चूहे में सहज metastatic वृक्क कोशिका कार्सिनोमा (mRCC) मॉडलिंग के बाद nephrectomy

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Summary

सहज metastatic वृक्क कोशिका कार्सिनोमा (आरसीसी) रोग प्रगति के मॉडल एक नैदानिक ​​प्रासंगिक सेटिंग में उपचार के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल orthotopic गुर्दे ट्यूमर सेल आरोपण, उचित nephrectomy के लिए विभिन्न प्रक्रियाओं को दर्शाता है, और अंत में metastatic बोझ और स्थानीयकरण का दृश्य और bioluminescent स्कोरिंग के लिए एक शव - परीक्षा गाइड की रूपरेखा.

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Tracz, A., Mastri, M., Lee, C. R., Pili, R., Ebos, J. M. Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy. J. Vis. Exp. (86), e51485, doi:10.3791/51485 (2014).

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Abstract

गुर्दे सेल कार्सिनोमा (आरसीसी) में नई प्रायोगिक चिकित्सा के सुधार का परीक्षण करने के लिए प्रमुख चुनौतियों में से एक को ईमानदारी से जल्दी और देर चरण metastatic रोग प्रगति पुनरावृत्ति कि मॉडल का विकास है. विशिष्ट ट्यूमर आरोपण मॉडल अस्थानिक या orthotopic प्राथमिक ट्यूमर आरोपण का उपयोग, लेकिन कुछ नैदानिक ​​सेटिंग mimics कि प्रणालीगत सहज metastatic रोग शामिल हैं. इस प्रोटोकॉल आरसीसी रोग प्रगति रोगियों के समान चरणों में विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण कदम का वर्णन करता है. सबसे पहले, यह orthotopic ट्यूमर सेल आरोपण दिखाने के लिए एक syngeneic मॉडल में एक अत्यधिक metastatic माउस ट्यूमर सेल लाइन का उपयोग करता है. तरीके रिसाव और जल्दी प्रसार को रोकने के Matrigel के साथ संयुक्त कोशिकाओं के साथ उप सम्पुटी अंतरिक्ष में सतही और आंतरिक आरोपण शामिल हैं. अगला यह महत्वपूर्ण पूर्व और शल्य चिकित्सा के बाद माउस देखभाल के साथ, ट्यूमर असर गुर्दे (nephrectomy) के छांटना के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन है. अंत में, यह निगरानी और मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक कदम की रूपरेखासूक्ष्म और साथ ही bioluminescent इमेजिंग सहित स्थूल metastatic रोग प्रगति, प्रणालीगत रोग वितरण स्कोर करने के लिए एक विस्तृत दृश्य पोस्टमार्टम मार्गदर्शन प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल विवरण के लक्ष्य के भविष्य चिकित्सीय परीक्षण के भविष्य कहनेवाला मूल्य में सुधार करने के लिए नैदानिक ​​प्रासंगिक metastatic आरसीसी मॉडल के व्यापक उपयोग की सुविधा है.

