Isolering av CA1 Nuclear beriket fraksjoner fra hippocampus Slices til studieaktivitet avhengig Nuclear Import av Synapto-nukleære Messenger Proteiner

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi gir en detaljert protokoll for induksjon av langsiktig potense i CA1-regionen av hippocampus, og den påfølgende isolering av atom anrikede fraksjoner fra den tetanized område av skiven. Denne tilnærmingen kan brukes til å bestemme aktiviteten avhenger atom protein import i cellulære modeller for læring og hukommelse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins. J. Vis. Exp. (90), e51310, doi:10.3791/51310 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Studerer aktivitet avhengig protein uttrykk, subcellulære translokasjon, eller fosforylering er viktig å forstå de underliggende cellulære mekanismene for synaptisk plastisitet. Langsiktig potensering (LTP) og langvarige depresjoner (LTD) indusert i akutte hippocampus skiver er allment akseptert som cellulære modeller for læring og hukommelse. Det er mange studier som bruker levende celle bildebehandling eller immunhistokjemi tilnærminger for å visualisere aktivitets avhengig protein dynamikk. Men disse metodene er avhengige av egnetheten av antistoffer til immunocytochemistry eller overekspresjon av fluorescens-merket proteiner i enkeltnerveceller. Immunoblotting av proteiner er en alternativ metode som gir uavhengig bekreftelse av funnene. Den første begrensende faktor for fremstilling av subcellulære fraksjoner fra individuelle tetanized hippokampale skiver er den lave mengde materiale. For det andre er avgjørende håndtering prosedyren fordi selv svært korte og små manipulasjoner av living skiver kan indusere aktivering av visse signalkaskader. Her beskriver vi en optimalisert arbeidsflyt for å oppnå tilstrekkelige mengder av kjernefraksjonen anriket med tilstrekkelig renhet fra CA1-regionen av akutte hippokampale skiver fra rottehjerne. Som et representativt eksempel viser vi at ERK1 / 2 fosforylert form av synapto-kjerneprotein messenger Jacob translocates aktivt til kjernen ved induksjon av LTP, og kan påvises i et atom beriket fraksjon fra CA1-neuroner.

Introduction

Synaptic N-metyl-D-aspartat-reseptorer (NMDARs) spiller en avgjørende rolle i synaptisk plastisitet og celle overlevelse signale mens aktivering av extrasynaptic NMDARs kan utløse neurodegenerering og celledød. Disse endringene avhenger kontrollert / regulert aktivitet avhengig genuttrykk og dermed krever konstant kommunikasjon mellom aktiverte synapser eller dendritter og kjernen 7. MAP kinaser ERK1 / 2 er nedstrøms effektorer av synaptiske NMDARs signalanlegg og er involvert i NMDAR-aktivering induserte genuttrykk, mens signalering via extrasynaptic NMDAR har ingen eller en hemmende effekt på ERK1 / 2 aktivitet 8,11.

Det er antall proteiner som har vist seg å shuttle mellom distale dendritter og kjernen. Mange av disse proteiner inneholder et kjernelokaliseringssignal, og er aktivt transportert langs mikrotubuli i en dynein og importin avhengig måte til kjernen 6,9. Interestingly, noen av disse budbringere bare transitt til kjernen som respons på spesifikke synaptiske stimuli. For eksempel er retrograd transport av cyklisk AMP responselement bindende protein 2 (CREB2) indusert ved kjemisk LTD, men ikke LTP 12. Lokalisert NMDAR avhengige synaptisk stimulering driver CREB-regulert transcriptional coactivator (CRTC1) inn i kjernen, en trans prosess, som er involvert i langsiktig hippocampus plastisitet fire. Det ble nylig vist at proteinet messenger Jacob translocates til kjernen etter at begge, synaptiske og extrasynaptic NMDAR aktivering og regulerer CREB avhengig gentranskripsjon 5. Den synaptiske eller extrasynaptic opprinnelse av signalet er kodet i et posttranslational modifikasjon av Jacob. Synaptisk aktivitet induserer ERK1 / 2 avhengig fosforylering av Jacob på et viktig serin i posisjon 180 (pJacobS 180) som er en forutsetning for den etterfølgende translokasjon til kjernen i hippocampus primære kultur. Dessuten, in CA1 nevroner av akutte hippocampus skiver pJacobS 180 translocates til kjernen etter Schaffer sikkerhet LTP men ikke LTD 1,10. pS180 Jacob fører til økt uttrykk av plastisitet relaterte gener og dette genuttrykk feeds tilbake til synaptisk funksjon. I skarp kontrast, Jacob som translocates til kjernen etter extrasynaptic NMDARs aktivering ikke fosforyleres på Ser180 og kan være assosiert med ulike proteinkompleks i kjernen forårsaker 'CREB stenge "og et dementi av synaptiske kontakter 10.

