प्रोटीन डीएनए सहभागिता के अध्ययन के लिए एकल अणु हेरफेर और इमेजिंग का मेल

Biology

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Summary

यहाँ हम दो ऑप्टिकली फंस microspheres के बीच निलंबित एक एकल डीएनए अणु के साथ बातचीत के एक fluorescently लेबल प्रोटीन के अणुओं का पता लगाने के लिए उपकरण और विधियों का वर्णन.

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Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions. J. Vis. Exp. (90), e51446, doi:10.3791/51446 (2014).

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Abstract

Introduction

एक अणु (एस) तकनीक काफी पारंपरिक, थोक समाधान माप 1-3 की सीमाओं में से कुछ पर काबू पाने की जरूरत पर प्रतिक्रिया के लिए पिछले तीस वर्षों में विकसित किया है. एकल जैविक अणुओं के हेरफेर जैवपॉलिमरों 4 के यांत्रिक गुणों को मापने और प्रोटीन, प्रोटीन 5 और प्रोटीन डीएनए बातचीत 6,7 के यांत्रिक मापदंडों को नियंत्रित करने के लिए अवसर पैदा कर दी है. एसएम प्रतिदीप्ति का पता लगाने, दूसरी ओर, स्थानीयकृत और नैनोमीटर परिशुद्धता साथ एकल अणुओं पर नज़र रखने की संभावना के लिए अग्रणी, इन विट्रो में और vivo में प्रोटीन गतिविधि के अध्ययन के लिए एक अविश्वसनीय बहुमुखी उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है. एस.एम. छवि को साधन बिंदु फैल समारोह की फिटिंग के माध्यम से, वास्तव में, एक एक सटीक संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR) पर मुख्य रूप से निर्भर करता है और के बारे में एक नैनोमीटर 8,9 की एक सीमा तक पहुँचने के साथ स्थानीयकरण पूरा कर सकते हैं. इन तरीकों शक्तिशाली लगता हैमोटर प्रोटीन की गतिशीलता के अध्ययन में आवेदन पत्र, साथ ही साथ के डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन में लक्ष्य खोज अंतर्निहित प्रसार प्रक्रियाओं. लक्ष्य पर एक डीएनए अनुक्रम का समारोह, निवास समय के रूप में प्रसार स्थिरांक का निर्धारण करने और सही ढंग से एक आयामी प्रसार घटनाओं के दौरान पता लगाया डीएनए लंबाई मापने की क्षमता, प्रोटीन डीएनए बातचीत की गतिशीलता के अध्ययन के लिए और जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व विशिष्ट लक्ष्य खोज के तंत्र की.

हाल ही में, इन दो तकनीकों के संयोजन उदाहरण के लिए (उदाहरण के लिए एक actin रेशा या एक डीएनए अणु) एक बातचीत साथी एंजाइम की और पहचान / स्थानीयकरण एक जैविक सब्सट्रेट के एक साथ हेरफेर सक्षम करने प्रयोगात्मक setups 10-14 की एक नई पीढ़ी (उत्पादन किया गया है मायोसिन- या एक डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन). इन तकनीकों का लाभ मुख्य रूप से इस प्रकार ENA फंस बहुलक से अधिक यांत्रिक नियंत्रण exerting की संभावना पर आरामबलों या torques बनाम बातचीत की गतिशीलता का अध्ययन bling. इसके अलावा, कार्यप्रणाली क्लासिक एस.एम. तरीकों, यानी, एक सतह पर अध्ययन के तहत अणुओं के स्थिरीकरण के लिए की जरूरत (कांच स्लाइड या microspheres) के मुख्य सीमाओं में से एक परहेज, सतह से दूर जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए अनुमति देता है.

दो एकल अणुओं तकनीक के संयोजन मुख्य रूप से यांत्रिक स्थिरता और 15 (विशेष रूप से एनएम परिशुद्धता के साथ स्थानीयकरण की आवश्यकता होती है) पर्याप्त SNR की आवश्यकताओं से उत्पन्न होने वाली कई तकनीकी कठिनाइयों पर काबू पाने की आवश्यकता है. ऑप्टिकल चिमटी, शोर में कमी के साथ एस.एम. प्रतिदीप्ति पता लगाने युग्मन और फँसाने अवरक्त लेजर 16 और जैविक परिसरों की विधानसभा और प्रयोगात्मक माप 11 के प्रदर्शन के लिए जैव रासायनिक buffers के नियंत्रण से photobleaching जब विशेष रूप से, सर्वोपरि महत्व के हैं. यहाँ, हम सफल प्रदर्शन के लिए विधियों का वर्णनएक दोहरी फँसाने / एसएम प्रतिदीप्ति स्थानीयकरण सेटअप में माप. कार्यप्रणाली विशिष्ट Laci बंधन दृश्यों (यानी, ऑपरेटरों) युक्त लैक्टोज repressor प्रोटीन (Laci) fluorescently (Atto532) के साथ लेबल और यह (दो ऑप्टिकल चिमटी के बीच फंस) एक डीएनए अणु को बांध के रूप में पहचान की उदाहरण के साथ सचित्र है. हम लक्ष्य खोज की प्रक्रिया में अपनी समोच्च साथ डीएनए और प्रसार के लिए Laci के बंधन का पता लगाने में विधि की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करता है. विधि डीएनए अनुक्रम और डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन का कोई भी संयोजन के साथ ही अन्य प्रणालियों (सूक्ष्मनलिकाएं या एक्टिन तंतु और उनके साथ बातचीत के दौरान मोटर प्रोटीन) के लिए लागू है.

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Protocol

Nanometer स्थिरता के साथ 1 ऑप्टिकल चिमटी सेटअप

प्रयोगात्मक सेटअप 1% से नीचे फँसाने लेजर के नैनोमीटर स्तर और तीव्रता के उतार चढ़ाव में स्थिरता ओर इशारा करते हुए के साथ दो ऑप्टिकल चिमटी प्रदान करनी चाहिए. इन स्थितियों के संयोजन ठेठ तनाव के तहत dumbbell की नैनोमीटर स्थिरता को आश्वस्त करेंगे (1 PN - कुछ पी.एन. के दसियों), जाल कठोरता (0.1 पी.एन. / एनएम) और माप बैंडविड्थ (छवि अधिग्रहण की दर 20 सेकंड -1). प्रयोगात्मक स्थापना की एक योजना चित्र 1 में दिखाया गया है.

