के एकल तरंगदैर्ध्य छाया इमेजिंग

Engineering
 

Summary

यहाँ प्रस्तुत तकनीक आज़ादी एकल तरंगदैर्ध्य जोखिम का उपयोग सूक्ष्म प्रजातियों तैराकी के पथ के उपाय. सी. एलिगेंस महंगा सूक्ष्मदर्शी के लिए एक सस्ता विकल्प के रूप में छाया इमेजिंग प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया जाता है. इस तकनीक को दिशा, गति, त्वरण और बलों को मापने के लिए विभिन्न झुकाव, वातावरण और प्रजातियों को समायोजित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

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Jago, A., Kpulun, T., Raley-Susman, K. M., Magnes, J. Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates. J. Vis. Exp. (86), e51424, doi:10.3791/51424 (2014).

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Abstract

इस अध्ययन में ऐसी स्थिति, गति, त्वरण और प्रकाश की एक तरंग दैर्ध्य के जवाब में पानी की एक कॉलम में निलंबित नेमाटोड के locomotory व्यवहार में शामिल बलों के रूप में भौतिक गुणों की माप की अनुमति देता है कि एक सस्ता और सरल तकनीक को दर्शाता है. हम दो अलग उदाहरण का उपयोग एकल तरंगदैर्ध्य छाया इमेजिंग (SWSI) का उपयोग कर एक सूक्ष्म जीव की हरकत का मूल्यांकन करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है.

पहला उदाहरण सी. की औसत वंश का एक व्यवस्थित और सांख्यिकीय रूप से व्यावहारिक अध्ययन है पानी का एक स्तंभ में एलिगेंस. इस अध्ययन के लिए, हम जीवित और मृत wildtype सी. इस्तेमाल किया हम गुरुत्वाकर्षण क्षेत्र के भीतर मृत कीड़े के निष्क्रिय वंश के साथ निमेटोड सक्रिय आंदोलन का वेग और दिशा की तुलना में एलिगेंस., इस अध्ययन वंश बार में कोई अंतर नहीं दिखाया. औसत वंश सुसंगत 633 एनएम का उपयोग दोनों रहते हैं और मृत कीड़े के लिए 0.1 मिमी / सेकंड ± 1.5 मिमी / सेक थाप्रकाश.

दूसरा उदाहरण का चयन व्यक्तिगत सी. के एक मामले का अध्ययन है एलिगेंस एक ऊर्ध्वाधर पानी कॉलम में वंश के दौरान दिशा बदल रहा है. त्वरण और बल इस उदाहरण में विश्लेषण कर रहे हैं. इस मामले का अध्ययन परंपरागत सूक्ष्मदर्शी से सुलभ नहीं है कि एक वातावरण में एक तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर व्यवहार का मूल्यांकन करते समय SWSI का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है कि अन्य भौतिक गुणों की गुंजाइश को दर्शाता है. हम एक व्यक्ति निमेटोड का अनुमान इस विश्लेषण का उपयोग 28 एन से अधिक में एक शक्ति के साथ thrusting करने में सक्षम है.

हमारा निष्कर्ष मोड़, या गुरुत्वाकर्षण क्षेत्र के खिलाफ जब चलती रहने वाले नेमाटोड 28 एन डालती है कि संकेत मिलता है. निष्कर्ष आगे नेमाटोड निष्क्रिय पानी के एक स्तंभ में उतर सुझाव है कि, लेकिन सक्रिय रूप से मुख्य रूप से दिशा बदल कर गुरुत्वाकर्षण बल का विरोध कर सकते हैं.

Introduction

Caenorhabditis एलिगेंस संवेदी जीव विज्ञान और व्यवहार को समझने के लिए हाल ही में जीन विनियमन, विकास और अधिक के तंत्र के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव है कि एक मुक्त रहने वाले लाभकारी मिट्टी निमेटोड है. केवल 302 न्यूरॉन्स, सी. होने के बावजूद एलिगेंस जटिल locomotory पैटर्न, प्रजनन व्यवहार, नेविगेशन, chemotaxis और कई अन्य व्यवहार करने में सक्षम हैं. सी. एलिगेंस mechanoreceptors, chemoreceptors और यहां तक कि प्रकाश के नीले तरंगदैर्ध्य (वार्ड एट अल., 2008) 1 का पता लगाने के अधिकारी. ज्यादा ज्ञानेन्द्रिय समारोह के तंत्रिका circuitry और सी में सामान्य locomotory पैटर्न के बारे में जाना जाता है एलिगेंस, कम एकाधिक समवर्ती उत्तेजनाओं या एक खुर्दबीन के नीचे मॉडलिंग की जा सकती की तुलना में अधिक जटिल पर्यावरण की स्थिति के लिए प्रतिक्रियाओं के बारे में जाना जाता है. कुछ अध्ययनों से अत्यधिक प्लास्टिक 2,3,4 हैं कि अधिक जटिल locomotory पैटर्न से पता चला है. हमारे methodological दृष्टिकोण NEM की पढ़ाई कर सकेंगेहम आसानी से एक साथ कई पर्यावरण की स्थिति प्रदान कर सकते हैं, जहां वास्तविक समय में समाधान में atodes. इस सवाल पारंपरिक माइक्रोस्कोप आधारित इमेजिंग तकनीक का उपयोग कर पता करने के लिए मुश्किल है. हम हमें locomotory व्यवहार की जांच, साथ ही विभिन्न पर्यावरणीय स्थितियों के जवाब में हरकत बदलने के लिए नेमाटोड की क्षमताओं को निर्धारित करने के लिए एक पानी स्तंभ के भीतर नेमाटोड जगह करने की अनुमति देता है कि एक इमेजिंग तकनीक विकसित की है.