Mest publiserte studier om kjernefysisk import av synapto-kjerneprotein messenger har blitt gjort i dissosiert nevronale primærkulturer. Derfor ville det være interessant å se om slike funn kan reproduseres i fysiologisk mer relevant forhold og med hippocampus skiver der neuronal tilkobling og funksjon er mye bedre bevart. Her presenterer vi en optimalisert protokoll for å vurdere LTP-deHENGENDE kjernefysisk translokasjon av protein budbringere av immunoblotting. Denne fremgangsmåte er også egnet for å analysere aktiviteten avhengig fosforylering av proteiner i en rå atomfraksjon. Nærmere bestemt involverer den aktuelle protokoll fremstilling av akutte CA1 hippokampale skiver, induksjon, samt registrering av LTP. Deretter blir CA1 regionen mikroskopisk dissekert for å isolere den stimulerte region. Vi kombinerte og endret protokollen for atom isolasjon levert av CellLytic Nuclear Extraction Kit med endringer introdusert av Zhao og kolleger 17. Den optimaliserte prosedyren omfatter lyse av dissekert CA1 regioner i hypoton buffer slik celle hevelse og frigjøring av kjerner. Cellelyse og nuclei morfologi kan bestemmes ved mikroskopisk undersøkelse. Kjerne anrikning oppnås ved en kort sentrifugeringstrinnet. Immunoblotting analyse med antistoffer mot Neun og NSE2, spesifikke markører for kjernefysiske eller cytosoliske fraksjoner, indikerer at denne tilnærmingen kan brukes som en raskog reproduserbar protokollen for å isolere disse subcellulære fraksjoner og å studere svært labile posttranslational modifikasjoner som protein fosforylering. I tillegg er denne fremgangsmåten fordelaktig ved små vevsprøver som stammer fra dissekert CA1 regioner av hippokampale skiver og kan brukes i kombinasjon for å immunhistokjemi av hippokampale skiver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av Akutt Hippocampus Slices fra Adult Rat Brain

  1. Anesthetize rotter med isofluran. FORSIKTIG: Utfør prosedyren ved hjelp av en lukket exicator, ikke inhalerer isofluran. Sørg for at dyret er helt bedøvet.
  2. Halshogge rotte, raskt isolere hjernen, og dyppe den i prekarbonatiseres (95% O 2/5% CO 2 gassblanding) iskald Gey løsning (sammensetning i mm: 130 NaCl, 4,9 KCl, 1,5 CaCl 2 · 2H 2 O , 0.3 MgSO 4 · 2H 2 O, 11 MgCl2 · 6H 2 O, 0,23 KH 2 PO 4, 0.8 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, 5 Glukose · H 2 O, 25 HEPES, 22 NaHCO3, pH 7.32) 30 min 1,2,10,16.
  3. Fjern lillehjernen og en del av entorhinal cortex. Separer hjernebark halvkuler med en mid-sagittal kutt, deretter plassere hver halvkule ned på sin mediale overflaten. Deretter gjøreet 50-70 ° kutt (50-70 ° tverrgående) langs ryggkanten av hver halvkule 13,14.
  4. Lim hver halvkule med nyklipt overflate på slicing plattformen snitte system. Plattformen skal være dekket av precarbogenated iskald Gey løsning.
  5. Skjær 350 mikrometer 50-70 ° tverrgående skiver fra fremre til bakre side ved hjelp av en vibratome justeres for å minimere z-aksen pendling. Den hippocampus formasjon, subicular og entorhinal cortex, samt kortekser som er plassert dorsolateral til hippocampus vil være en del av de stykker som brukes til eksperimenter 13,14.
  6. Overfør hippocampus skiver til en U-form og er nedsenket typen inkubator og inkuberes i minst 2 timer ved 32 ° C med carbogenated kunstig cerebrospinalvæske (ACSF inneholdende i mM: 110 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl 2 · 2H 2 O, 1,5 MgSO 4 · 2H 2 O, 1,24 KH 2 PO 4, 10 Glukose · H 2O, 27,4 NaHCO3, pH 7,3) 1,2,10,16.