Introduction

गुर्दे सेल कार्सिनोमा (आरसीसी) के साथ रोगियों में मृत्यु का प्रमुख कारण आम तौर पर गुर्दा में बढ़ रही है एक प्राथमिक ट्यूमर के सर्जिकल हटाने के बाद होता है कि प्रणालीगत metastatic रोग है. हालांकि, चूहों में प्रायोगिक चिकित्सा के मूल्यांकन बहुत कुछ preclinical ट्यूमर मॉडल metastatic रोग शामिल हैं, और कम अभी भी ईमानदारी से स्थानीयकृत विकास, सर्जरी, और सहज सूक्ष्म metastatic दीक्षा और प्रगति 1-3 नैदानिक ​​चरणों पुनरावृत्ति. परीक्षण में इस अंतर के रूप में कभी कभी पशु मॉडल में देखा हड़ताली विरोधी ट्यूमर प्रभाव हमेशा मरीजों 4 की इसी सफल उपचार में अनुवाद नहीं किया नए उपचारों के मूल्यांकन में तेजी से महत्वपूर्ण बन गया है. परिणाम में इस तरह के मतभेदों स्थानीयकृत अस्थानिक या orthotopic प्राथमिक ट्यूमर मॉडल और देर चरण metastatic रोग 5-7 के बीच अंतर दवा efficacies से स्टेम सकता है. आरसीसी के मामले में, केवल कुछ अध्ययनों से स्थापित कार्यरत है एकआमतौर पर ट्यूमर असर गुर्दे पड़ा है जो mimics रोगियों पूर्ण या आंशिक रूप 2,3 हटा दिया कि सहज आवर्तक रोग भी शामिल है कि निमल प्रोटोकॉल. माउस मॉडल के परीक्षण में इस कमी के लिए कारणों से भिन्न हो. सबसे पहले, उच्च पशु लागत और ट्यूमर सेल चयन और metastatic क्षमता के निहित परिवर्तनशीलता है. (जैसे एक मानव कोशिका लाइन व्युत्पत्ति 8-10 का विवरण देखें) उदाहरण के लिए, मानव गुर्दे सेल लाइनों शायद ही कभी metastasize करते हैं, और orthotopic प्राथमिक आरोपण और लगातार प्रसार और दूर के घावों कि फार्म वेरिएंट प्राप्त करने के लिए metastatic चयन के कई दौर खत्म चयनित होना चाहिए . इसके विपरीत, असुरक्षित मॉडल में माउस कोशिकाओं आक्रामक तरीके से व्यवहार करते हैं, और कम सेल नंबर तत्काल प्रणालीगत प्रसार 3 को कम करने के लिए Matrigel इंजेक्शन के साथ किया जाना चाहिए. दूसरा, तकनीकी उचित आरोपण, शल्य लकीर (nephrectomy), और ट्रैकिंग में कठिनाइयों (और बढ़ाता) सहज metastatiसी वृद्धि चुनौतीपूर्ण हो सकता है और (विवरण के लिए चर्चा देखें) इस तकनीक को रोजगार जब कई महत्वपूर्ण चर विचार की जरूरत है. इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य orthotopic आरोपण, लकीर (nephrectomy), और सहज metastatic आरसीसी रोग की निगरानी के लिए आवश्यक कदम (और साथ ही संभावित नुकसान) का वर्णन करने के लिए और मानकीकृत (और अधिक व्यापक) के लिए एक दिशानिर्देश पेशकश करने के लिए वैज्ञानिक प्रयोगशालाओं के बीच में प्रयोग है कि प्रायोगिक चिकित्सा की प्रभावकारिता का आकलन करें.