  1. ऑप्टिकल चिमटी डिजाइन और निर्माण 15,17:
    1. यांत्रिक कंपन को कम करने के लिए सक्रिय isolators साथ एक ऑप्टिकल टेबल पर प्रयोगात्मक तंत्र माउंट. ध्वनिक शोर और माइक्रोस्कोप संरचना के यांत्रिक अनुनादों अवशोषित करने के लिए elastomeric isolators पर खुर्दबीन संरचना माउंट.
    2. अनुसंधान करने के लिए, लेजर स्रोत के पास, फँसाने लेजर के रास्ते में एक ऑप्टिकल अलगाने डालेंकारण ऑप्टिकल प्रतिक्रिया के लिए यादृच्छिक आयाम उतार चढ़ाव निष्कर्ष निकालना.
    3. जितना संभव फँसाने लेजर के पथ लंबाई कम और हवा धाराओं और अशांति की वजह से लेजर ओर इशारा करते हुए उतार चढ़ाव को कम करने के लिए एक मोहरबंद बॉक्स में पूरे पथ लगा देना.
    4. Orthogonal polarizations साथ दो मुस्कराते में: (YAG लेजर, 1,064 एनएम तरंगदैर्ध्य एन डी) एक भी लगभग अवरक्त लेजर स्रोत बंटवारे से डबल ऑप्टिकल चिमटी बनाएँ. वे तनाव 12 के तहत dumbbell के दोलन का कारण है क्योंकि समय साझा जाल का प्रयोग न करें.
    5. (कम से कम) एक ट्रैप और डीएनए तनाव की सटीक विनियमन के ठीक आंदोलनों अनुमति देने के लिए प्रत्यक्ष डिजिटल Synthesizers (DDSs) द्वारा संचालित acousto ऑप्टिक deflectors (AODs) का प्रयोग करें. DDSs वोल्टेज नियंत्रित थरथरानवाला (VCOs) की तुलना में एक बेहतर जाल स्थिरता अनुमति देते हैं.
    6. उप एनएम सटीकता के साथ फंस मोतियों की स्थिति का पता लगाने के कंडेनसर के पीछे फोकल हवाई जहाज़ में दो वृत्त का चतुर्थ भाग डिटेक्टर photodiodes (QDPs) डालें.
  2. उस तीव्रता च जाँचेंमाइक्रोस्कोप द्वार पर फँसाने लेजर के luctuations छवि अधिग्रहण की दर से भी बड़ा एक बैंडविड्थ के साथ एक photodiode का उपयोग करके 1% से नीचे हैं.
  3. दो फँसाने लेज़रों की ओर इशारा करते हुए स्थिरता की जांच:
    1. फॉस्फेट बफर में सिलिका मोती तैयार: सिलिका मोतियों की 20 μl पतला (1.54 माइक्रोन, 10% ठोस) एसीटोन के 1 मिलीलीटर में, संक्षेप में 30 सेकंड, भंवर sonicate, और अपकेंद्रित्र 2 मिनट में 19,000 एक्स जी. 1 मिलीलीटर एसीटोन और दोहराने धोने में resuspend. 50 मिमी फॉस्फेट बफर के 1 मिलीग्राम, में Resuspend 2 बार धो, और अंत में 50 मिमी फॉस्फेट बफर के 100 μl में resuspend.
    2. सिलिका मोतियों के साथ ऑप्टिकल चिमटी जांचना: (लगभग 60 माइक्रोन मोटी) डबल चिपचिपा टेप का उपयोग कर एक खुर्दबीन स्लाइड के लिए एक coverslip संलग्न द्वारा एक प्रवाह सेल तैयार करते हैं. 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए प्रवाह और 3 मिनट इंतज़ार करो. सिलिका मोती फॉस्फेट बफर में 1/1000 पतला प्रवाह और सिलिकॉन तेल के साथ प्रवाह चैम्बर सील. जाल प्रत्येक जाल में मनका और शक्ति स्पेक्ट्रम विधि 18 का उपयोग कर के जाल जांचना. Pentyl एसीटेट और nitrocellulose में सिलिका मोती तैयार: सिलिका मोतियों की 20 μl पतला (1.54 माइक्रोन, 10% ठोस) एसीटोन के 1 मिलीलीटर में, संक्षेप में 30 सेकंड, भंवर sonicate, और अपकेंद्रित्र 2 मिनट में 19,000 एक्स जी. 1 मिलीलीटर एसीटोन और दोहराने धोने में resuspend. और pentyl एसीटेट के 1 मिलीलीटर में Resuspend 2 बार धो लो. अंत में pentyl एसीटेट में भंग 0.1% nitrocellulose साथ pentyl एसीटेट में उन्हें resuspend.
    3. एक दूसरे coverslip (24 X 60 मिमी) का उपयोग कर एक coverslip (24 x 24 मिमी) की सतह पर pentyl एसीटेट 0.1% nitrocellulose में भंग 1.54 माइक्रोन व्यास सिलिका मोती के 2 μl बिखरा हुआ है. एक प्रवाह सेल बनाने के लिए दो तरफा टेप के दो टुकड़े का उपयोग कर एक खुर्दबीन स्लाइड पर coverslip संलग्न. 50 मिमी फॉस्फेट बफर के साथ प्रवाह सेल भरें और सिलिकॉन तेल के साथ इसे सील.
    4. 2,000X बढ़ाई brightfield माइक्रोस्कोपी में छवि एक सिलिका मनका. मनका छवि 190 पी की एक व्यास है कि इतना देखने के क्षेत्र, 768 x 576 पिक्सेल पर हासिल 7 एक्स 5 माइक्रोन होना चाहिएixels. रेफरी. 17 में के रूप में, विवर्तन के छल्ले से छवि केन्द्रक और जेड से XY स्थिति की गणना और एनएम सटीकता या बेहतर के साथ एक piezo मंच चलती drifts को सही है कि, एक प्रतिक्रिया सॉफ्टवेयर के साथ थर्मल drifts क्षतिपूर्ति.
    5. मनका केंद्र के साथ छोड़ जाल के केंद्र ओवरलैप (QDP से XY संकेत स्तर अंशांकन के दौरान मापा ही होना चाहिए) और स्थिति शोर और QDP से अपने मानक विचलन उपाय. सही जाल के लिए माप दोहराएँ.