2. Plassering av elektroder, Baseline Recording, og Induksjon av LTP

  1. Overfør hippocampus skive til en neddykket typen opptakskammeret montert under et mikroskop. Perfuse (6-7 ml / min) med carbogenated ACSF i minst 30 min ved 32 ° C.
  2. Forbered glass kapillær mikroelektroder fylt med ACSF (tips motstand er 3-5 mÊ).
  3. Plasser et glass microelectrodes fylt med ACSF i CA1 Schaffer-sikkerhet fibre for stimulering og i CA1 stratum radiatum for fEPSP opptak 1,2,10 (figur 2). Avstanden mellom elektrodene bør være omtrent 300 um.
  4. Fremkalle feltet Eksitatoriske postsynaptiske potensialer (fEPSPs) ved stimulering av Schaffer-sikkerhet fibre med bifasisk firkantstrømpulser (200 msek / polaritet) i en rekke på 3-4 V.
  5. Utfør maksimal stimulering test ved å måle inpUT-output forhold og definere stimulering styrke som 40% av maksimal fEPSP-skråningen verdier oppnådd og holde den konstant gjennom hele eksperimentet.
  6. Begynn referanse opptak i minst 15 minutter etter den maksimale stimulering test. Mål responsene for å teste stimuli hvert minutt gjennom hele forsøket. Utfør registrert grunn med lavfrekvent stimulering.
  7. Spill grunnlinjen i minst 30 min.
  8. For sen-LTP induksjon gjelder høyfrekvente 100 Hz tetanization bestående av tre 1 sek stimulans tog ved 100 Hz med en 5 min intertrain intervall. For å øke innen stimulering innenfor CA1 regionen 5 mikrometer bicuculline kan vaskes i 2 min før tetanization og bør vaskes umiddelbart etter siste tetanization.

3. Innsamling av Slices etter induksjon av LTP og Snap Frysing

  1. Stopp LTP opptak 2 min eller 30 min etter tre tog i tetanic stimulering induserer Late-LTP.
  2. Samle hver skive i en 1,5 ml tube og oppbevar ved -80 ° C.

4. Isolering av Nuclear beriket fraksjoner fra CA1 regionen av hippocampus

  1. Ta 1,5 ml Eppendorf-rør med de frosne skiver fra -80 ° C og holde dem på is.
  2. Tilsett 0,5 ml av frisk kald TBS-buffer inneholdende protease (PI) og fosfataser (PS) inhibitorer, inn i røret. Inkuber i 2-3 min og overføre til en stereomikroskop. FORSIKTIG: Bruk vernehansker og labfrakk mens du arbeider med PI og PS.
  3. Dissekere CA1 stratum Pyramide-regionen i hippocampus ved hjelp av to nåler. Bruk en nål til å holde stykket under stereomikroskop og andre nålen for å kutte CA1 området.
  4. Samle dissekert CA1 områder fra 5 stykker (i hver gruppe) i et nytt 1,5 ml rør inneholdende 50 ul lyseringsbuffer (1x hypoton lyseringsbuffer inneholdende i mM: 10 HEPES, 1,5 MgCl 2, 10 KCl, pH 7,9, med PI og PS). Legg merke til at denne mengde materiale vil være tilstrekkelig til å kjøre 2-3 immunoblots.
  5. Homogen innsamlet vev ved forsiktig pipettering opp og ned. Bruk en 200 mL pipette. Inkuber lysatet på is i 5-7 minutter for å tillate cellene å svelle.
  6. Ta 2 mL av lysat, slipp på en mikroskopisk lysbilde, og visualisere hevelse av cellene under et sterkt feltet mikroskop. Med riktig hevelse av cellene kjernene vises som runde intakte konstruksjoner.
  7. Samle 20 ul av prøven i en frisk 1,5 ml rør som 'homogenatfraksjonen'. Legg 8 mL av denaturerende SDS 4x prøvebuffer.
  8. Sentrifuger de rester lysater ved 11.000 opm i 1 min.
  9. Samle supernatanten forsiktig fra toppen ('cytosoliske fraksjon "), transfer inn i et nytt rør og tilsett 20 pl av 4x prøvebuffer.
  10. Resuspender pelleten i 60 mL av hypoton buffer og tilsett 20 pl av 4x prøvebuffer. Denne fraksjon er referert til som en "nuclear anriket fraksjon '.
  11. Homogenat, cytosoliske, og atom anrikede fraksjoner kan lagres ved -20 ° C eller -80 ° C for senere immunoblotting.

