.pdfそれぞれ。固定ぶら下げ制限は600秒で使用されている。ジストロフィーマウスはできませんが、野生型マウスの大多数は、600秒間ハングアップすることができます。この試験を行う時の費用を削減するために、最大吊り時間が所定の位置にセットした。その前に、ワイヤグリッドから落ちるマウスは2回までは試行まで与えられている。これは、マウスがハングアップすることが本当にできず、原因不器用に該当しないことを再保険するために行われます。

  1. 2手足でテストをぶら下げ
    1. 装置のセットアップ、密テープで棚に2mm厚の金属布ハンガーを確保し、約37ハンガーを維持0;寝具の層の上のCM。注:または、しっかりと2垂直スタンドの間に固定されている広い2ミリメートルの厚さの金属線55センチメートルを使用することができる。 37センチメートルの距離が吊り下げたままにしたマウスを奨励するのに十分なだけでなく、落下時の怪我からマウスを防ぐのに十分に低い。ワイヤーが振動したり、これはマウスの性能を妨害する可能性があるので、テスト中に移動させるべきではありません。
    2. 尾を経由して、マウスを処理し、電線の近くに持ってきて。
    3. マウスのみ2前足でワイヤーをつかみましょう、とマウスだけワイヤ上の2前肢( 図2B)でハングアップするように、後肢を下げる。
    4. マウスが離されたときに直接タイマーを開始する。リリース後に、強力なマウス( 図2C)許可されているすべての四肢と尾、とワイヤーをキャッチしてみてください。
    5. マウスバランシングまたは故意SH、ワイヤから飛び降りるような(不適切な挙動を示している場合には) 図2D及び2Eに所有し、直接タイマーを停止することなく、ワイヤ上でマウスを交換することによってこの問題に対処。
    6. マウスが電線から落ちたときに、タイマーを停止し、吊り時間を記録。
    7. マウスは600秒間ハングすることがある場合は、線材を、それらを脱いで、ケージに戻す。この制限の前に落ちるのマウスは2回までは試行の最大を与えられている。
    8. (試験の最長IE)の最大吊り時間を記録し、さらなる分析のためにこれを使います。
  2. 四肢でテストをぶら下げ
    1. 装置は、最大セット:いずれかを使用正方形またはこのテストのために、ラットやウサギの大きなケージの蓋造り手。落下時に自分自身を傷つけるからマウスを防ぐために、25センチメートル柔らかい寝具の上にグリッドを配置するだけでなく、意図的にグリッドをオフにジャンプするマウスを阻止する。実験者は、これらの動きは、私かもしれませんが、手動で実験中にグリッドを保​​持する必要がないように、しっかりとグリッドを確保マウスのパフォーマンスにnterfere。
    2. それは、その4本の足でそれを把握するようにグリッド上にマウスを置きます。
    3. マウスがハングしているように、グリッドを反転し、直接、タイマーを開始します。
    4. テストセッションは、600秒の間、ハングアップすることが可能であるマウスのために終了します。グリッドから2回までは試行の初期の最大立ち下がりマウスを与える。
    5. さらなる分析のために、最大吊り時間( すなわち 。試験の最長)を使用しています。

3。ロータロッドランニング

ロータロッド試験筋力と、協調、バランス、条件は17を決定することができる。

  1. この装置は、最大セット:このテストでは、マウスが回転チューブ上で実行する必要があります。安定した速度は毎分5回転(rpm)に設定されていることを確認し、最初の15秒での5-45 RPMから回転数が上昇を開始したときに。この後、それはその速度を維持しなければならない。
  2. ロータロッドのチューブにマウスを置くそれは5回転の遅い一定の速度で回転する。 5匹のマウスを同時に試験することができる。
  3. 一度にすべてのマウスが配置されているファイル名を指定して実行を開始します。最初の15秒以内の管の速度は、それがその速度を維持した後、5〜45回転から加速します。
  4. 実行を監視します。稼働時間は、継続的にソフトウェアで記録されている。これは、チューブの下方に位置するタイムバーをアクティブにし、マウスがチューブから落下するときの時間を実行すると、自動的に停止します。回転させるためにチューブを停止することなく、実行中のチューブには逆方向を向いている向きを変え、マウスの位置を変更。
  5. 500秒の間、実行することができますマウスのためのテストセッションを終了します。マウスに彼らが先に落ちたときに彼らは、彼らの実行時間を改善することができ、さらに2つの試行の最大値を与える。
  6. さらなる分析のために(試験の最長IE)の最大実行時 ​​間を使用してください。