Nanometer सटीकता के साथ 2 एक अणु स्थानीयकरण

  1. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी डिजाइन और निर्माण 15,19
    1. नैनोमीटर स्थानीयकरण सटीकता के लिए आवश्यक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात तक पहुँचने के लिए एक उच्च मात्रा दक्षता और इलेक्ट्रॉन गुणा सीसीडी का उपयोग करें.
    2. एक छवि पिक्सेल आकार ~ 80 एनएम पाने के लिए प्रकाशिकी चुनें (उदाहरण के लिए, 16 माइक्रोन का एक कैमरा पिक्सेल आकार के साथ एक छवि बढ़ाई ~ 200X). इस suffi हैpixelation 8 की वजह स्थानीयकरण त्रुटि की उपेक्षा ciently छोटे, लेकिन पर्याप्त बड़ी पिक्सेल प्रति फोटॉनों के एक काफी संख्या में एकत्र करने के लिए.
    3. उत्तेजना स्रोत के रूप में, भले ही उनके अभिविन्यास के एकल chromophores की उत्तेजना को अधिकतम करने के लिए लेजर (एक गैर ध्रुवीकरण को बनाए रखने के लिए ऑप्टिकल फाइबर के माध्यम से पारित करके) unpolarized है कि प्रकाश या चक्राकार (एक λ / 4 waveplate से गुजर द्वारा) ध्रुवीकरण का उपयोग करें.
    4. कुशलतापूर्वक कट ऑफ कि दोनों उत्तेजना और फँसाने लेजर रोशनी उत्सर्जन bandpass फिल्टर चुनें. नोट: हमारे प्रयोगों में हम Atto532 डाई के साथ हमारे प्रोटीन लेबल और 100 एनएम बैंडविड्थ के साथ 600 एनएम पर केंद्रित एक bandpass उत्सर्जन फिल्टर इस्तेमाल किया.

3 Microfluidics

बफर मुद्रा और 'dumbbell' विधानसभा, यानी, दो ऑप्टिकली फंस microspheres के बीच एक एकल डीएनए अणु के प्रस्तोता, एक कस्टम निर्मित लामिना मल्टीचैनल प्रवाह का एक सटीक नियंत्रण हासिल करने के लिएसिस्टम विकसित किया जाना चाहिए. यह एक प्रवाह कक्ष, एक दबाव जलाशय और एक दबाव नियंत्रण प्रणाली (चित्रा 2) से बना है.