5. semikvantitativ Immunoblotting for Synapto-nukleære Proteiner

  1. Defreeze prøvene og koke dem i 5 min ved 95 ° C.
  2. Ta 5 pl fra hver fraksjon og bestemme proteinkonsentrasjonen av amido svart test eller BCA-testen.
  3. Laste lik mengde proteinprøver fra homogenate, cytoplasmatiske og kjernefysiske beriket fraksjoner på SDS-PAGE. Prøver fra kontroll og LTP skiver skal plasseres på den samme gel for direkte sammenligning.
  4. Utfør en standard western-blotting prosedyre (våt overføring anbefales).
  5. Sondere membraner med tHan antistoff ifølge valg. Senere samme blotter (eller samme prøvene kjøres i parallell) kan analysert med en cytoplasma markør - neuron spesifikk enolase2 (NSE2) og kjernekraft markør - Neun og en -actin antistoff som start kontroll.

6. Data Analysis

  1. Effektivitet av LTP induksjon kan analyseres ved Clampfit programvare. Den gjennomsnittlige skråningen av registrert grunn ble sammenlignet med bakken etter tetanization bruker to-veis ANOVA, p <0,05 ble ansett som signifikant forskjellig. De fEPSP skråningen verdiene ble avbildet i diagrammene som gjennomsnitt ± SEM
  2. For kvantifisering av immunoblots, skanne enten autoradiografisk film og analysere den integrerte tettheten av proteinbånd ved ImageJ eller fluorescens band med en Licor system. Verdier av immunoreaktive band bør være normalisert for lasting og blotting kontroll. For sammenligning av kontroll og LTP grupper nonparametrical en Mann-Whitney U-testen kan benyttes.
Navn på buffer Reagens Konsentrasjon (MM) Beløp Kommentarer / beskrivelse
Gey løsning (pH-verdi: 7.3 ~ 7.4) NaCl 130 7,6 g steril filtrering
1000 ml KCl 4.9 0,37 g
CaCl 2 · 2H 2 O 1.5 0,22 g
MgSO 4 · 2H 2 O 0.3 0,0739 g
MgCl2 · 6H 2 O 11 2,24 g
KH 2 PO 4 0,23 0,0313 g
Na 2 HPO 4 · 7H 2 O 0.8 0,2145 g
Glukose · H 2 O 5 0,9909 g
HEPES 25 5,96 g
NaHCO3 22 1,85 g
ACSF (pH: 7.3 ~ 7.4) NaCl 110 6,428 g steril filtrering
1000 ml KCl 2.5 0,1865 g
CaCl 2 · 2H 2 O 2.5 0,368 g
MgSO 4 · 2H 2 O 1.5 0.370 g
KH 2 PO 4 1.24 0.169 g
Glukose · H 2 O 10 1,9817 g
NaHCO3 27,4 2,3 g
1x Hypoton buffer (pH 7.9) HEPES 10 0,23 g
100 ml MgCl2 · 6H 2 O 1.5 0,0304 g
KCl 10 0,07455 g