4。トレッドミル運動

ザ·トレッドミルは、前臨床研究におけるツールとしての三つの方法で使用することができる。まず、強制トレッドミルランニング(参照:このプロトコルで説明したように、疾患の病態を悪化させるために使用することができますDMD_M2.1.001.pdfを )。第二に、マウスの最大運転能力とこれに関する治療の効果は、(マウスが枯渇するまでに実行できるようにする方法を参照してください評価することができるDMD_M.2.1.003.pdf )。最後に、実行中のトレッドミルは、それが第二のテスト13であまりうまく機能するようにマウスを排出する前に、別の機能をテストするために使用することができます。これは、直接プロトコル1〜3に記載の機能テストのいずれか1に続いて、以下に述べるように、2回または週3回マウスを行使することによって行われます。

  1. この装置は、最大セット:RU数匹のマウスができる上、商業的に利用可能ないくつかのトレッドミルがあります。nは同時に、仰角、持続時間および速度を調整することができるれる。いくつかのトレッドミルを実行するために、マウスを奨励するために低強度のショックを送出するために、グリッドを完備しています。しかし、mdxマウスは、ストレスに敏感であり、簡単に走行方向の手で優しく押しで友好的に動機付けすることができます。したがって、強くショックグリッドを使用しないよう推奨されています。一般的に、手による刺激は最初、実行中のセッションの間に必要とされている。
  2. 水平トレッドミル上でマウスを置きます。
  3. 12メートル/分の走行速度でトレッドミルを開始する。より高い速度を容易に疲労をもたらし、低速(8メートル/分)のマウス(> 15ヶ月)で使用しなければならない。
  4. 最初のセッションの間に、彼らはベルトの端の近くにあるときに優しく、それらを押すことで実行するために、マウスをお勧めします。
  5. マウスは30分の期間中に実行したら、戻って自分のケージに入れます。
  6. 例えば 12週間の週二回、これを繰り返します。 必要なときに期間を休んで許可する。例えば、一部のMDXマウスは、実行を停止する必要があり、数分間休ませなければならない。このような場合は、ベルトをオフにし、すべてのマウスを2分の休止期間を与え、4メートル/分で2分間にベルトを回す。この後、12メートル/分の速度を増加させ、マウスがプロトコルを完了することを可能にする。これは、すべてのマウスは、全体の実行プロトコルを完了することが重要です。

    :MDX マウスは休息期間を必要とする場合、30分の運動プロトコルの前にウォームアップを考えてみましょう。ただちに/分8メートルで8分のウォームアップに続いて4メートル/分の速度で2分間の順応期間、このウォームアップセッションで構成されています。


    私たちの手で4月16日週齢の雌のmdxマウスは休憩なしで30分の運動プロトコルを完了することができます。他の時代に、マウスの45%が運動を完了するために休憩期間が必要なのですかオスのmdxマウスと一致したことを報告している。ウォームアッププロトコルが軽減停止12の量は、S。

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Representative Results

野生型およびmdxマウスの前肢握力は4月12日週齢の間で増加し、高齢のマウスで再び減少します。力の障害は、すでに若いmdxマウスにおいて観察することができる。 9週齢の雌のマウスの代表的なデータを図1A及び1Bに示されている。疲労がこの年齢でまだ株の間で異なっていませんが、mdxマウスは野生型マウスよりも弱い。私たちは、古いMDXと野生型マウスで疲労性にまだデータがありません。

信頼性と再現性のある結果を得るために、多数の評価は、同じ実験者によって行われる必要がある。ここで我々はまた、信頼性の高いデータを提供引っ張るの15回/個別しかし少数(5引っ張るという低)を引っ張って説明します。細心の注意は、これは主に成果に影響を与えることができ、グリッド上の足の位置に描画する必要がある。プル中、唯一の両方の前足を使用する必要があり、彼らはbにする必要がありますeは、次の( 図1C)は、互いにうまく配置された。マウスは、プルに対する抵抗性を示すれていない場合には、値が考慮されるべきではない。