एकल तरंगदैर्ध्य छाया इमेजिंग (SWSI) पारंपरिक सूक्ष्मदर्शी की कमियों को संबोधित करने के लिए पहली बार इस पत्र में प्रस्तुत किया है. पारंपरिक सूक्ष्मदर्शी गहराई 5,6 में एक क्षैतिज फोकल हवाई जहाज़ कुछ माइक्रोन में प्रजातियों का पालन करने के लिए सीमित कर रहे हैं. एकल तरंगदैर्ध्य पढ़ाई के बारे में, सबसे पारंपरिक सूक्ष्मदर्शी बहुत मोटे तौर पर, आम तौर पर, 50-100 एनएम सफेद प्रकाश फिल्टर करने के लिए रंग फिल्टर का उपयोग करें. साइन बनाए रखते हुए SWSI के लिए एक लेजर का उपयोग कम से कम 1 एनएम तरंगदैर्ध्य चयन संकरीificant प्रकाश की तीव्रता 7. इसी तरह, एक तरंग दैर्ध्य सी. की तैराकी आवृत्तियों को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है वास्तविक समय 8 में एलिगेंस.

हमारे विधि का पहला प्रदर्शन के लिए, हम एक स्वतंत्र रूप से तैराकी सी. की क्षैतिज स्थिति, एक्स, और ऊर्ध्वाधर स्थिति, वाई, की निगरानी के बारे में एक सेंटीमीटर की दूरी पर एक पानी स्तंभ में एलिगेंस,. गुरुत्वाकर्षण भी खड़ी कार्य करता है के बाद से विशेष रूप से, हम ऊर्ध्वाधर आंदोलन में रुचि रखते हैं. यह पानी स्तंभ में उतरता है ऊर्ध्वाधर स्थिति के लिए एक रेखीय फिट की ढलान निमेटोड के ऊर्ध्वाधर गति, वी वाई, देता है:
सूत्र (1)

जड़ मतलब त्रुटि (RMSE) 9 के वर्ग फिट की गुणवत्ता को इंगित करता है और घटते गति आम तौर पर स्थिर है कि क्या इंगित करता है. ऊर्ध्वाधर गति तो पूर्वी वायु कमान के लिए औसत निकाला जाता हैज प्रजातियों और मृत कीड़े. इन परिणामों के प्रयोग, कीड़े अनुभव अनुमान लगाया जा सकता है जो खींचें.

हमारे विधि के दूसरे प्रदर्शन के लिए, हम सी. चयनित मनाया कीड़े के बहुमत के विपरीत एक स्थिर दर पर उतर नहीं था कि एलिगेंस. चयनित कीड़े घूमा और ऊपर की तरफ तैरा या वंश जारी रखने से पहले कुछ समय के लिए hovered या तो. शारीरिक रूप से, इस मामले का अध्ययन एक स्विमिंग सूक्ष्मजीव का जोर गणना की जा सकती है कि पता चलता है. न्यूटन के नियम निर्देशों में परिवर्तन है कि एक तो शरीर शुद्ध बल का तात्पर्य है, जो accelerates हुक्म है कि, फॉर्मूला 1 , शरीर है कि 10 पर काम कर रहा है:
फार्मूला 2 (2)

जहां पी हैरेखीय गति और टी समय है. कीड़ा के द्रव्यमान स्थिर बनी हुई है, क्योंकि कीड़ा के त्वरण कीड़ा पर अभिनय बल को सीधे आनुपातिक है. नतीजतन, खड़ी शुद्ध बल है:
फॉर्मूला 3 (3)

एम एक कीड़ा की बड़े पैमाने पर है और एक वाई खड़ी त्वरण का प्रतिनिधित्व करता है. ऊर्ध्वाधर दिशा में शुद्ध बल तो एक ही दिशा में कीड़ा जोर का प्रतिनिधित्व करता है. कुल जोर खाते में क्षैतिज घटक लेने से गणना की जा सकती.

Protocol

1. सी. एलिगेंस तैयारी

  1. युवा वयस्क सी. के पेट्री प्लेटों की तैयारी सी. के निलंबन से जुड़े पिछले प्रयोगों में वर्णित के रूप में एलिगेंस एक तरल पदार्थ भरा क्युवेट 11 में एलिगेंस.
  2. वीडियो विश्लेषण के दिन, सीधे चरण 2 में वर्णित के रूप में एक प्लैटिनम लेने का उपयोग विआयनीकृत, आसुत जल से भरा एक क्युवेट में रहते युवा वयस्क नेमाटोड लेने.
  3. मृत सी. तैयार करें क्लोरोफॉर्म जोखिम के साथ एलिगेंस. चरण 2 में वर्णित लाइव नेमाटोड चुनने के लिए वर्णित प्रक्रिया का पालन करते हुए आगे बढ़ें.