Tabell 1. buffere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har tidligere vist at synapto-kjerneprotein messenger Jacob akkumuleres i kjernen etter induksjon av LTP, men ikke 1 LTD. Videre trans Jakobs etter synaptisk stimulering krever aktivering av MAPK ERK1 / 2 og fosforylering av Jacob på Ser180 (figur 1). Fosforylert Jacob translocates til kjernen i en importin avhengig måte og fosforylert tilstand kan bevares over lengre tid ved assosiasjon med det mellomliggende fila αinternexin 15 (figur 1). Den fosfor-state of Jacob er viktig for uttrykket av aktivitetsavhengige gener og celleoverlevelse. Interessant, aktivering av extrasynaptic NMDARs driver også Jacob inn i kjernen, men i dette tilfellet Jacob ikke er fosforylert ved Ser180 og dets atom akkumulering induserer CREB 'avstengt' 5,10. Resultatene er beskrevet ovenfor ble innhentet av protokollen,ls etablert i vår siste undersøkelse (se Karpova et al. 10 for nærmere beskrivelse av modellen).

For å bevise at Jacob translocates inn i kjernen etter induksjon av LTP, vi indusert og målte induksjon av Schaffer sikkerhet fEPSP potense i akutte hippocampus skiver og senere isolert nevrale kjerner fra CA1 nevroner (figur 2 og 3). Vi sammenlignet med to forskjellige tidspunkter etter påføring av høyfrekvent stimulering (2 min og 30 min) og inkludert induksjon av LTP for hver skive som deretter ble bearbeidet for atom isolasjon og western blotting (figurene 2 og 3). Anrikning av den neuronale atom Neun markeringen kan sees i atom anriket fraksjon fremstilt fra dissekert CA1 regionen, mens cytosoliske markør neuron spesifikk enolase2 (NSE) er for det meste tilstede i supernatanten oppnådd etter sentrifugering fraksjon av lyserte calen (Figur 4A). Spesifisiteten av pS180 Jacob antistoff har vært preget tidligere (for mer informasjon se Karpova et al. 10). pS180 Jacob nivåer forble uendret i totale CA1 protein homogenates og i atom beriket brøkdel 2 min etter tetanization (figur 4B), men vi fant en signifikant økning i pJacobS 180 immunoreaktivitets 30 min etter induksjon av LTP (figur 4C), som bekrefter at Jacob translocating til kjernen i denne celle plastisitet modellen er fosforylert ved Ser180.

Figur 1
Figur 1. Jacob fosforyleres på S180 koder den synaptiske opprinnelsen NMDARs signaler. Tetanic stimulering av hippocampus Schaffer sikkerhet fiber resulterer i aktivering av synaptiske NMDARs og påfølgende aktivering av MAPKERK1 / 2 signaleringskaskade. Aktivert ERK1 / 2 binder seg til og phosphorylates Jacob på serin 180 og Jacob-ERK1 / 2 kompleks translocates til kjernen og dette korrelerer med økt CREB aktivitet og aktivering av plastisitet relatert genuttrykk.

Figur 2
Figur 2. Utstyr og verktøy som brukes for LTP induksjon og dissekere den CA1 regionen fra hippocampus skiver. A) vibratome brukes for utarbeidelse av akutte hippocampus skiver (1 - vibratome) B1-2) Elektro og bildebehandling oppsett (2 - Et mikroskop, 3 - micromanipulator og perfusjon system; 4 - Recoding elektrode; 5 - Stimulering elektrode; 6 - Vann objektiv ; 7 - Slice holder med hippocampus skive) C) Utstyr som brukes til disseksjon av CA1 regionen fra hippocampus skiver (8. Stereomicroscope; 9 - Insulin sprøyte med nåler; 10 - lite kirurgisk saks, 11 - Skalpell, 12 - Plast Pasteur pipette, 13 - Thin spatel, 14-100 mm plast kultur fatet fylt med isvann, og 40 mm plast kultur parabolen brukes til disseksjon av skiver.