  1. प्रवाह सेल तैयारी
    नोट: प्रोटीन डीएनए बातचीत पर एकल अणु प्रयोगों के लिए इस्तेमाल प्रवाह चैम्बर 4 समानांतर बफर प्रवाह अप करने के लिए अनुमति देने के लिए, अधिमानतः 4 inlets और 1 आउटलेट है, विभिन्न प्रयोग के लिए आवश्यक घटकों में से एक युक्त हर एक: मोती, डीएनए, प्रोटीन, और इमेजिंग बफर fluorescently लेबल. प्रवाह चैनलों में घटकों के पृथक्करण dumbbell के कुशल विधानसभा अनुमति देता है. इसके अलावा, इमेजिंग चैनल कुछ नैनोमीटर के आदेश के एक परिशुद्धता के साथ डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के स्थानीयकरण के लिए आवश्यक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात diffusing प्रोटीन से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति बचने के लिए और प्राप्त करने के लिए उपयोगी है.
    1. 4 inlets और एक दुकान बनाने के क्रम में एक हीरे की नोक के साथ खुर्दबीन स्लाइड (76 x 76 x 1 मिमी) में ड्रिल 1 मिमी व्यास छेद,.
    2. स्वच्छ वेंई माइक्रोस्कोप इथेनॉल के साथ स्लाइड और डाला हे अंगूठी और उपयोग छेद के आसपास के स्लाइड में चिपकने की अंगूठी के साथ पोर्ट केंद्र. यह gluing प्रक्रिया में खलल डालते जो उंगलियों के निशान, से बचने के लिए इस कदम के दौरान दस्ताने पहनने के लिए मौलिक है.
    3. स्लाइड को NanoPorts दबाना, और पूरा लगाव अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में जगह है.
    4. कागज के एक टुकड़े पर प्रवाह सेल की रूपरेखा पैटर्न ड्रा. चैनलों ~ 3 मिमी चौड़ी हो और खुर्दबीन स्लाइड पर छेद स्थिति से मेल खाना चाहिए.
    5. Parafilm के दो टुकड़े के शीर्ष पर ड्राइंग, जगह और एक स्केलपेल के साथ तैयार की रूपरेखा साथ तेज और सतत कटौती कर. का गठन किसी भी उभार निकालें. सिर्फ एक स्वच्छ समर्थन की गारंटी करने के लिए प्रयोग किया जाता है जो कम Parafilm परत, त्यागें.
    6. उल्टा धातु समर्थन में संलग्न NanoPorts युक्त खुर्दबीन स्लाइड रखें.
    7. ध्यान से यकीन है कि वें बनाने, छेद के साथ Parafilm कक्ष रूपरेखा संरेखितparafilm पर चैंबर के inlets और आउटलेट obtrude नहीं है.
    8. एक साफ खुर्दबीन coverslip (62 x 56 x 0.15 मिमी) के साथ कवर और ध्यान से चैम्बर आसपास के अतिरिक्त Parafilm हटा दें.
    9. उस पर लगातार दबाव लागू करने के लिए प्रवाह सेल के शीर्ष पर पहले से 120 डिग्री सेल्सियस पर गरम दो गर्मी ब्लॉक, रखें. Parafilm लगभग 25 मिनट के लिए पिघल करते हैं.
  2. दबाव जलाशय और बफर कंटेनरों
    दबाव जलाशय Plexiglas (या समान) से बना है और छह बफर कंटेनरों के आवास की अनुमति दिया जाना चाहिए. कम से कम दो अतिरिक्त बफर कंटेनर होने की संभावना साधन लचीलेपन में सुधार. फंस हवाई बुलबुले की कि पारदर्शी कंटेनर और काफी प्रवाह प्रणाली से निपटने में सहायता ट्यूब और समस्या निवारण पर ध्यान दें. Plungers पहले हटा दिया गया है, जिसमें से बाँझ और प्रयोज्य luer ताला टिप सीरिंज (2.5 मिलीलीटर),, अच्छा बफर कंटेनर हैं और इनलेट टयूबिंग के साथ एक आसान कनेक्शन की अनुमति. सुनिश्चित करें किकुल तरल पदार्थ की मात्रा दबाव जलाशय, चिकनी और स्थिर प्रवाह प्राप्त करने के लिए आवश्यक एक शर्त के अंदर हवा की मात्रा के साथ तुलना में छोटा है.
    1. प्रयोगों के दौरान चालू या बंद बफर प्रवाह बदल के लिए बफर कंटेनरों के बाहर निकलने पर बंद वाल्व कनेक्ट करें.
    2. खुर्दबीन मंच पर प्रवाह सेल माउंट. Polyetheretherketone ट्यूबिंग (भीतरी व्यास ~ 150 माइक्रोन) और flangeless फिटिंग के साथ प्रवाह चैम्बर inlets को बंद वाल्व कनेक्ट करें. ट्यूबिंग और प्रवाह सेल के NanoPort विधानसभाओं के बीच एक कड़ी के रूप में fluorinated ईथीलीन Propylene ट्यूबिंग का ~ 3 सेमी (भीतरी व्यास ~ 500 माइक्रोन) जोड़ें. इस कदम कांच से प्रवाह सेल या NanoPort टुकड़ी का टूटना से बचने के लिए कक्ष के प्रवेश द्वार पर बफर प्रवाह को कम करने के लिए आवश्यक है. बड़े भीतरी व्यास ट्यूबिंग का उपयोग अकेले, दूसरे हाथ पर, जैविक नमूने की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होगी.
    3. वायुमंडलीय दबाव पर एक खुला फाल्कन ट्यूब प्रवाह चैम्बर के आउटलेट से कनेक्ट करें. इसट्यूब प्रवाह चैम्बर से बाहर बहने बफर के लिए निपटान के रूप में कार्य करता है.
  3. दबाव नियंत्रण प्रणाली
    1. सूक्ष्मता दबाव जलाशय के अंदर हवा के दबाव को एडजस्ट करने में सक्षम एक दबाव नियंत्रण प्रणाली का निर्माण. इस दो कंप्यूटर नियंत्रित solenoid वाल्व, एक एक 0.5 एटीएम दबाव स्रोत से जुड़ा (कंप्रेसर) और वायुमंडलीय दबाव को एक दूसरे का उपयोग करके किया जा सकता है. Solenoid वाल्व बार बार बढ़ाने या वांछित मूल्य तक पहुँच जाता है जब तक लाइन में दबाव कम करने के लिए लगभग 7 मिसे के लिए खोल रहे हैं. नोट: इस दृष्टिकोण कार्लोस Bustamante 20 से अनुकूलित, और यह एक कदम मोटर सिरिंज पंप 21 का उपयोग कर से एक सहज प्रवाह पैदावार था.
    2. दबाव जलाशय पर लगाए गए प्रभावी दबाव की निगरानी के लिए एक कस्टम लिखा सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित एक दबाव transducer जोड़ें. विशिष्ट काम के दबाव dumbbell विधानसभा और प्रवाह प्रणाली घटकों धोने के लिए 200 एमबार के लिए 20 मिलीबार के आदेश पर हैं.

    Biotinylated Deoxycytidine Triphosphate साथ 4 डीएनए पीछा (बायोटिन dCTP)

    डीएनए अणु अब से 1 माइक्रोन फंस मोती प्रवाह और प्रस्तोता के तहत अपने विस्तार की सुविधा के लिए किया जाना चाहिए. इसके अलावा, एक लंबे समय से डीएनए डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन रोशन से आईआर फँसाने प्रकाश पाएगा. इस वजह से आईआर प्रकाश के अवशोषण में वृद्धि हुई photobleaching में एक उत्साहित क्रोमोफोर परिणामों से विशेष प्रासंगिकता की है. नोट: वर्तमान अध्ययन में, डीएनए अणु 3.7 माइक्रोन लंबा था. अणु प्राथमिक ऑपरेटर O1 की तीन प्रतियां और दो सहायक संचालक, O2 और ओ 3 में से प्रत्येक की एक प्रतिलिपि निहित. इन दृश्यों इस प्रकार फंस मोती और आईआर लेजर बीम से लगभग समान दूरी पर है, जिसके परिणामस्वरूप अणु के बीच में डाला गया है.

    1. बायोटिन-14-dCTP की 60 pmol, 5x टर्मिनल deoxynucleotidyl transferase (TdT) बफर के 4 μl (1 एम पोटेशियम सीए के साथ रैखिक डीएनए 3'-समाप्त होता है 1 pmol मिक्सcodylate, 125 मिमी Tris, 0.05% (v / v) ट्राइटन X-100, 5 मिमी CoCl 2 20 μl की कुल मात्रा के लिए) और TdT के 1.5 μl और DDH 2 ओ (25 डिग्री सेल्सियस पर पीएच 7.2). 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण सेते हैं. यह डीएनए छोर प्रति 60 nucleotides के अलावा परिणाम होगा. 3'-overhangs recessed या कुंद सिरों से अधिक दक्षता के साथ पूंछ रहे हैं कि डीएनए नोट.
    2. TdT प्रतिक्रिया बफर से CoCl 2 दूर करने के लिए स्पिन कॉलम या फिनोल / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और बाद में इथेनॉल तेज़ी के साथ पुच्छ डीएनए शुद्ध.
    3. शोधन के बाद, डीएनए कई हफ्तों के लिए या लंबी अवधि के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत लेकिन दोहराया विगलन और बचने की जा सकती है.