वीडियो विश्लेषण के लिए 2. ऑप्टिकल सेटअप

  1. चित्र 1 में दिखाया के रूप में छाया चित्र बनाने के लिए प्रयोगात्मक सेटअप इकट्ठे. कैमरा जब तक यह स्क्रीन के एक ललाट देखने पर कब्जा करने में सक्षम है के रूप में स्क्रीन से किसी भी दूरी पर रखा जा सकता है. एक अच्छी जगह स्क्रीन का सामना करना पड़ क्युवेट के बगल में है.
    1. कम से कम दो दर्पण का उपयोग करने केकिरण 12 मिमी की एक व्यास के लिए विस्तार किया गया है ताकि एक गलीली किरण विस्तारक में tunable हीलियम नीयन लेजर उत्पादन रास्ते पर लाना.
    2. किरण बाधित किया जा रहा बिना pinholes के माध्यम से गुजरता है तो किरण पथ में एक या दो pinholes रखें. संरेखण बनाए रखा है आश्वस्त करने के लिए pinholes का प्रयोग करें.
    3. 10 मिमी गहरी और 4 सेमी लंबा, 10 मिमी चौड़ी है कि एक घुड़सवार क्वार्ट्ज क्युवेट पर विस्तार किरण प्रत्यक्ष.
    4. 75 एमएम की एक सकारात्मक फोकल लंबाई के साथ एक Plano-उत्तल लेंस का उपयोग किरण बढ़ाना.
    5. लगभग 120 सेमी लेंस से एक प्रोजेक्शन स्क्रीन रखें. इस से अधिक दूरी छाया छवि का एक बड़ा बढ़ाई निकलेगा. हालांकि, छवि की गुणवत्ता एक कम रोशनी की तीव्रता और विवर्तन हस्तक्षेप का एक बढ़ा noticeability के साथ कम होगा.
    6. सही अगले स्क्रीन का सामना करना पड़ क्युवेट करने के लिए, कम से कम 60 एफपीएस में सक्षम है जो एक उच्च गति कैमरा, रखें.
  2. ऑप्टिकल सेट के पास एक विदारक माइक्रोस्कोप रखेंक्युवेट में नेमाटोड का तेजी से हस्तांतरण के लिए ऊपर.
  3. अस्थायी रूप से विस्तार किरण को सीधा क्युवेट धारक के केंद्र के लिए मिमी डिवीजनों के साथ एक पारदर्शी शासक को सुरक्षित इतना है कि किरण परियोजनाओं स्क्रीन पर शासक के एक बढ़ाया छवि. वीडियो विश्लेषण के लिए लंबाई पैमाने पर सेट.
    1. प्रोजेक्शन स्क्रीन पर, प्रक्षेपण के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए अनुमानित छवि से केंद्र एक पारदर्शी शासक बंद का उपयोग कर पैमाने दूरी निशान. वीडियो के लिए यहां क्लिक करें.
    2. इस छवि को रिकॉर्ड और बढ़ाई उपाय. सेटअप से शासक निकालें. कारण रंगीन aberrations के लिए अलग अलग होंगे लेंस के माध्यम से प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए प्रकाश के अपवर्तन के कोण के रूप में अन्य तरंग दैर्ध्य के लिए इस चरण को दोहराएँ.
  4. क्युवेट बदलें और आसुत जल के साथ रिम की 1 मिमी के भीतर करने के लिए इसे भरने.
  5. पैमाने दूरी उसी में शामिल है तो कमरे की बत्ती पर है जबकि रिकॉर्डिंग शुरूअनुमानित छवि के रूप में दृश्य. प्रकाश बंद करें.
  6. एक पतली, चपटा प्लैटिनम तार लेने का उपयोग करना, व्यक्तिगत युवा वयस्क सी. स्थानांतरित पानी की सतह के लिए ले छूकर क्युवेट में अगर प्लेट से एक समय में एलिगेंस एक. यह कारण बिखरे हुए प्रकाश को किरण प्रवेश करती है जब निमेटोड पानी स्तंभ में दिखाई हो जाएगा. वीडियो के लिए यहां क्लिक करें.
  7. वे विस्तार लेजर बीम के माध्यम से पारित रूप में कीड़े का अनुमान चित्र फिल्म. यह अनुमानित छवि उलटा है और कीड़े उनके वास्तविक गति से विपरीत दिशा में ले जाने के लिए दिखाई देगा कि नोट करना महत्वपूर्ण है. गुरुत्वाकर्षण के साथ उतरते रहे हैं कि कीड़े (चित्रा 2) स्क्रीन पर ऊपर की ओर ले जाने के लिए दिखाई देगा.