、2肢と4肢の吊り試験に特に若い(4月16日週齢)は、野生型マウスは簡単に600秒の最大吊り時間に到達することができます。対照的に、若いmdxマウスの性能は、両方の株が、これらは彼らの最高の能力( 図2Aおよび3A)での試験を掛ける実行する際に、すべての力を入れていても、障害者(彼らはほとんどない最大吊り時間を達成)、また年齢とともに劣化している。 MDXと野生型マウスとの間にぶら下がっ時間の大きな違いは、ワイヤーを用いて得られる。したがって、筋機能に対する化合物の小さな効果量は、この試験を用いて検出することができる。ハンギング性能(または性能の他のタイプ)は、高い標準偏差バーをもたらし時間をかけて、個人内および異なる。 NonethelESSは、mdxマウスは一貫して年齢が( 図2A)は、野生型マウスにマッチしたより悪い行う。複数の評価を実行すると、エンドポイントのみの測定値よりも処理すると、機能の改善、より詳細な洞察を提供することができます。これは、最初のセッションでは、動物が機能テストを実行する方法を学ぶことに留意すべきである。すべてのテストに存在するこの学習曲線は、年齢の4〜6週間の間ではっきりと見える。マウスはまた、この年齢期で急速に成長するので、による学習および/または成長の改善との間の区別ができない。 2手足がテストを掛けるためのパフォーマンスをぶら下げの男女差も発見されている。メスのmdxマウスの性能は、〜100 SECによる男性のそれを上回っており、トレッドミル問題のある雌のmdxマウスの性能は、(4A図2A比較 )比類のない男性とほぼ同程度である。この知見は、年齢aを使用することの重要性を強調NDジェンダーバイアスを避けるために、マウスにマッチした。私たちは、非常に古い(18ヶ月)のマウスにおけるMDXと野生型マウスが増加との間に両方の吊り下げ試験でのパフォーマンスでその違いを示唆して予備的なデータを持っている。

マウスの大半は、試験に準拠し、2つまたは4肢でハングが(、( 図2D及び2E) など 、意図的に線を飛び降り、ワイヤ上でバランスをとる、一部のマウスのようなワイヤーにぶら下がっ避けるために不適切な行動を表示図2Bおよび2C)。時折、強いマウスが意図的にワイヤーから飛び降りる。彼らは前にワイヤ上でのみ2後肢と尾でジャンプにハングアップすると地面との距離を推定するために見下ろす。時折4四肢吊りテスト中にグリッド上で見られている不適切な行動は意図的にグリッドを飛び降りたりグリッド上登山で構成されています。行動のすべての不適切な形式がeasilすることができますY区別して許されるべきではない。次のいずれかの方法でぶら下がっ避けるマウスは直接タイマーを停止することなく、ワイヤまたはグリッドに戻されるべきである。

野生型マウスの大きな割合( 図3B)を行いながら、ロータロッド上に、mdxマウスはほとんどない、500秒の最大実行時 ​​間のために実行されます。年齢とともに、両系統の走行性能が低下します。一部のマウスは、回転チューブにしっかりと上クランプし、周りの「cartwheeling 'で実行しないようにすることができます。これがために修正され、複数のマウスは、それによって実験群内の変動を大きくする、長期間のためにこれをやって起動時にテストの厳しい制限であることはできません。特に、部分的に実行され、一部が側転、そして実行している秋にcartwheelingからの移行時に一部のマウスのために。実行している間、いくつかのマウスは、回転チューブに好転。この動作は、直接、チューブ上にマウスを再配置することによってのために取り組むべきからそれを止める。また、この種の振る舞い​​は、この試験の有用性を制限します。

強制トレッドミル実行している同じプロトコルを受けた野生型マウスは影響を受けませんが、未処理mdxマウスにおける疾患の病態を悪化させるための簡単で効果的な運動です。一般的には、マウスは、複数のマウスが同時に実行されている場合は特に、最初のトレーニングセッションの後、トレッドミルに慣れて実行する用意がある。 (生後15ヶ月以上)旧mdxマウスで実行の難しさを持っているし、若いマウスに使用し30分間12メートル/分の同じ走行速度に対応できない。したがって、30分間、8メートル/分の遅い走行速度は、MDXマウスは降坂従って、偏心収縮に対して特に脆弱である。プロトコル全体を完了するためにすべてのマウスを可能に推奨される短い期間だけ使用することができる。

あるいは、2つの四肢吊りワイヤーTのような他の機能テストESTは、( 図4A)を実行した後に直接行うことができます。トレッドミルは、未処置のmdxマウスは、座りがちなmdxマウス13よりもこれらの試験を行うことが少ないことが可能でチャレンジし、この研究デザインを用いて、株または治療群間の差は増加する可能性が高い。