    5 लेबल प्रोटीन ATTO532 साथ thiol समूहों

    सिस्टीन अवशेषों के संशोधन के माध्यम से लेबल प्रोटीन गतिविधि में परिवर्तन नहीं करना चाहिए. इस समस्या को दूर करने के लिए, हम एक Laci उत्परिवर्ती, LacIQ231C, जो इस्तेमाल कियाज प्रोटीन स्थिरता 22 के साथ हस्तक्षेप नहीं दिखाया गया है स्थिति 231. इस उत्परिवर्ती स्थिति 231 पर जंगली प्रकार और रासायनिक संशोधनों की एक ही विशेषताओं को बरकरार रखता है पर मोनोमर प्रति सिर्फ एक सिस्टीन किया जाता है. नोट: हम ATTO532 maleimide साथ प्रोटीन लेबल.

    1. प्रोटीन 7.0-7.5 और 2 से 10 मिलीग्राम / मिलीलीटर से लेकर एक एकाग्रता के साथ लेकर एक पीएच के साथ एक बफर में भंग कर रहा है कि यह सुनिश्चित करें. नोट: इन प्रयोगों में, Laci पोटेशियम फॉस्फेट 0.3 एम, 5% ग्लूकोज, 7.5 पीएच (एक बफर) में भंग कर दिया गया.
    2. भंग Tris- (2 carboxyethyl) एच 2 ओ में 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए phosphine हाइड्रोक्लोराइड (TCEP) TCEP समाधान का उपयोग करने के लिए नए सिरे से पहले तैयार किया जाना चाहिए.
    3. ध्यान से 3 μl TCEP और भंवर के साथ प्रोटीन की 100 μl मिलाएं.
    4. कम रोशनी हालत में काम कर रहे 10 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए एन, एन -dimethylformamide (DMF) में डाई भंग. भंवर जब तक पूरी तरह भंग.
    5. रिएक्शन मीलX: ध्यान से प्रोटीन + TCEP और भंवर के लिए डाई के 33 μl जोड़ें. तेजी से स्पिन जितना संभव समाधान इकट्ठा करने के लिए.
    6. 20 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन (8000 आरपीएम) में 2 घंटे के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं (या 4 डिग्री कंपनी / एन पर), प्रकाश से रक्षा की.
    7. एल Glutathione एच 2 ओ में 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता (GSH) कम भंग प्रतिक्रिया मिश्रण को 3 μl जोड़ें और 15 मिनट के लिए 8000 rpm पर हिलनेवाला पर सेते हैं. GSH thiol समूहों की जेट अवरुद्ध द्वारा प्रतिक्रिया बंद हो जाएगा.
    8. मानक जेल निस्पंदन कॉलम, डायलिसिस या स्पिन संकेंद्रक का उपयोग लेबल प्रोटीन शुद्ध. नोट: इन प्रयोगों में, लेबल Laci 10 केडीए कटऑफ स्पिन संकेंद्रक का उपयोग कर शुद्ध किया गया.
      1. 8000 XG, 1 घंटा, 4 डिग्री सेल्सियस पर यह बफर एक के ऊपर से 12 मिलीलीटर के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण पतला concentrator डिवाइस के लिए लागू होते हैं, और अपकेंद्रित्र. लेबल Laci इस प्रकार लगभग 500 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए ध्यान केंद्रित किया है और अतिरिक्त रंग फ़्लो में झिल्ली गुजरता हैडब्ल्यू के माध्यम से. प्रवाह के माध्यम से और दोहराने कदम 5.8.1 कम से कम तीन बार त्यागें.
    9. -80 डिग्री सेल्सियस पर छोटे aliquots और दुकान में लेबल प्रोटीन फूट डालो. दोहराया ठंड और विगलन से बचें.

    6 संयुक्त ऑप्टिकल फँसाने और एकल अणु प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रयोगों

    1. बफर कंटेनरों के लिए बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें और जोड़ने ट्यूब धोने और सेल प्रवाह के लिए 200 एमबार दबाव लागू होते हैं. डीएनए, यहाँ और निम्न चरणों में बाध्यकारी प्रोटीन का प्रसार बढ़ाने के लिए, एक एक कम ईओण ताकत बफर के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है बफर. नोट: इन प्रयोगों में, हम TBE 0.5x इस्तेमाल किया.
    2. प्रवाह चिकनाई बाधित हो सकता है, जो हवा के बुलबुले की उपस्थिति के लिए जाँच करें. आउटलेट ट्यूब पर एक सज्जन झटका किसी भी शेष बुलबुले को दूर करने में मदद मिलेगी.
    3. 20 मिलीबार के लिए दबाव कम होती है और सभी चैनलों और ट्यूब हवा के बुलबुले से स्पष्ट कर रहे हैं और बफर सभी चैनलों में समान वेग के साथ बहती है सत्यापित.
    4. 300 μl के अंतिम मात्रा के लिए नमूने तैयार: streptavidin लेपित polystyrene मोती 1.87 माइक्रोन; धारा 4 के अनुसार दोनों हाथ पैरों पर biotinylated रैखिक डीएनए के 20 बजे; Laci टेट्रामर की 300 बजे खंड 5 के अनुसार ATTO532 के साथ लेबल.
    5. निम्नलिखित क्रम में सिरिंज कंटेनरों में से एक के लिए प्रत्येक नमूना जोड़ें: मोती इमेजिंग बफर केवल (बफर अ + ऑक्सीजन मेहतर सिस्टम) और चौथा चैनल में लेबल प्रोटीन के साथ दूसरे, तीसरे चैनल में पहला चैनल, डीएनए में.
    6. 3 मिनट के लिए 200 एमबार पर प्रवाह को चालू नमूने प्रवाह चैनल के अंदर आने जाने के लिए. फिर 20 मिलीबार के लिए दबाव को कम.
    7. उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के तहत पहले चैनल इमेजिंग जबकि, दो ऑप्टिकल चिमटी पर स्विच और प्रत्येक जाल में एक polystyrene मनका पकड़ने.
    8. अन्य मोती जाल में गिरावट से बचने के लिए दूसरे चैनल के लिए तेजी से कदम. डीएनए चैनल में आगमन मनका प्रवाह के अंत तक आसानी से ध्यान देने योग्य है कि ध्यान दें.
    9. ओ का प्रयोगपूर्वोत्तर एओडी, दो ऑप्टिकली फंस मोती के बीच में प्रवाह बढ़ाया डीएनए की कुर्की की अनुमति के लिए आगे और पीछे अन्य मनका की निकटता में एक जाल (मनका) चाल है. एक डीएनए dumbbell का गठन किया जाता है, स्थिर मनका सक्रिय रूप से आगे और पीछे जाल द्वारा ले जाया जाता है कि मनका के आंदोलन के बाद शुरू होता है.
    10. बफर चैनल के लिए तेजी से कदम और बफर प्रवाह बंद कर देते हैं. एक एकल डीएनए अणु की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए एक बल विस्तार वक्र विश्लेषण 4,23-25 ​​प्रदर्शन करना. एक से अधिक अणु मौजूद है, dumbbell त्यागने और कदम 6.7 से फिर से शुरू (यानी, बल विस्तार वक्र के चरण जुटाने enthalpic, डीएनए समोच्च लंबाई की तुलना में कम लंबाई में होता है).
    11. एक एकल डीएनए dumbbell प्राप्त हो जाने के बाद, फिर से प्रवाह पर बारी और प्रोटीन चैनल को dumbbell चाल है. डीएनए के साथ लेबल-Laci की बातचीत पर नजर रखने के व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में बदलें. प्रवाह बंद करें और अधिग्रहण शुरू.