Figur 3
Figur 3. tegneserie demonstrere den eksperimentelle prosedyre. Tall angir trinnene i protokollen. 02.01 til 02.08) En akutt hippocampus skive i neddykket kammer med glass elektroder plassert i stratum radiatum for potensering av Schaffer sikkerhet-CA1 synapser. Det innfelte representerer prøven fEPSP analoge spor, den horisontale linjen indikerer 5 msek og den vertikale linjen indikerer 0,5 mV. 3.3) Skivene ble samlet i 1,5 ml rør etterLTP opptak og snap frosset. 4.3) Dissection av CA1 regionen fra voksen rotte hippocampus skiver. 4,4 til 4,5) CA1 regioner homogenisert i hypoton lyseringsbuffer, noe som fører til osmotisk svelling av cellene og frigjøring av kjerner. 4.8) Sentrifugering av lysater ved 11.000 opm i 1 min. 4.10) Innsamling av cytoplasmatiske og kjernefysiske beriket fraksjoner for immunoblotting. 5.3) Lasting av cytoplasmatiske og kjernefysiske beriket fraksjoner på SDS-PAGE og påfølgende standard western-blotting.

Figur 4
Figur 4. Induksjon av LTP CA1 fører til opphopning av pJacS180 i kjernen. A) immunoblot for homogenate, cytosolic og kjernefysiske beriket fraksjoner av CA1 lysat undersøkt med cytosolisk og kjernefysiske markører. B) immunoblotanalyse av pJac-S180 nivå i homogenate 2 min og 30 min etter induDette skjer av tetanization. C) immunoblotanalyse av pJacS180 nivå i atom beriket brøkdel 2 min og min etter tetanization. Disse resultatene er en del av kvantifisering graf publisert i Karpova et al 10. Disse representative immunoblots er ikke inkludert i den originale publikasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Trinnene som er beskrevet i protokollen ovenfor gi veiledning hvordan å forberede hippocampus akutt skiver fra unge eller voksne rotter, indusere og rekord LTP, raskt dissekere stimulert område av skive, og forberede atom beriket brøkdel for å studere aktivitets avhengig protein dynamikk. Denne fremgangsmåten er avledet fra kombinasjoner av flere forskjellige metoder som brukes uavhengig av hverandre. Vi optimalisert en arbeidsflyt og gi tilstrekkelig detalj for nybegynnere å sette opp sine egne eksperimenter for å studere subcellulære omfordeling av proteiner ved induksjon av LTP. Som et eksempel viser vi at den avdøde form av LTP induserer atom opphopning av S180 fosforylert Jacob. For å skille mellom fosforylering av en pre-eksisterende kjerne pool av et gitt protein og translokasjon av den fosforylerte formen etter synaptisk aktivitet, kan denne metode kombineres med styring for samlet nivå av proteinet av interesse i den nukleære fraksjonen anriket. Videre, testing prøver på ulike tidspunkter etter LTP induksjon kan være svært innsiktsfull for å studere tid løpet av protein aktivering / inaktivering eller kjernefysisk omsetning.

Under utarbeidelsen av atom beriket fraksjoner fra stimulerte skiver er det flere metodiske problemer som må tas opp. Først, for å øke antall stimulerte nerveceller i CA1 regionen og mengden av materiale for immunoblotting, bruker vi 5 uM av GABAA receptor blokkering biccuculine under tetanization. Biccuculine har vist seg å forbedre eksitatorisk postsynaptisk potensialer 3.

For det andre, er bevaringen av stykker etter induksjon av LTP ved hurtig frysing et kritisk trinn for vellykkede forsøk på grunn mekanisk håndtering av skiver kan fremkalle forskjellige typer av aktiviteter direkte sammenfaller med endringer i protein modifikasjoner. For å forkorte prosedyren så mye som mulig, benytter vi en metallstang plassert på tørris. Slices kan overføres i en dråpe ACSF ved hjelp av plast en Pasteur pipette og fryses i løpet av svært få andre når den plasseres på prechilled metall.

Den tredje kritiske trinnet er anriking av kjerner i CA1 lysatene. Vi anbefaler å overvåke celle hevelse under mikroskopet og for å finne den mest optimale tidspunkt. Noen ganger når homogenisering av vev ikke ble gjort riktig, forblir celleavfall fortsatt i prøvene. Da det nukleære pelleten kan resuspendert i lysis buffer igjen, vasket i noen minutter, og deretter sentrifugert for å få et renere atomfraksjon.