3. वीडियो डेटा तैयारी

  1. वीडियो विश्लेषण कार्यक्रम में वीडियो आयात.
  2. पहले से निर्धारित बढ़ाई कारक का उपयोग कर पैमाने पर सेट.
  3. ट्रासी.के. पूरे पथ पर कम से कम 10 डेटा अंकों के साथ छाया निमेटोड के सिर के रैखिक विस्थापन लिया.
  4. व्युत्पन्न ("वाई", "समय") लेने के द्वारा खड़ी दिशा में वेग का पता और 2.2 कदम में निर्धारित बढ़ाई पहलू से इस मूल्य को विभाजित.

4. डेटा विश्लेषण

  1. एक सी. के रैखिक वंश का विश्लेषण एलिगेंस:
    1. समय ग्राफ बनाम ऊर्ध्वाधर स्थिति पर डेटा बिंदु आम तौर पर एक सीधी रेखा के रूप में यह सुनिश्चित करने के लिए जाँच करें. कुछ विचलन के कारण निमेटोड का सिर आंदोलन को नजरअंदाज नहीं किया जा सकता है. डेटा बिंदुओं आम तौर पर, एक सीधी रेखा फार्म 4.1.2 कदम के लिए जारी रखते हैं, अन्यथा वंश nonlinear है और विश्लेषण इस प्रोटोकॉल में 5.1 कदम का उपयोग जारी रखा जाना चाहिए.
    2. विश्लेषण मेनू से डेटा को एक सीधी रेखा 12 फिटिंग द्वारा एक रेखीय प्रतिगमन लाइन बनाएँ. इस लाइन की ढलान तो सी के ऊर्ध्वाधर गति है.एलिगेंस. ढलान एक खास अंतराल पर समय में परिवर्तन से विभाजित स्थिति में परिवर्तन है. इस तरह से रहते हैं और मृत कीड़े के घटते गति (चित्रा 3) निर्धारित करते हैं.
    3. नेमाटोड से खड़ी तैराकी वेग औसत. 50 के बारे में कीड़े का एक नमूना आकार के लिए पर्याप्त है. मृत कीड़े में बहाव वेग के साथ रहते हैं कीड़े में तैरने वेग से तुलना कर लें.

5. सी. के nonlinear मोशन विश्लेषण एलिगेंस

  1. धारा 3 से, पानी स्तंभ के भीतर एक nonlinear वंश (चित्रा 4) से पता चलता है जो एक विश्लेषण किया वीडियो फ़ाइल का चयन करें. एक nonlinear वंश इस प्रोटोकॉल में कदम 4.1.1 का उपयोग कर पहचाना जा सकता है.
  2. वीडियो विश्लेषण सॉफ्टवेयर में 'विश्लेषण' मेनू से 'वक्र फिट' का चयन करें. एक दूसरा आदेश (द्विघात) बहुपद का चयन करें. वक्र फिट.
  3. ब्याज की एक क्षेत्र के लिए, प्रत्येक पक्ष ओ पर कोष्ठक फिसलने से ग्राफ पर फिट समायोजितच ग्राफ पर फिट की अवस्था तक फिट भीतर और / या अच्छी तरह से त्रुटि सलाखों के भीतर डेटा बिंदुओं के बहुत करीब है. फिटिंग कार्यक्रम समय बनाम ऊर्ध्वाधर स्थिति है जो सज्जित वक्र, के लिए एक गणितीय अभिव्यक्ति देता है. भौतिक गुणों के साथ जुड़े कार्यक्रम द्वारा दिए गए सज्जित वक्र त्रुटियों पर विचार करें. नीचे 15% या के एक रिश्तेदार त्रुटि आमतौर पर स्वीकार्य है.
  4. जोड़ें अधिक वक्र डेटा की अतिरिक्त वर्गों को कवर करने के लिए फिट बैठता है. इष्टतम कवरेज के लिए 13 कार्यों पट्टी: वक्र ओवरलैप हो गया है कि यह सुनिश्चित कर लें और आसन्न घटता संरेखित करने की कोशिश कि तो अतिव्यापी क्षेत्रों में ढलानों मैच.
  5. कदम 5.1.3 में प्राप्त गणितीय अभिव्यक्ति का उपयोग सज्जित वक्र के व्युत्पन्न लेने से ब्याज की एक क्षेत्र के लिए वेग प्राप्त करते हैं. वेग समय में भिन्न हो सकते हैं. व्युत्पन्न एक समारोह के ढलान है कि ध्यान दें. व्युत्पन्न गणितीय या रेखांकन भी प्राप्त किया जा सकता है. इस मामले में यह दिया गणितीय expr उपयोग करने के लिए व्यावहारिक हैession.
  6. त्वरण प्राप्त करने के लिए फिट घटता के दूसरे व्युत्पन्न ले. त्वरण समय में भिन्न हो सकते हैं.
  7. कीड़ा डाल रही है जो जोर, गणना करने के लिए कीड़ा जन द्वारा त्वरण गुणा करें. एक उचित अनुमान जन कीड़ा पानी की ज्यादातर होते हैं यह सोचते हैं कि 3 ग्राम है.