前述のようにmdxマウスにおいて筋機能を研究するときに、C57BL/10ScSnJ野生型株は、対応する遺伝的背景のものであるものを使用する必要がある。でも、近交系、野生型との間でトレッドミル走行性能が18,19異なり株として我々はこれをお勧めします。しかし、また、非侵襲的な機能テストでは、機能、性能を遺伝的背景に影響されます。 図5 3つの代表的なグラフBL/10の背景に及びBL/10、BL/6Jの混合背景にmdxマウスの性能は、DBA2にこれを示しそして129OLAが比較されます。混合バックグラウンドマウスを理解できるようにロータロッドに掛かっワイヤーテストでよりよく、より悪い行う。

図1
図1。 9週齢の雌のmdxの体重について標準化前肢握力、代表的な結果および足の正確な位置決め。A.前肢の握力た(n = 5)および野生型(n = 4)マウス。握力はすでに若いmdxマウスで損なわれている。アスタリスクは、p <0.05を示し、データは平均±st.devとして提示される。Aに示すように、同じ個体のB.疲労は、平均して10%未満であり、株の間で変化しなかった。C.信頼できるデータを得るために、注意前肢握力分析中足の位置に支払わなければならない。マウスの正確な位置決め、2前足は、互いに隣接している、後肢のAREグリッドに触れるとマウスが前足の不正確な位置決め直線上に引っ張っているわけではありません。マウスは、直線的に引いていません。これが発生するか、また、唯一の1前肢または後肢を使用する場合、マウスが引き上げ中回るか、耐性を示すように欠けている、データは破棄されなければならないか。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2
図2。二肢ハンギングテスト、代表的な結果と、適切かつ不適切な吊り行動。 A.男性のMDXの週一回実施された2つの四肢吊りテストの代表的な例(N = 18、4月10日週、N = 13、11、12週、N = 10、13週)、年齢および性別は、野生型マウスと一致した(n = 6)であった。学習曲線は、テストの最初の数週間で両方の株も可能です。 mdxマウスの性能は、野生型マウスに比べて劣っていた。平均±st.devとして提示されたデータ。許容される最大吊り時間を点線で示している。B.この試験の正しい開始位置二つ前肢である。C。それはまた、後肢と尾。DおよびマウスのE. A小さなサブセット、特に強い野生型マウスを使用することができ、マウスの機能的能力に応じて、時折サイドバーに登ったりワイヤーに均衡化することによって、ぶら下がっ避けることができます。一部のマウスでは、意図的にワイヤーから飛び降りる。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

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図3。四肢吊りとロータロッド走行試験。A.四肢吊りオスMDXの週1回評価し、性能(N = 18、4月10日週、N = 13、11、12週、N = 8、13週)および野生型( n = 6)のマウス。経時的に、mdxマウスは、より少ない長野生型マウスよりもハング。B.ロータロッド回を実行して、若い男性のmdx間で異なりた(n = 18、4〜10週、nは13、11および12週あり、n = 10、13週なかった)および野生型マウス(n = 6)。データは平均±st.devとして表現さ​​れます。

図4
図4。雌マウスにおける機能的性能および骨格筋病理に運動プロトコルを実行している強制的なトレッドミルの効果は。筋病理は意図的だったマウスは、12週間の期間、30分、12メートル/分にて水平トレッドミル上で週に三回実行させることによって悪化。直接実行した後で、マウスは2肢吊りテストに参加する必要がありました。全ての野生型マウス(n = 5)許容された最大までぶら下がっままで、すべてのmdxマウス(n = 6)に(p <0.001、平均±st.devとして提示データ)。B.存在以前のワイヤから落下しながら膜損傷の膜中の裂け目を通って筋線維の漏出血漿クレアチンキナーゼ(CK)レベルを評価することによって決定した。 CKレベルは、運動前、野生型マウスと比較して、mdxマウスにおいて上昇した。トレッドミル運動直後に増加されたレベル(アスタリスクで示されたp <0.01、st.dev平均±提示されたデータ。)mdxマウスでは、彼らは、野生型マウスでは低いままであった。CD。mdxマウスの筋肉が悪化、運動トレッドミルは非常に脆弱である疾患病理広範囲にFTER実行中の数週間。 (D)は広範な線維症および壊死が開発されたmdxマウスのショー行使16週齢nonexercised(C)およびトレッドミルの大腿四頭筋のこれらのヘマトキシリンおよびエオシン染色は、同じ実行中のプロトコルを受けた野生型マウスの大腸菌筋肉は影響を受けません。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5。 mdxマウスにおける機能パフォーマンスに混合背景の影響遺伝的背景の影響、機能、性能の違い。これを説明するために、オスのmdx(BL/10背景はn = 18、4〜10週、nは13、11および12の性能ウィーKS、N = 10、13週)およびMDX(混合BL/10、BL/6J、DBA2と129OLA背景、n = 5)のマウスを時間をかけて比較した。大きく2系統間で異なっA.二肢の吊り試験性能。 B.四肢吊りテストの結果は、混合背景MDXマウスでわずかに高かった。 ロータロッドは少しも時間を実行している株の間で異なっていた。平均±st.devとして提示されたデータ。

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Discussion

ここで紹介する機能テストは、再現性の実施が容易と野生型と自分の年齢とは無関係にジストロフィーマウスにも適用可能である。テストは、事前に臨床的に筋機能、強さ、状態、および調整を評価するための便利なツールを提供しています。疾患の自然史に関する化合物の効果を試験する場合、ここで説明する非侵襲的検査(前肢握力、ぶら下げテストとロータロッド試験の両方)がうまくこれらのテストは、連続した日に実行され、機能テスト体制で組み合わせることができる。これらのプロトコルは、mdxマウスに有害ではなく、長手方法10で使用することができる。それは、これらのテストのそれぞれの成果ではなく、個々の筋肉の異なるまたは部分的にオーバーラップする筋肉群によって生成されることに留意すべきである。そのため、複数のテストを組み合わせて使用​​すると、より完全な画像を得ることをお勧めし、それによって実験の機能性に優れた洞察さ精神的なグループ。あるいは、靴底筋の機能的改善は、筋肉の生理学的測定値20を使用して評価することができる。

行動試験と同様に、また、機能テストは、大規模な異なるマウス間の変動、または別の査定の間にマウスの中を表示することができます。変動を低減するために、すべてのテストは、マウスに精通した同じ実験者が行ってください。室内の匂いや音のような外部変数は、日および試験が行われた曜日の時間はできるだけ一定に保つべきである。マウスは、性別や年齢一致させる必要があります。疾患の進行を悪化させる実行してトレッドミルを使用する場合は、全てのマウスが同等に扱われるように全ての動作パラメータ(稼働時間、速度、勾配)は、全ての実験群について経時的に一定に保たれている標準化されたプロトコルを使用することが必須である。マウスの大半は機能テストに参加することに熱心であり、ほとんどの動物が高い示しているが意欲のレベルは、いくつかのマウス(主に強力な野生型マウス)は時折、テストおよびshow回避動作を実行しないようにします。この動作はを補正していない場合には、偽の結論は21を引き出すことができた。幸いなことに、これらのタイプの挙動は、たまにしか観察され、ワイヤグリッドまたはロータロッド上に戻ってマウスを置くか、握力計の別の時間を引くことによって補正することができる。

1機能テスト( 例えばぶら下げテスト評価する筋機能)の改善は、必ずしも別のテスト(ソール筋力を評価前肢握力)の改善で発生するCOにはありません。 mdxマウスにおいて、筋機能の改善は、以前の筋力に比べて区別することができる。これは、6分間歩行試験における臨床的に意味のある改善が筋力6,7 ​​の改善と共起しない臨床試験に参加したDMD患者に見られる。しかし、これはよい一部で試験化合物の作用メカニズムに依存し、それは、他の化合物は、強度ではなく、機能を向上させることが可能である。したがって、試験の結果は、心における化合物の作用機序と解釈されるべきである。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

我々は彼らの非常に建設的なコメントのためにマウスやレビューアの画像を得るの彼女の写真の援助、助けをMargriet Hulskerに感謝したいと思います。この作品はZonMw治療-NMD(契約番号LSHM-CT-2006から036825)、及びデュシェンヌ型の親プロジェクトによってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse grip strength meter Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments) # 80529
Hanging wire 2 limbs device Cloth hanger or custom made device
Hanging wire 4 limbs device Lid of rat cage or custom made device
Rotarod Ugo Basil # 47600
Treadmill for mice Exer 3/6 Columbus Instruments # 1055SRM

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