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Representative Results

एक सफल प्रयोग में, एक (या अधिक) लेबल प्रोटीन डीएनए अणु (चित्रा 3A) के साथ / unbinding और / या monodimensional प्रसार बंधन से गुजरना. डीएनए अणु साथ प्रोटीन का स्थानीयकरण डीएनए अनुक्रम के एक समारोह के रूप में गतिज मापदंडों की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है. -1 डी प्रसार के कारण बफर की स्थिति लागू कर रहे हैं, यह प्रसार गुणांक डी -1 डी उदाहरण के लिए, प्रोटीन trajectories पालन करें, और निर्धारित करने के लिए संभव है.

एक ही स्थान की सटीक स्थिति, प्रत्येक फ्रेम में, एक और अधिक तेजी, हाल ही में प्रकाशित एल्गोरिथ्म के साथ, एक बड़े डेटा सेट से निपटने जब (वैकल्पिक रूप से, रेडियल एक bidimensional गाऊसी समारोह के साथ बात फैल समारोह (पीएसएफ) फिटिंग या द्वारा निर्धारित किया जा सकता है समरूपता केंद्र, आरएससी) 26,27. बाद विधि गाऊसी फिटिंग के साथ आमतौर पर तुलनीय है कि एक स्थानीयकरण परिशुद्धता प्राप्त करने, छवि की अधिकतम रेडियल समरूपता के बिंदु निर्धारित करता है. बो मेंवें मामलों पर नज़र रखने के लिए स्वतंत्र रूप से 27 तक पहुँचा जा सकता है कि MATLAB दिनचर्या के माध्यम से हासिल किया जा सकता है.

चित्रा 3A डीएनए अणु के केंद्र में स्थित एक और Laci अणु विशेष रूप से एक ऑपरेटर के लिए बाध्य है, जबकि एक ही Laci अणु गैर विशिष्ट डीएनए दृश्यों साथ diffuses जिसमें एक ठेठ प्रयोग, की एक kymogram दिखाता है. चित्रा 3B दो की स्थिति से पता चलता है Laci अणुओं समय के एक समारोह के रूप में, दो जाल (एक्स) के केन्द्रों को जोड़ने दिशा साथ (आरएससी का उपयोग कर प्राप्त). डीएनए अणु साथ diffusing अणु की स्थिति से, हम निम्न समीकरण के अनुसार अलग अलग समय अंतराल पर मीन स्क्वायर विस्थापन (एमएसडी) गणना:

समीकरण 1 (1)

एन है जहां पदों की कुल संख्या मापा और एन माप सूचकांक जा रहा है च एन ROM 1. शुद्ध एकआयामी ब्राउनियन प्रसार के मामले में, एमएसडी के लिए सीधे आनुपातिक है n Δt दो बार प्रसार गुणांक के बराबर एक ढाल के साथ, (Δt लगातार दो फ्रेम, हमारे प्रयोगों में 100 मिसे के बीच समय अंतराल है) (एमएसडी (एन, एन) = 2 डी 1 nΔt). 4 डीएनए साथ diffusing अणु के लिए एमएसडी nΔt बनाम साजिश पता चलता है. प्रोटीन के प्रसार गुणांक आसानी से एमएसडी nΔt बनाम साजिश का एक रेखीय फिट से प्राप्त किया जा सकता है. उस के रूप में एन बढ़ जाती है, Eq से एमएसडी की गणना के लिए अंकों की संख्या नोट करें. 1 फलस्वरूप कम हो जाती है. एमएसडी के मूल्यांकन में त्रुटि इस प्रकार एन के साथ बढ़ जाती है. इस कारण से, हम n = एन / 4 के लिए हमारे विश्लेषण सीमित करने के लिए चुना है. यह वैसे भी कई प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया एन / 10 की तुलना में एक काफी बड़ा मूल्य है.

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हलोजन दीपक (एच), कंडेनसर (सी), नमूना (एस), piezo अनुवादकों (XY और जेड), उद्देश्य (ओ), एक कम बढ़ाई कैमरा (सीसीडी 200X) और एक उच्च: चित्रा 1 प्रयोगात्मक स्थापना के होते हैं -magnification कैमरा (बी एस 50:50 बीम फाड़नेवाला घन है) एनएम स्थिरीकरण प्रतिक्रिया के लिए इस्तेमाल किया (सीसीडी 2,000X). डबल ऑप्टिकल चिमटी डाला और dichroic दर्पण (डी 2 और डी 3) और के माध्यम से माइक्रोस्कोप की ऑप्टिकल अक्ष से निकाले जाते हैं एन डी:: शामिल बीम फाड़नेवाला क्यूब्स (पीबीएस), acousto ऑप्टिक deflectors (एओडी), 1,064 एनएम हस्तक्षेप फिल्टर (F1 और F2) ध्रुवीकरण, / 2 waveplates, YAG लेजर (1,064 एनएम), ऑप्टिकल अलगाने (पुराना) λ, वृत्त का चतुर्थ भाग डिटेक्टर photodiodes (QDP). QDPs से संकेत एक एनालॉग से डिजिटल कनवर्टर (एडीसी) के माध्यम से प्राप्त कर लिया और एक FPGA बोर्ड के साथ सविस्तार गया. दो कस्टम निर्मित प्रत्यक्ष डिजिटल Synthesizers (डीडीएस) जाल 'स्थिति को नियंत्रित करने के लिए AODs चलाई. एक डिजिटल इनपुट, आउटपुट बोर्ड (DIO) नियंत्रितक्रमशः एक कंप्रेसर (0.5 एटीएम) और परिवेश के दबाव (0 एटीएम), से जुड़े दो solenoid वाल्व (V1 और V2) के एपर्चर. एक Labview सॉफ्टवेयर एक दबाव मीटर (प्रधानमंत्री) के माध्यम से दबाव जलाशय (सी 1) के अंदर दबाव नजर रखी और स्वचालित रूप से वांछित दबाव स्तर तक पहुंचने के लिए दो वाल्व की एक खोला. प्रतिदीप्ति उत्तेजना एक दोहराया एन डी द्वारा प्रदान की गई थी: YAG लेजर (532 एनएम) और एक इलेक्ट्रॉन पर अनुमानित छवि कैमरा (EMCCD) गुणा. एम एक जंगम दर्पण है, F3 एक उत्सर्जन फिल्टर. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2 (ए) प्रवाह प्रणाली चित्र. दबाव नियंत्रण प्रणाली V1 और V2 कनेक्ट एक दबाव मीटर (प्रधानमंत्री) और दो solenoid वाल्व द्वारा रचित है0.5 एटीएम (पीआरएस) पर और क्रमशः दबाव परिवेश (एटीएम), एक कंप्रेसर के लिए एड. X1 और X2 3 तरह कनेक्टर्स का प्रतिनिधित्व करते हैं. वाल्व के एपर्चर सूक्ष्मता 4 बफर कंटेनरों के साथ दबाव जलाशय सी 1 में वांछित दबाव तक पहुँचने के लिए निकाला जाता है. प्रत्येक इनलेट ट्यूब मल्टीचैनल प्रवाह कक्ष के द्वार पर / बंद वाल्व पर एक स्वतंत्र भी शामिल है. दुकान ट्यूबिंग परिवेश के दबाव में रखा अपशिष्ट कंटेनर सी 2 से जुड़ा है. चित्र पैमाने पर नहीं कर रहे हैं. (बी) मल्टीचैनल प्रवाह चैम्बर के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. चार लामिना का प्रवाह अलग functionalized polystyrene मोती, डीएनए अणु, इमेजिंग बफर और लेबल प्रोटीन सरकाना. दो मोती दोहरी ऑप्टिकल चिमटी से पकड़ लिया और डीएनए उन दोनों के बीच में प्रस्तोता अनुमति देने के लिए डीएनए चैनल के लिए ले जाया जाता है. एक डीएनए बल विस्तार विश्लेषण सिर्फ बाद में, डीएनए प्रोटीन चैनल में incubated है, एक एकल डीएनए अणु की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए बफर चैनल में प्रदर्शन किया और कर रहा है. इनसेट एक मशीन से पता चलता हैअंतिम आणविक निर्माण के fication, बफर चैनल में एकल अणु इमेजिंग के लिए तैयार है. चित्र पैमाने पर नहीं कर रहे हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
एक बढ़ाकर डीएनए अणु के साथ बातचीत के एक Laci अणुओं की चित्रा 3 स्थानीयकरण. (ए) kymogram के ऊर्ध्वाधर अक्ष क्षैतिज अक्ष समय (100 मिसे अधिग्रहण के समय) है, जबकि, डीएनए अणु के समानांतर समन्वय एक्स. (बी का प्रतिनिधित्व करता है समय बनाम Laci अणु) एक्स स्थिति. अणुओं की स्थिति आरएससी द्वारा निर्धारित किया गया था. छवियाँ 100 मिसे जोखिम समय और 1.25 x 10 -2 डब्ल्यू सेमी पर हासिल किया गया -2 excitation लेजर तीव्रता. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा एक बढ़ाकर डीएनए अणु साथ diffusing एक भी Laci अणु के लिए समय बनाम एमएसडी के 4 प्लॉट. एमएसडी चित्रा 3 बी (लाल) में प्रतिनिधित्व स्थिति रिकॉर्ड से गणना की है. आकृति में दर्शाया डेटा के रेखीय प्रतिगमन से प्राप्त प्रसार गुणांक डी -1, 0.030 ± 0.002 माइक्रोन 2 सेकंड है -1.

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Discussion

पिछले दशक में, एक अणु हेरफेर और इमेजिंग तकनीक स्थानिक और अस्थायी समाधान के संदर्भ में काफी प्रगति देखी है. हेरफेर और इमेजिंग तकनीक के संयोजन अब ऐसे डीएनए, आरएनए या cytoskeletal filaments के रूप में एक जैविक बहुलक के यांत्रिक स्थितियों के नियंत्रण की अनुमति है कि शक्तिशाली उपकरणों का आधार है, और एक ही बहुलक के साथ बातचीत के एक प्रोटीन का एक साथ स्थानीयकरण पर . फंस बहुलक के यांत्रिक स्थितियों को नियंत्रित करने के लिए विशेष ब्याज की है. वास्तव में, जीवित कोशिकाओं में, न्यूक्लिक एसिड लगातार एंजाइम और प्रोटीन बातचीत की वजह से यांत्रिक तनाव के दौर से गुजर रहे हैं; इसी तरह, बातचीत प्रोटीन और आणविक मोटर्स की एक जटिल नेटवर्क cytoskeletal तंतुओं पर तनाव modulates. दूसरी ओर, संभावना का पता लगाने और ठीक न्यूक्लिक एसिड के साथ बातचीत प्रोटीन स्थानीय बनाना, उनकी पुलिस के एक समारोह के रूप में आणविक बातचीत की माप की अनुमति देता हैडीएनए या आरएनए अनुक्रम साथ विपक्षी.

एकल अणु हेरफेर और इमेजिंग तकनीक के संयोजन प्रयोगात्मक सेटअप और जैविक निर्माणों की सावधान डिजाइन की आवश्यकता है. ऑप्टिकल जाल निलंबित बहुलक का एनएम स्तरीय स्थिरता सुनिश्चित करने, एक स्थिर समर्थन प्रदान करना चाहिए. इस तरह की स्थिरता यांत्रिक शोर के कई स्रोतों से प्रयोगात्मक तंत्र से सावधान अलगाव के माध्यम से और लेजर ओर इशारा करते हुए और आयाम उतार चढ़ाव को कम करके पहुंचा जा सकता है. ऑप्टिकल जाल की सटीक (उप एनएम) आंदोलनों DDSs द्वारा संचालित AODs का प्रयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. यहाँ, हम अनुकूलन और एनएम स्तर पर ऑप्टिकल चिमटी 'स्थिरता की जांच करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल सचित्र.

एक EMCCD कैमरे के लिए युग्मित सरल व्यापक क्षेत्र महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी निलंबित बहुलक के साथ बातचीत के एक chromophores स्थानीयकरण का प्रयोग किया जाता है. हमारे प्रयोगात्मक परख एक स्थानिक जुदाई शर्त सुनिश्चित करने के लिए लंबे समय से डीएनए या आरएनए अणुओं (≥6 KBP) तक सीमित हैफँसाने लेजर बीम और फ्लोरोसेंट जांच समझना. क्रोमोफोर उत्साहित राज्य के 16 में है, जबकि वास्तव में, दृश्य उत्तेजना लेजर के साथ लगभग अवरक्त फँसाने लेजर के superposition के कारण लगभग अवरक्त प्रकाश के अवशोषण के लिए chromophores का बढ़ाया photobleaching के लिए नेतृत्व करेंगे. Dumbbell विधानसभा बेहतर है कि हम एक विस्तृत विवरण प्रदान की है, जिसके लिए एक multichannel प्रवाह सेल का उपयोग कर प्राप्त किया जाता है कि एक और मुश्किल प्रक्रिया है. हम बफर प्रवाह और कैसे अन्यथा गंभीरता प्रयोगों समझौता कर सकते हैं, जो हवाई बुलबुले से बचने के लिए अनुकूलन करने के लिए कैसे संकेत दिया. हम प्रोटीन लेबलिंग के लिए streptavidin लिपटे मोतियों का उपयोग dumbbell विधानसभा के लिए आवश्यक है, जो बायोटिन, और प्रोटोकॉल के साथ डीएनए extremities लेबलिंग के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया. अंत में, हम एक बढ़ाकर डीएनए अणु पर एक भी लैक्टोज repressor अणु की बाध्यकारी और प्रसार मात्रा निर्धारित है जिसमें प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए कदम दर कदम संचालन सचित्र.

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Acknowledgments

हम नमूना तैयार करने के साथ मदद के लिए microfluidics और Alessia Tempestini के साथ मदद के लिए Gijs Wuite, इरविन जेजी Peterman, और पीटर सकल धन्यवाद. इस शोध n 284,464 ° और RICERCA 2013 RBFR13V4M2 में शिक्षा, विश्वविद्यालय और अनुसंधान FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro के लिए इतालवी मंत्रालय से, और के ढांचे में अनुदान समझौते के तहत यूरोपीय संघ सातवीं फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7 / 2007-2013) द्वारा वित्त पोषित किया गया फ्लैगशिप परियोजना NANOMAX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elastomeric isolators Newport Newdamp Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies
Optical isolator Optics for Research IO-3-YAG-VHP
Nd:YAG laser, 1,064 nm wavelength Spectra-Physics Millennia IR
Acousto-optic deflectors (AODs) A&A optoelectronic DTS-XY 250
Direct Digital Synthesizers Analog Devices
Quadrant detector photodiodes OSI optoelectronics SPOT-15-YAG
DIO and FPGA board National Instruments NI-PCI-7830R
Halogen lamp Schott KL 1500 LCD
Condenser Olympus U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat
Objective Nikon CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion
532 nm laser Coherent Sapphire
CCD 200X and 2000X Hamamatsu  XC-ST70 CE
Electron-multiplied CCD Hamamatsu  C9100-13
Piezo stage with nm-accuracy Physik Instrumente P-527.2CL 
Emission Filter Chroma Technologies 600/100m
Silica beads (1.54 mm) Bangs Laboratories SS04N/5303
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma Aldrich B4287
Pentyl acetate  Sigma Aldrich 46022 Flammable liquid and vapor (No 1272/2008)
Nitrocellulose Sigma Aldrich N8267-5EA Flammable solid  (No 1272/2008)
Heat block MPM Instruments Srl M502-HBD with 2 removable blocks; preheated at 120 °C
NanoPort assemblies Upchurch Scientific Inc. N-333
Polyetheretherketone tubing  Upchurch Scientific Inc. 1535
Home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass
Luer lock-tip syringes 2.5 ml Terumo SS 02LZ1
Shut-off valves  Upchurch Scientific, Inc. P-732
Flangeless fittings  Upchurch Scientific, Inc. LT-111
Fluorinated ethylene propylene tubing  Upchurch Scientific, Inc. 1549
Two computer-controlled solenoid valves Clippard, Cincinnati, USA ET-2-H-M5
Pressure transducer Druck LTD PTX 1400
biotin-14-dCTP  Life Technologies 19518-018
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Thermoscientific EP0161
ATTO532 maleimide Sigma Aldrich 68499
N,N-dimethylformamide (DMF)  Sigma Aldrich 227056 Combustible Liquid, Harmful by skin absorption. Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)  Sigma Aldrich C4706
L-Glutathione reduced (GSH) Sigma Aldrich G4251 Acute toxicity, Oral (Category 5), H303
Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators Merck Millipore UFC901024
Streptavidin-coated polystyrene beads 1.87 µm Spherotech, Inc. SVP-15-5

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References

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