Representative Results

गिरता गिरते

पहली जांच सी. के घटते दरों में कोई अलग पहचाना अंतर से पता चलता है SWSI 633 एनएम का उपयोग कर के दौरान एलिगेंस. घटते दरों रहते हैं और मृत सी. दोनों के लिए 0.1 मिमी / सेकंड ± 1.5 मिमी / सेकंड में लगातार हो पाए गए एलिगेंस. 50 कीड़े का एक नमूना आकार जीवित और मृत कीड़े दोनों के लिए 7% की एक उचित विचरण उत्पन्न. खींचें बल गुरुत्वाकर्षण बल शून्य से उछाल बल के बराबर होती है, ताकि घटते गति स्थिर है, के बाद से कीड़े पर अभिनय नहीं त्वरण है. यह कीड़ा का घनत्व पानी की तुलना में थोड़ा बड़ा है कि तात्पर्य; हालांकि, यह नीचे अनुमानों के लिए एक निमेटोड का घनत्व मोटे तौर पर उस पानी का लगता है कि अभी भी व्यावहारिक है.

बदल रहा है दिशा

दूसरी जांच, एक मामले का अध्ययन, नेमाटोड दिशा बदलने में सक्षम हैं और के खिलाफ ऊपर की तरफ तैर कर सकते हैं कि यह दर्शाता हैगुरुत्वाकर्षण. उन घटता के दूसरे डेरिवेटिव समय बनाम त्वरण (चित्रा 5) ग्राफ के लिए splined किया जा सकता है तो दो घटता निमेटोड के ऊर्ध्वाधर विस्थापन के लिए लगाया गया.   यह एक अच्छा फिट बनाए रखते हुए यथासंभव कम बहुपद आदेश रखने की सलाह दी जाती है. एक कम बहुपद क्रम में समय के साथ त्वरण में कम भिन्नता को इंगित करता है. बहुपद का क्रम बहुत अधिक है, तो उच्च आदेश बहुपद शर्तों, नगण्य है, और इसलिए अनावश्यक हो जाएगा. यह कीड़ा 2 ± 0.002 मिमी / सेक 2, चारों ओर मुड़ता है और कुछ ही समय बाद जब तक एक ही दर 0.110 मिमी / सेक 2 ± 0.002 मिमी / सेक 2 में accelerates 0.110 मिमी / सेकंड की एक स्थिर दर पर decelerates प्रतिवर्तन बिंदु. सी. त्वरण शून्य तक गिर जाता है जब तक मिमी / सेक 2 में 0,00708 टी - एलिगेंस 1,252 के एक ह्रासमान तेजी के साथ ऊपर की ओर ले जाने के लिए जारी है. मन Eq में रखते हुए. 3, और 3 & # की अनुमानित कीड़ा जन956, छ, कृमि शीघ्र ही प्रतिवर्तन बिंदु के बाद तक 0.33 पी.एन. की एक ऊर्ध्वाधर शुद्ध बल, एफ NY, आए.

गिरते: गुरुत्वाकर्षण, खींचें, उछाल और जोर (चित्रा 6A): कीड़ा प्रतिवर्तन बिंदु तक पहुँच जाता है जब तक कीड़ा पर अभिनय बलों के तीन प्रकार के होते हैं. शुद्ध बल सभी तीनों सेनाओं के सदिश राशि के बराबर होती है. यहाँ हम ऊर्ध्वाधर घटक ही विचार करें:
एफ न्यूयॉर्क = एफ उप + F Ty-एफ जी + एफ बी (4)

एफ बी उछाल बल है. एफ जी परिमाण में बराबर लेकिन कीड़ा का घनत्व पानी की है कि है कि यह सोचते उछाल बल के दिशा में विपरीत है. Eq. 4 तो निम्नलिखित तरीके से लिखा जा सकता है:
एफ न्यूयॉर्क = एफ उप + F Ty (5)

एफ न्यूयॉर्क वंश के दौरान निरंतर बनी हुई है. इसका मतलब है किनिमेटोड प्रतिवर्तन बिंदु तक पहुँच जाता है जब तक एफ उप + F Ty निरंतर बनी हुई है. एफ उप पथ की शुरुआत है, जो शीर्ष पर सबसे बड़ा है, और गति से बदलाव बिंदु पर शून्य है जब तक धीरे - धीरे शून्य करने के लिए कम कर देता है, जबकि एफ Ty एफ न्यूयॉर्क स्थिर रखने के लिए वृद्धि होगी.

टर्नअराउंड: कार्यक्षेत्र गति उस बिंदु पर शून्य के बराबर होती है क्योंकि प्रतिवर्तन बिंदु पर खड़ी दिशा में कोई खींचें बल है. चित्रा 6B में दर्शाया के रूप में, एफ जी, उछाल, एफ बी और ऊर्ध्वाधर कीड़ा जोर, एफ TY - ऊर्ध्वाधर दिशा में अभिनय केवल बलों गुरुत्वाकर्षण, कर रहे हैं. इस बिंदु पर, सी. के जोर एलिगेंस निर्धारित किया जा सकता है:
एफ Ty = एफ न्यूयॉर्क (6)

प्रक्षेपवक्र के तल पर जोर तो कीड़ा के वजन के बारे में 0.001% है जो 0.33 पी.एन., के लिए लगभग बराबर है. में ले रहा हैखाते का अनुमान है कि वजन, एक सी. एफ जी एलिगेंस, 28 एन है

चढ़ाई: इसी तरह, चढ़ाई, खींचें बढ़ जाती है, लेकिन नीचे की ओर इशारा कर रहा है (चित्रा 6C) के दौरान:
एफ न्यूयॉर्क = एफ उप + F Ty (7)

कीड़ा द्वारा कार्यान्वित जोर अब भी बड़ा हो सकता है और खींचें बल की राशि और वजन के बराबर होना चाहिए. कीड़ा ऊपर तैरने की शुरुआत के बाद नीचे चल रही है. कीड़ा उतरा रूप में एक ही दर पर तैरने के लिए, कीड़ा कम से कम दो बार अपने वजन का एक उर्ध्व जोर डालती करना होगा.

मँडरा

के बारे में 3 सेकंड के लिए अपने वंश को धीमा कर देती है कि एक कीड़ा का एक उदाहरण चित्रा 7 में प्रस्तुत किया है.   एक 3 डिग्री बहुपद समग्र पथ के लिए एक उचित फिट है. इस फिट से त्वरण और वेग में त्रुटियों को कम से कम 15% है. कीड़ा एक महत्वपूर्ण upwa के साथ शुरू होता हैरोड जोर, धीमा और 68 सेकंड पर चारों ओर मोड़ करने के लिए शुरू होता है; हालांकि, ऊपर की ओर त्वरण लगातार कम हो जाती है (चित्रा 8)   शुद्ध त्वरण शून्य 68.5 के आसपास सेकंड के बराबर होती है जब तक. यह अंततः वेग में एक और शून्य बिंदु द्वारा पीछा नीचे की दिशा में एक शुद्ध त्वरण की ओर जाता है (9 चित्रा)   और निमेटोड 69 सेकंड में फिर से उतरना शुरू होता है.

यह इस मामले में अधिकतम मनाया खड़ी त्वरण 2.7 मिमी / सेक 2 है कि दिलचस्प है. मोड़ अंक पर त्वरण / सेक 2 0.455 मिमी और हैं - क्रमशः 0.455 मिमी / सेक 2; चारों ओर मुड़ता है और ऊपर तैरती कि निमेटोड के मामले में की तुलना में करीब चार गुना बड़ा. Eq का उपयोग करना. 6, यह ऊपर जोर पहला निर्णायक मोड़ पर लगभग 1.32 पी.एन. है कि अनुमान लगाया जा सकता है. ऊपर जोर 1.32 पी.एन. है कि इतनी दूसरा मोड़ पर, शुद्ध त्वरण नकारात्मक है.

ओ रखने together.within पृष्ठ = "हमेशा"> चित्रा 1
चित्रा 1. प्रायोगिक स्थापना. लेजर, किरण विस्तारक, लेंस और स्क्रीन प्रयोगात्मक स्थापना के लिए आवश्यक हैं. स्टीयरिंग दर्पण और pinholes छोड़ा जा सकता है, लेकिन ऑप्टिकल संरेखण कम स्थिर कर देगा.

चित्रा 2
चित्रा 2. एकल तरंगदैर्ध्य छाया छवि (SWSI). 543 एनएम लेजर प्रकाश से 2 मेगावाट एक कीड़ा की छाया का प्रयोग एक स्क्रीन पर पेश किया है. निमेटोड ऊपर की तरफ गिर करने के लिए प्रकट होता है, ताकि छवि उलटा है.

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एक भी wildtype सी. चित्रा 3. कार्यक्षेत्र वंश एक पानी स्तंभ में एलिगेंस. इस निमेटोड 633 एनएम सुसंगत प्रकाश द्वारा छायांकित किया गया था. रेखीय फिट की ढलान 0.01 मिमी / सेकंड ± 1.09 मिमी / सेकंड की एक नीचे गति को इंगित करता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. एक भी ऊपर की ओर तैराकी wildtype सी. के विस्थापन ग्राफ एलिगेंस. दो splined फिट बैठता निमेटोड के समग्र पथ का पता लगा. फिट का दूसरा व्युत्पन्न त्वरण का पता चलता है. 0.110 मिमी: अधिकतम त्वरण आसानी से पहले फिट से निर्धारित किया जाता है / सेक 2 ± 0.002 मिमी / सेक 2. डेटा अंक और फिट दिखाई रहना इतना है कि केवल कुछ त्रुटि सलाखों दिखाए जाते हैं. इस निमेटोड 633 एनएम सुसंगत प्रकाश द्वारा छायांकित किया गया था. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
एक भी wildtype सी. चित्रा 5. त्वरण ग्राफ एलिगेंस. इस निमेटोड इसे धीमा और फिर ऊपर की ओर ले जाने के लिए पैदा 0.110 मिमी / सेक 2 ± 0.002 मिमी / सेकंड 2 के एक निरंतर ऊपर की ओर त्वरण रखता है. फौरन प्रतिवर्तन बिंदु के बाद त्वरण तेजी से कम हो जाती है और शुद्ध त्वरण शून्य करने के लिए कम हो. जी "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
इन ताकतों का प्रभाव एक दूसरे को रद्द इतना है कि बिंदु और चढ़ाई. उछाल और गुरुत्वाकर्षण मोड़ वंश के लिए चित्रा 6. सेना आरेख, दिशा में परिमाण और विपरीत में बराबर हैं. वे इसलिए इन चित्र में दिखाया नहीं कर रहे हैं. (एक) कीड़ा खींचें और जोर ऊपर की ओर इशारा करते के साथ उतरते है. (ख) कीड़ा खींचें बिना प्रक्षेपवक्र के निम्न बिंदु पर है. जोर ऊपर इशारा कर रहा है. (ग) कीड़ा जोर ऊपर इशारा कर रहा है, जबकि ड्रैग नीचे ओर इशारा करते हुए के साथ आरोही है.

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चित्रा 7. एकल मँडरा निमेटोड का विस्थापन ग्राफ. कीड़ा धीमा और के बारे में 68 सेकंड में चारों ओर मोड़ करने के लिए शुरू होता है, लेकिन चारों ओर 69 सेकंड उतरते शुरू होता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

8 चित्रा
.. 8 चित्रा एक एकल मँडरा निमेटोड के त्वरण ग्राफ यह कीड़ा, 2.7 मिमी / सेकंड 2 के एक ऊपर की ओर तेजी के साथ शुरू होता है शून्य करने के लिए कम हो जाती है और अंत में की एक नीचे त्वरण है -. 2.6 मिमी / सेकंड 2 एक बड़ा vers देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के आयन.

9 चित्रा
चित्रा 9. एक भी मँडरा निमेटोड का वेग ग्राफ. यह कीड़ा 68 सेकंड में एक रोकने के लिए आता है और ऊपर की ओर सिर करने के लिए शुरू होता है, धीमा और एक वंश द्वारा पीछा 69 सेकंड में ऊर्ध्वाधर दिशा में शून्य वेग तक पहुँचता है. एक देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का बड़ा संस्करण.

तालिका 1
एन 2 सी. की तालिका 1. जवाब वंश वेग एलिगेंस. लाइव 50 और 50 मृत नेमाटोड tr रहे हैंउनके वंश के दौरान acked. descents के लिए औसत वेग रहते हैं और मृत कीड़े के लिए एक ही है: 0.1 मिमी / सेकंड ± 1.5 मिमी / सेक.

Discussion

SWSI तकनीक मुक्त रहने वाले नेमाटोड जैसे सूक्ष्म जीवों का locomotory क्षमताओं को समझने के लिए एक अतिरिक्त तरीका प्रदान करता है. इस तकनीक के साथ हम गुरुत्वाकर्षण के कारण मृत नेमाटोड पर संचालन के लिए सक्रिय हरकत (तैराकी) और निष्क्रिय बहाव के बीच प्रतिष्ठित किया है. मुक्त तैराकी नेमाटोड पानी में हरकत दौरान दिशा बदल जब इसके अलावा, हम नेमाटोड पर सक्रिय है और नेमाटोड द्वारा लगाए जाते हैं जो खींचें बलों और कोणीय बलों, उपाय करने में सक्षम हैं.

नेमाटोड मिट्टी के भीतर विभिन्न पर्यावरणीय स्थितियों का सामना. पानी मिट्टी के भीतर जेब, साथ ही ठोस कणों और अलग अलग आकार और बनावट की जैविक सामग्री के होते हैं. इसके अलावा, नेमाटोड वे 14 का जवाब है कि एक गुरुत्वीय वातावरण में मौजूद. इसके अलावा, मिट्टी की सतह के पास नेमाटोड अलग तरह के प्रकाश की तरंग दैर्ध्य, तापमान और आर्द्रता में परिवर्तन, और साथ ही सामने आ रहे हैं जैविकबैक्टीरिया, हिंसक कवक और अन्य मिट्टी जीवों की तरह चर. नेमाटोड, इन सभी विभिन्न चर को तैराकी और विभिन्न मीडिया में रेंगने, मोड़ और नौवहन रणनीति में फेरबदल जवाब चाहिए. इन जटिल गणनाओं के सभी केवल 302 न्यूरॉन्स, हरकत में शामिल हैं, जिनमें से एक सबसेट, और 95 शरीर दीवार मांसपेशियों की कोशिकाओं द्वारा किया जाता है. SWSI तकनीक द्वारा वर्णित प्रकार की माप नेमाटोड इस नौवहन जटिलता को पूरा कैसे महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं.

पहले भाग के लिए, हम wildtype सी. के समग्र घटते दर मापा है 633 एनएम प्रकाश में एलिगेंस. इन माप का उपयोग करना, हम खींचें बल एक कीड़ा मुठभेड़ों अनुमान कर सकते हैं.

एक त्वरक निमेटोड के मामले का अध्ययन के लिए, बलों की गति के साथ खींचें बल परिवर्तन के बाद से लगातार परिवर्तन शामिल किया गया. हम कीड़ा पर अभिनय बलों के बारे में बनाने में सक्षम हैं कि कुछ बयान कर रहे हैं. कीड़ा नीचे धीमा कर देती है और दप की कोशिश करता हैयह निमेटोड के प्रक्षेपवक्र की कम बिंदु पर शून्य तक पहुँच जाता है जब तक Im ऊपर की ओर खींचें बल के ऊर्ध्वाधर घटक कम हो जाती है. इस बिंदु पर, कीड़ा ऊपर तैरने के लिए एक ऊपर की ओर बल होना चाहिए.

यह विधि कई मायनों में संशोधित किया जा सकता है. एक साफ तरल में नेविगेट करता है कि किसी भी सूक्ष्म प्रजातियों SWSI का उपयोग कर लगाया जा सकता है. अध्ययनों से डिजिटल कैमरों के लिए पहुंच रहे हैं कि किसी भी तरंग दैर्ध्य के साथ आयोजित किया जा सकता है. डिजिटल कैमरों आमतौर पर यूवी से पास आईआर को लेकर तरंग दैर्ध्य ले जाएगा. इसके अलावा, क्षैतिज पढ़ाई खड़ी ऊपर की ओर लेजर निर्देशन द्वारा आयोजित किया जा सकता है. प्रजातियों तो एक खुर्दबीन स्लाइड की तरह, एक क्षैतिज पारदर्शी सतह पर रखा जा सकता है. किरण विस्तारक के बाद किरण विस्तारक या आवर्धक लेंस समायोजित करना blurry छवियों पैनापन ला सकता है. उपयोगकर्ता सुसंगत और आसान बीम संरेखण सुनिश्चित करने के लिए मेज पर सभी घटकों को दृढ़ करने के लिए सुनिश्चित किया जाना चाहिए.

विधि उपलब्ध लेजर wavelengt द्वारा सीमित हैएच एस और संकल्प. सेटअप सरल है क्योंकि संक्षेप में दिशाओं और तरंग दैर्ध्य में लचीलापन हैं जो मौजूदा सूक्ष्मदर्शी, पर इस विधि का लाभ भी कमजोरियों हैं. लेजर का अपरिष्कृत प्रकाशिकी और speckles के संकल्प की सीमा. इन कमियों के कुछ निश्चित रूप से स्थानिक फिल्टर सहित और एक सीसीडी कैमरे पर सीधे छवि पेश करने से भविष्य में सुधार किया जा सकता है.

प्रयोग पहली बार किया जाता है के रूप में प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम आसानी से सीखा जा सकता है. अशांति पैदा करने के बिना क्युवेट में निमेटोड रखने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, कंपन सेटअप परेशान और कीड़े के व्यवहार को बदल सकता है. छवि छाया के लिए इस्तेमाल किया जाता है जो शक्ति, सीमित करने के लिए सुनिश्चित करें. व्यास में 1 मिमी है कि एक लेजर बीम के लिए 2 मेगावाट ताप प्रभाव से बचने के लिए अधिक से अधिक होना चाहिए. सेटअप आसुत जल से अन्य तरल पदार्थ का उपयोग करते समय प्रभाव बिखरने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए.

वर्तमान में सबसे Microscopes तरंगदैर्ध्य रेंज में अभी भी बहुत व्यापक हैं, जो श्वेत प्रकाश या रंग फिल्टर का उपयोग कर एक क्षैतिज विमान पर कार्य करते हैं. सही मायने में एक तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें और देखने के परिदृश्य में लचीलापन, यानी क्षैतिज प्लेसमेंट है कि सूक्ष्मदर्शी, आमतौर पर एक लाभ या अन्य करने के लिए सीमित कर रहे हैं. इसके अलावा, सूक्ष्मदर्शी के इन प्रकार आमतौर पर बहुत महंगा है और अभी भी हमारे विधि के विपरीत फोकल विमानों के लिए सीमित कर रहे हैं. हमारे सेटअप आसानी से एक बहुत ही कम बजट के साथ बनाया जा सकता है. इस विधि थोड़ा धन के साथ काम करते हैं कि स्कूलों, पर्यावरण कंपनियों के साथ ही अन्य संस्थाओं द्वारा इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है. भविष्य में, इस विधि हरकत और सूक्ष्म प्रजातियों की mechanosensation पर वास्तविक समय प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक बहुत परिष्कृत सेटअप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस विधि के कोण और आसानी से उपलब्ध देखने गहराई की एक विस्तृत श्रृंखला में एकल तरंगदैर्ध्य पढ़ाई करता है.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम वासर कॉलेज अंडर ग्रेजुएट रिसर्च ग्रीष्मकालीन संस्थान (URSI), लुसी मेनार्ड सामन रिसर्च फंड, नासा पुरस्कार नहीं NX09AU90A, विज्ञान और प्रौद्योगिकी (NSF-शिखा) में अनुसंधान उत्कृष्टता के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन केंद्र पुरस्कार नहीं के समर्थन के लिए आभारी हैं 0630388 और NSF पुरस्कार सं 1058385.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tunable Helium-Neon laser  Research Electro-Optics 30602 Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm.
2 Front Surface Aluminum Mirrors Thorlabs PF10-03-F01
High Speed Exilim Camera Casio
Quartz Cuvette Starna Cells 21/G/5
LoggerPro (Software) Vernier http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8 Wolfram http://www.wolfram.com/
5x-10x variable zoom Galilean beam expander Thorlabs BE05-10-A
Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm Thorlabs LA1257

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References

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