Totalt denne protokollen kan bidra til ytterligere explorer rollen ulike synapto-atom messenger proteiner i synaptisk plastisitet. Den samme fremgangsmåte kan anvendes ikke bare til en høyfrekvent stimulering indusert LTP, men alle andre former for synaptisk plastisitet som LTD, theta-burst LTP, korttids plastisitet modeller, og andre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
CED 1401 AD/DA converter Cambridge Electronics Design, UK
Stereomicroscope Leica S4E, Germany
Vibrotome Leica VT1000S, Germany
Isolated pulse stimulator A-M Systems, USA Model 2100
Centrifuge Thermo Scientific
SDS-PAGE system Biorad
Cooler Julabo
Bright field Microscope Nikon Eclipse TS100
Cell culture incubator Thermo Electron Corporation
Micromanipulator Luigs & Neumann, SM-5, Germany
Blotting chamber and electric power supplier Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA
Submerged type recording chamber custom made
U-shape and submerged type incubator  custom made
Small surgical scissors
Scalpel
Thin spatula
Plastic Pasteur pipette
Plastic culture dish 
Bunsen beaker
Syringe
Reagents
NaCl Roth Art.-Nr.3957.1 ≥99.5%, p.a., ACS, ISO
KCl Roth Art.-Nr.6781.1 ≥99.5%, p.a., ACS, ISO
CaCl2·2H2O Merck 1.02382.0500 pro analysis
MgSO4·2H2O Merck 5886.05 pro analysis
MgCl2·6H2O AppliChem CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 for molecular biology
KH2PO4 Merck 12034.025 for molecular biology
Na2HPO4·2H2O Merck 1.06574.1000 extra pure
Glucose·H2O Roth Art.-Nr.6887.1 for molecular biology
HEPES Roth Art.-Nr.9105.4 PUFFERAN, ≥99.5%, p.a.
NaHCO3 Merck 1.06329.1000 pro analysis
Protease inhibitor cocktail Roche
Phosphostop Roche
Bicuculline Tocris Bioscience
Isoflurane Baxter
Antibodies
Primary antibodies Company Catalog Number Species
pJac-s180 Biogenes rabbit (diluted 1:100)
NeuN Milipore MAB377 mouse (diluted 1:1,000)
NSE Cell Signaling D20H2 rabbit (diluted 1:1,000)
Beta-actin Sigma A-5441 mouse (diluted 1:5,000)
Secondary antibodies Company Catalog Number Species
IgG HRP conjugated DAKO goat anti-mouse (1:5,000)
IgG HRP conjugated NEB goat anti-rabbit (1:5,000)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6, (2), e17276 (2011).
  2. Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation. Neuroscience. 169, (4), 1520-1526 (2010).
  3. Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters. Hippocampus. 8, (3), 289-298 (1998).
  4. Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus. Cell. 150, (1), 207-221 (2012).
  5. Dieterich, D. C., et al. Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus. PLoS Biol. 6, (2), e34 (2008).
  6. Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons. J. Neurosci. 31, (45), 16045-16048 (2011).
  7. Hardingham, G. E., Bading, H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurosci. 11, (10), 682-696 (2010).
  8. Ivanov, A., et al. Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons. J. Physiol. 57, 789-798 (2006).
  9. Jordan, B. A., Kreutz, M. R. Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling. Trends Neurosci. 32, (7), 392-401 (2009).
  10. Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152, (5), 1119-1133 (2013).
  11. Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron. 46, 745-760 (2005).
  12. Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, (44), 17175-17180 (2008).
  13. Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J. Neurosci. Methods. 130, (1), 19-32 (2003).
  14. Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures. Neuroscience. 131, (3), 601-610 (2005).
  15. Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve. Neuron. 45, (5), 715-726 (2005).
  16. Xiang, Z., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J. Neurosci. Methods. 98, (2), 145-154 (2000).
  17. Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation. J. Neurosci. 25, (30), 7032-7039 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics