ペプチドエピトープの定量分析のための高スループット、MHC II結合アッセイ
2014年3月25日
組換えヒトMHC II分子と生化学的アッセイは、免疫原性エピトープ同定、削除、または設計に迅速かつ定量的な洞察を提供することができます。ここで、384ウェルプレートにスケーリングペプチド-MHC II結合アッセイが記載されている。この費用対効果の高い形式は、タンパク質の脱免疫やワクチンの設計と開発の分野で有用であることを証明する必要があります。
本手順の全体的な目的は、ハイスループットな384ウェルプレートアッセイを用いて、短鎖ペプチドとヒトMHC II免疫タンパク質の結合を定量化することです。まず、目的のペプチドを用いて液相競合結合アッセイを行います。次に、平衡状態にあるペプチドMHC II複合体を、高結合ELISAプレート上に固定化した抗MHC II抗体で捕捉します。
次に、捕捉された複合体をオプシウム標識ストレプトアビジンとともにインキュベートし、その後、未結合のストレプトアビジンを洗浄して除去し、捕捉されたオプシウムを活性化させます。最終的に、時間分解蛍光光度法を用いて、捕捉されたMHC II-コントロールペプチドのレベルを定量化できます。この手法により、標的タンパク質の免疫原性の可能性に関する予備的な知見を得ることが可能です。
これは特にin silico予測因子の出力を検証する際に有用です。まず、新鮮に希釈したL 2 43抗体溶液 25 µLを、ハイバインド白色ELISA 384ウェルプレートの各ウェルに添加します。プレートをポリエステルフィルムで密封し、4 °Cで一晩インキュベートしてください。その後、各テスト化合物の10 mMストック溶液を用いて開始します。
ペプチドとDMSOを用いて、3枚の84ウェルポリプロピレンプレートで以下の希釈系列およびクエン酸リン酸緩衝液を作製します。なお、84ウェルのポリプロピレンプレート1枚分には、図に示すように3枚の別々のEIAプレートが必要であることに注意してください。次に、15 mLコニカルチューブを用いて、選択したMHC IIストック溶液を反応緩衝液で101 nM濃度に希釈します。
次に、コントロールペプチドを20 µMから、調製したばかりのMHC IIマスターミックスで1:100の比率に希釈し、コントロールペプチドを含むMHC IIマスターミックス21.5 µLを陽性コントロールウェルに添加します。384ウェルポリプロピレンプレートの各テストペプチド希釈液に、コントロールペプチドを含むMHC IIマスターミックスを1:1の比率で添加し、同時に結合反応を作成します。最後に、結合反応をポリエステルフィルムで密閉し、プレートを非CO₂制御インキュベーターにて37 °Cで、振盪せずに12〜24時間インキュベートします。
翌日、3枚の84ウェルプレート内の結合反応ウェルを、中和バッファーを用いて1:1の比率で希釈します。その後、ELISAプレートを、1ウェルあたり60 µLのPBS 0.05%で3回洗浄します。次に、3枚の84ウェルプレートから、中和された各結合反応溶液25 µLを、抗体コート済みの3枚の84ウェルプレートへ3連（triplicate）で移注します。
ELISAプレートの各ウェルを封止し、ポリエステルフィルムで覆って4 °Cで一晩インキュベートします。インキュベーション後、先ほど示した方法でELISAプレートを3回洗浄し、次いで、新たに希釈したstreptavidinを各ウェルに25 µLずつ加えます。プレートをポリエステルフィルムで覆い、室温・暗所で1時間インキュベートします。
インキュベーションの間、プレート1枚あたり10 millilitersの増強溶液を同様に暗所で室温に戻します。1時間後、デモンストレーション通りにELISAプレートを洗浄し、各ウェルに25 microlitersの増強溶液を加え、ポリエステルフィルムでカバーして暗所で10から15分間インキュベートします。最後に、最適な設定にした時間分解蛍光プレートリーダーを用いて蛍光を測定します。この代表的な実験では、MHC 2アレルに対する推定ペプチド結合因子を解析するため、enterobacter Cloe P nine nine beta-lactamaseの成熟ペプチド配列を分析しました。
DRB1*15:01に結合するために必須となる、1番目のポジションにP1アンカー残基を持つペプチドが、5%の閾値のみで117個同定されました。スコアが2.6以上のペプチドは結合する可能性が高いと考えられます。したがって、5%の閾値のみにおいて、上位11個のペプチドがMHC II DRB1*15:01に結合すると予測されます。
本MHCクラスII結合アッセイでは、予測されたエピトープから代表的なパネルを選定して解析を行いました。これらの15残基からなるβ-ラクタマーゼペプチド断片は、想定される9量体MHCクラスIIエピトープが合成タンパク質断片内に組み込まれるように化学合成されました。その後、実演した通り、これらの合成ペプチドがビオチン化マイエリン塩基性タンパク質Bコントロールペプチドと競合してMHCクラスII DRB 1 15 0 1に結合する能力を解析しました。
合成ペプチドの競合結合曲線がここに示されています。IC 50値は、Prismの1サイト競合結合非線形回帰関数を用いて、対数変換データをフィッティングさせることで算出しました。グラフおよび表に示されている通り、開発後のペプチドは自然に3つのグループに分かれました。すなわち、IC 50が1 µM未満の強結合剤、IC 50が1 µM以上100 µM未満の中程度の結合剤、およびIC 50が100 µM以上の弱結合剤です。
この手法により、分子免疫学およびバイオ治療設計の分野の研究者が、ヒト患者における抗タンパク質免疫応答の基盤となる重要な分子認識イベントをより詳細に探索することが可能になりました。
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概要
本記事では、384ウェルプレートを用いて、短鎖ペプチドのヒトMHC IIタンパク質への結合量を定量するハイスループットなペプチド-MHC II結合アッセイについて解説します。本手法は、免疫原性エピトープの同定に関する迅速な知見を提供することを目的としており、特にタンパク質の脱免疫化やワクチン開発において有用です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 免疫学
- ワクチン開発
- 生化学的アッセイ
背景
- ヒトMHC II分子は、免疫応答において重要な役割を果たします。
- 免疫原性エピトープの同定は、ワクチン設計に不可欠です。
- ハイスループットアッセイにより、研究プロセスの加速が可能です。
- 免疫学の分野では、費用対効果の高い手法が求められています。
研究目的
- MHC IIタンパク質へのペプチド結合量を定量すること。
- 免疫原性エピトープの同定を容易にすること。
- ワクチンの設計および開発への取り組みを支援すること。
使用した手法
- ペプチドを用いた溶液相競合結合アッセイ。
- 抗MHC II抗体を用いたペプチド-MHC II複合体のキャプチャー。
- オピウム標識ストレプトアビジンによるインキュベーション。
- 時間分解蛍光光度法を用いた定量。
主な結果
- このアッセイにより、ペプチド-MHC II結合に関する定量的なデータが得られます。
- ペプチドの免疫原性のポテンシャルを評価することが可能です。
- この手法はスケーラブルであり、費用対効果に優れています。
- 得られた結果は、今後のワクチン開発戦略に役立てることができます。
結論
- 記載されたアッセイは、免疫学的研究において有用なツールとなります。
- これにより、ペプチド-MHC相互作用への理解が深まります。
- このアプローチは、ワクチン設計の進展につながる可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
ハイスループットMHC II結合アッセイにより、ペプチドの免疫原性を迅速かつ定量的に評価することが可能となり、初期段階の脱免疫化およびワクチン設計のワークフローを直接的に支援します。384ウェルフォーマットへのスケールアップと液体ハンドリングの自動化により、本手法は試薬コストを削減しつつ、スループットと再現性を向上させ、堅牢なターゲットバリデーションおよびポートフォリオの優先順位付けを促進します。このアプローチにより、研究開発チームはエピトープ候補を効率的に解析し、より高い予測信頼性を持ってリード候補を優先的に選択することが可能になります。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 免疫原性リスク評価に向けた、ペプチド-MHC II相互作用の定量的な解析を可能にする。
- in silicoによるエピトープ予測の機能的な検証をサポートし、メカニズム上の曖昧さを低減する。
- 脱免疫化またはワクチン開発パイプラインにおける、候補ペプチドの迅速なスクリーニングを促進する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 複数のペプチドおよびMHC IIアレルにわたる標準化され再現性のある結合データを、並行して提供します。
- ダウンストリームの免疫原性スクリーニングおよび最適化に向けた、バリデーション済みの生物学的システムを構築します。
- 定量的なIC50出力により、ペプチドライブラリのスケーラブルかつハイスループットな評価を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- ヒトMHC IIアレルに関連する結合閾値を定量化することにより、ペプチド選択を翻訳後の免疫原性リスクに適合させます。
- 堅牢で定量的な結合データを提供することで、創薬から前臨床バリデーションまでの連続性をサポートします。
- IC50値に基づいてペプチドを強結合、中等度結合、弱結合に層別化し、候補物質の推進に伴うリスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本アッセイは、in silico 予測、実験的検証、および免疫原性のトランスレーショナルなリスク評価を橋渡しすることで、創薬から前臨床までのコンティニュアムに統合されます。
- ディスカバリー生物学： 定量的な結合データを提供し、免疫原性仮説の検証およびエピトープリスクの明確化を行います。
- スクリーニング： ペプチドライブラリー評価に向けた、再現性の高いハイスループットアッセイの準備を可能にします。
- 分析： IC50値および結合曲線を算出し、ペプチド候補の直接的な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： ヒトに関連するMHC IIアレル結合プロファイルに基づいたペプチド選択を行います。
- エンタープライズ再利用： 複数のプログラムにわたる継続的な免疫原性評価のための、拡張可能で標準化されたプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：エピトープ選択における予測信頼性を高め、後期の免疫原性リスクを低減します。
- 運用の価値：自動化と小型化により、アッセイのスループット、再現性、およびコスト効率を向上させます。
- 戦略的価値：定量的な免疫原性指標に基づいた、データ駆動型の意思決定（go/no-go判定）およびポートフォリオの優先順位付けを可能にします。
- ポートフォリオへの影響：開発の早期段階において、リスク調整後の前進および高リスク候補物質の優先順位下げを支援します。
実施上の検討事項
- 免疫学、ペプチド化学、および定量アッセイ開発の専門知識が必要です。
- 液体ハンドリングロボット、384ウェルELISAインフラ、および時間分解蛍光プレートリーダーへのアクセスが必要です。
- アッセイプロトコルとデータ解析ワークフローについて、チーム間での厳格な標準化が求められます。
- プログラムのニーズに応じて、異なるMHC IIアレルやペプチド化学への適応が必要になる場合があります。
- スループットとスケールアップの可能性は、利用可能な装置および試薬の供給量によって制限されます。