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Protocol

1. Orthotopic गुर्दे ट्यूमर आरोपण

  1. सेल संस्कृति
    1. पिछले orthotopic दाखिल करने से, 75% confluency करने के लिए एक monolayer के रूप में माउस RENCA ल्यूक कोशिकाओं को विकसित.
    2. 5% FBS युक्त मीडिया, 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, पीबीएस में धोने के लिए 3 बार दोहरा में trypsinization और मेजबान के बाद. फिर 5 एक्स 10 4 RENCA ल्यूक / 5 μl सीरम मुक्त मीडिया के एक एकाग्रता के लिए सीरम मुक्त मीडिया में कोशिकाओं resuspend.
      नोट: संस्करण या इस्तेमाल सेल लाइन पर निर्भर करता है, कोशिकाओं आरोपण के बाद अत्यधिक आक्रामक माउस सेल के विकास और प्रसार के लिए धीमी गति से Matrigel और सीरम मुक्त मीडिया की एक 1:1 के अनुपात में resuspended किया जा सकता है.
  2. सर्जरी और सेल आरोपण
    नोट: सभी जानवरों के अध्ययन के लिए एक संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) पी के अनुसार प्रदर्शन किया गया, प्रयोगात्मक endpoints के रखरखाव और दृढ़ संकल्प सहित, उसमें वर्णितrotocol Roswell पार्क कैंसर संस्थान द्वारा मंजूरी दे दी.
    1. Isoflurane (2-3%) का उपयोग कर एक BALB / ग माउस anesthetize. पैर चुटकी और पर्याप्त anesthetization सुनिश्चित करने के लिए पलटा लिए जाँच करें. सुखाने को रोकने के लिए आंखों के लिए पशु चिकित्सक मरहम लागू करें. सही पार्श्व अवलंबन में माउस रखें और सामने और हिंद अंग के बीच बाईं ओर दाढ़ी. Aseptically चीरा के लिए क्षेत्र तैयार करने के लिए पृष्ठीय काठ क्षेत्र के साथ शराब और आयोडीन लागू करें.
    2. पिछले पसली और कूल्हे के बीच एक अनुदैर्ध्य दिशा में एक 1 सेमी त्वचा चीरा आरंभ करने के लिए शल्य कैंची का प्रयोग करें. एक कुंद विच्छेदन कैंची का उपयोग त्वचा के नीचे संयोजी ऊतक थोड़ा ढीला. पेट की दीवार में एक अनुदैर्ध्य दिशा में एक 0.5 सेमी चीरा बनाने के लिए शल्य कैंची का प्रयोग करें. धीरे खुले घाव के आसपास धक्का नीचे घुमावदार संदंश का प्रयोग करें - यह गुर्दे अमल और इंजेक्शन के लिए पहले अंग के कोमल स्थिरीकरण के लिए अनुमति देगा.
    3. तैयार सेल मिश्रण μl 5 के साथ हैमिल्टन सिरिंज लोड. उप सम्पुटी Implan लिएtations, दो आरोपण तरीकों नियोजित किया जा सकता है:
      1. सतही: beveled बढ़त के साथ गुर्दे कैप्सूल के तहत अनुलंबीय केंद्रित गुर्दे, डालने सुई (लेकिन पैरेन्काइमा ऊपर) समानांतर चल रहा है. सुई जगह में एक बार, छोटे सफेद बुलबुला रूपों तक कोशिकाओं के सभी इंजेक्षन. धीरे धीरे कैप्सूल से सुई को हटाने और तुरंत किसी भी रिसाव को अवशोषित और सेल प्रसार को रोकने के लिए एक बाँझ कपास इत्तला दे दी applicator के साथ इंजेक्शन के ऊपर दाग.
      2. आंतरिक: सुई दिखाई (लेकिन puncturing नहीं) है जब तक beveled बढ़त के ऊपर और अंतिम आरोपण साइट को गुर्दे के सामने की ओर से शुरू करने के साथ, गुर्दे के इंटीरियर के माध्यम से उप सम्पुटी अंतरिक्ष सुई डालें. सफेद बुलबुला रूपों और झाड़ू इंजेक्शन साइट किसी भी रिसाव को रोकने के लिए जब तक कोशिकाओं के सभी इंजेक्षन.
    4. धीरे शरीर गुहा को गुर्दा वापसी. Absorbable 5-0 Vicryl सीवन का उपयोग पेट शरीर दीवार को बंद करें. एक बार जब पूरा, एक साथ त्वचा की परत खींचने के लिए और डब्ल्यू 2-3 जगहक्लिप ound. सुनिश्चित क्लिप्स फर्म और समान रूप से कोई घाव प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए स्थान दिया गया है. पिछले वसूली 0.9% NaCl के 500 μl और subcutaneously एक 25 जी सुई का उपयोग buprenorphine (0.01 मिलीग्राम / एमएल) के 100 μl प्रशासन. नियमित क्लिप प्लेसमेंट और स्थिरता की निगरानी, ​​और 10 दिनों के बाद हटा दें.

2. Nephrectomy / प्राथमिक ट्यूमर को हटाने

  1. वर्गों (ऊपर) 1.2.1 और 1.2.2 में वर्णित के रूप में माउस anesthetization, स्थिरीकरण, चीरा, और गुर्दे के लिए जोखिम के लिए समान प्रोटोकॉल का पालन करें.
  2. धीरे दुम अंत से जोड़ने वसा ऊतक और गुर्दे की कपाल के अंत से अधिवृक्क ग्रंथि को हटाने के द्वारा गुर्दे को अलग करने संदंश की एक दूसरी जोड़ी का प्रयोग करें. धीरे गुर्दे लोभी, वहीं एक मूत्रवाहिनी के आसपास डबल गाँठ, वृक्क धमनी, और नस बनाने के लिए absorbable 5-0 Vicryl सीवन का उपयोग करें. धीरे धीरे सुरक्षित और तो गुर्दा निकालने के लिए गाँठ से ऊपर काट दिया. तुरंत खून की कमी, या वहाँ का कोई संकेत अपर्याप्त पकड़ के एक जोखिम है, तोमूत्रवाहिनी, धमनी, और नस पर सिवनी की, तो गाँठ ऊपर में कटौती करने के बजाय कैंची cauterizer का उपयोग करें.
  3. गुर्दा निकाले जाने के बाद, बंधे धमनी से किसी भी रक्तस्राव के लिए सावधानी से जाँच करें और यदि आवश्यक हो तो cauterizer का उपयोग करें. 5-0 Vicryl का उपयोग पेट शरीर दीवार को बंद करें. एक साथ त्वचा की परत खींचो और 1.2.4 में वर्णित के रूप में एक ही सावधानियों का पालन 2-3 घाव क्लिप जगह. बारीकी से खून बह रहा संकट का संकेत है, या सीमित मोबिलिटी के लिए सर्जरी के बाद दैनिक जानवर की निगरानी. सुरक्षित रूप से पशुओं के लिए संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन करें.

3. समापन बिंदु पर metastatic प्रगति और स्थानीयकरण निगरानी

  1. Metastatic रोग मात्रा का ठहराव: Bioluminescent निगरानी
    1. पहले luciferase साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का उपयोग मेटास्टेसिस निगरानी और Xenogen IVIS इमेजिंग प्रणाली 11,12 का उपयोग मात्रा के लिए जौव में वर्णित पद्धति को देखें.
  2. Metastatic वितरण का तुलनात्मक आकलन के लिए दृश्य पोस्टमार्टम गाइडtion
    1. आदि संकट के लक्षण, कृत्रिम श्वास, वजन घटाने, सहित अंतबिंदु का उपयोग संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार पशुओं का बलिदान
      नोट: सहज metastatic प्रगति अत्यधिक चर और तेजी से किया जा सकता है के रूप में पशुओं की निगरानी बंद करने के लिए महत्वपूर्ण है.
    2. कम जबड़ा को वक्ष गुहा तक जारी है कि मूत्रमार्ग के ऊपर एक चीरा आरंभ करने के लिए शल्य कैंची का प्रयोग करें. पेट की दीवार की मांसपेशियों से त्वचा को अलग करने के लिए कुंद समाप्त कैंची का प्रयोग करें.
    3. हाथ और पैर के साथ चीरों आरंभ करें. पील त्वचा दूर. बारीकी से त्वचा प्रावरणी और पिंड के लिए पेट की दीवार की जांच, तो सतही लिम्फ नोड्स: वंक्षण, बाहु, कक्षा और सतही ग्रीवा.
    4. पेट की दीवार में एक चीरा और डायाफ्राम के लिए छोड़ दिया और सही पार्श्व पक्षों के साथ काटा. एक क्षैतिज कटौती के साथ आंत खाली करने के लिए पेट की दीवार के सामने हिस्से को हटा दें.
    5. विसरा च की अबाधित उपस्थिति की जांचया मोटे तौर पर उल्लेखनीय ट्यूमर. इसके अलावा पेट और आंतों की सामग्री ध्यान दें; वे खाली कर रहे हैं, तो माउस खाने के लिए सक्षम नहीं हो सकता है. सामग्री अंधेरे हैं, यह ऊपरी / निचले गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल रक्तस्राव के सबूत संकेत हो सकता है.
    6. दिखने में प्रत्येक माउस समूह के लिए एक कुल स्कोर बताए, ट्यूमर उपस्थिति या अनुपस्थिति के लिए प्रत्येक अंग स्कोर (समूह प्रति 4 पशुओं चित्रा -1-I में उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है).
      नोट: 1) लिम्फ नोड्स की वृद्धि जरूरी है कि यह एक ट्यूमर के विकास है कि इसका मतलब यह नहीं है; यह बहुत आकार बहुत फर्म, और एक सफेद रंग की होती है, तो यह संभावना एक metastatic गुत्थी है. 2) पेट में अत्यधिक दूधिया या बादल तरल जलोदर इंगित करता है. जलोदर विशेष रूप से जिगर और पेट की पालियों के बीच पेट अंगों पर ठोस राशि, शामिल हो सकते हैं. 3) ऐसे फेफड़ों के रूप में अंगों के लिए, कई पिंड (उदाहरण के लिए 13 देखें) वर्तमान और व्यक्ति पशुओं के बीच तुलना के लिए गिना जा सकता है.
    7. ध्यान से एक धार बोतल से हटाने और पीबीएस के साथ धोने से जिगर, तिल्ली, गुर्दे और अग्न्याशय: व्यक्तिगत पेट अंगों के सकल ट्यूमर या असामान्यताएं की पहचान करें.
    8. पेट अंगों को हटाने के बाद, काठ, त्रिक, गुर्दे, और mesenteric लिम्फ नोड सहित पेट लिम्फ नोड्स, का निरीक्षण किया.
    9. Metastatic प्रसार के सबूत के लिए डायाफ्राम का आकलन करें.
      नोट: डायाफ्राम पर व्यापक प्रसार अस्वाभाविक या सांस लेने के नुकसान के लिए अग्रणी, यह अपने सिकुड़ना खोने के लिए पैदा कर सकता है.
    10. डायाफ्राम निकालें और फेफड़ों और दिल को बेनकाब करने के ललाट भाग को हटाने, वक्ष गुहा में दो पार्श्व चीरों बनाने.
    11. धीरे लोभी और उठाने घुटकी और दिल से ऊपर श्वासनली काटने से फेफड़ों और दिल के लिए निकालें. पिंड के ऊतकों का आकलन करें. दिल निचोड़. लचीला निरंतरता की कमी ट्यूमर उपस्थित संकेत हो सकता है.
    12. खोपड़ी के माध्यम से रैखिक कटौती करने के लिए शल्य कैंची का प्रयोग करें. धीरे टी जब तक कपाल के छोटे टुकड़े को दूरवह पूरे दिमाग से अवगत कराया है. दिखाई पिंड या असामान्यताएं discolorations के लिए मस्तिष्क भर में देखो.

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Representative Results

चित्रा 1A इस प्रोटोकॉल सारांश में विस्तृत प्रक्रियाओं की रूपरेखा एक योजनाबद्ध दिखाता है. कई महत्वपूर्ण कारकों के प्रत्येक चरण के लिए विचार किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, चरण 1 में यह गुर्दे में उप सम्पुटी ट्यूमर कोशिका प्रत्यारोपण के लिए दो तरीकों से पता चलता है. ट्यूमर कोशिकाओं सुई से सावधान हटाने और swabbing अतिरिक्त भागने द्रव (चित्रा 1 बी-I) द्वारा रोका रिसाव के साथ कोशिकाओं के स्थानीयकृत नियुक्ति की पुष्टि के एक छोटे सफेद बुलबुले के साथ उप सम्पुटी अंतरिक्ष में प्रत्यारोपित किया जा सकता है. रिसाव को रोकने के लिए, कोशिकाओं उप सम्पुटी अंतरिक्ष (चित्रा 1 बी द्वितीय) तक पहुँचने के लिए आंतरिक रूप से पहली बार प्रत्यारोपित किया, और खून में ट्यूमर कोशिकाओं की प्रारंभिक वितरण को रोकने के लिए Matrigel के साथ जोड़ा जा सकता है. गुर्दे की शल्य हटाने के लिए, सही समय इस्तेमाल किया सेल लाइन के विकास और metastatic क्षमता पर निर्भर करता है. इष्टतम nephrectomy अभ्यास माउस संकट और वसूली कम करने के लिए एक तेजी से, लेकिन नियंत्रित, शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया भी शामिल है. टीमूत्रवाहिनी, गुर्दे की धमनी और शिरा को बंद करने Vicryl की ight और सुरक्षित बाँध रही (चित्रा 1C देखें) ख़ून का बहाव से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. दाग़ना इस्तेमाल किया जाना चाहिए, लेकिन अतिरिक्त रक्तस्राव के संभावित हस्तक्षेप की आवश्यकता है तभी. अंत में, गैर इनवेसिव bioluminescent मूल्यांकन द्वारा सहज रोग की ट्रैकिंग निरंतर मनोगत घावों और विकास की निगरानी की, साथ ही समापन बिंदु पर मात्रा का ठहराव (चित्रा -1 देखें) की अनुमति देता है. हालांकि, सहज मेटास्टेसिस मॉडल में luciferase लेबल की कोशिकाओं का उपयोग कभी कभी ट्रांसफ़ेक्ट जीन व्यक्त नहीं कर सकते हैं, और इसलिए हमेशा चयन या लंबे समय तक ट्यूमर के विकास के कई दौर के बाद दिखाई नहीं हो सकता कि वेरिएंट का प्रतिरूप ट्यूमर कोशिका चयन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इस मामले में, नैदानिक ​​प्रासंगिक ऊतकीय विश्लेषण संभव नहीं तो तकनीकी रूप से (आर्थिक रूप से), सूक्ष्म metastatic घावों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है या, दृश्य स्थूल metastatic रोग का आकलन करने के लिए एक दृश्य स्कोरिंग विधि prese के एक सतही उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैअंग के ऊतकों में घावों की nce / अनुपस्थिति (आंकड़े 1D-I और 1D-II).

चित्रा 1
सहित उप सम्पुटी आरोपण की शल्य चिकित्सा के बाद metastatic रोग का आरोपण (चरण 1 सहित शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के चित्रा 1. ए) योजनाबद्ध), शल्य लकीर / nephrectomy (चरण 2), और मूल्यांकन (चरण 3). बी) उदाहरण (मैं) शल्य nephrectomy प्रक्रिया (मैं) और प्रत्यारोपित ट्यूमर शल्य चिकित्सा के बाद सहज metastatic रोग का उपयोग मैं (ii). डी) आकलन) का आकलन करने के लिए एक दृश्य स्कोरिंग प्रणाली के साथ excised गुर्दे के प्रतिनिधि छवि का सतही और (ii) आंतरिक तकनीक. सी) उदाहरण रोग वितरण (प्रतिनिधि 4 पशुओं के 5 समूहों से परिणामों), और द्वितीय) bioluminescent डेटा तुरंत पहले और बाद में बलिदान qu के लिएantitatively सूक्ष्म और स्थूल metastatic घावों का आकलन करें. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य आरोपण / लकीर तकनीकों का वर्णन करने के लिए एक syngeneic ट्यूमर माउस मॉडल का उपयोग नैदानिक ​​प्रासंगिक सहज metastatic रोग का आकलन करने के लिए है. वर्तमान में, उपन्यास प्रायोगिक चिकित्सा के मूल्यांकन preclinical अध्ययन के बहुमत metastatic रोग के अध्ययन में शामिल नहीं है और केवल कुछ ही प्राथमिक ट्यूमर के विकास, शल्य लकीर, और अंततः सहज metastatic प्रसार के चरणों पुनरावृत्ति. तिथि करने के लिए, अनुवांशिक इंजीनियर माउस मॉडल (GEMMs) सहज वृक्क कोशिका रोग प्रगति (सारांश के लिए 14 देखें) देर से मंच मेटास्टेसिस और शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप रणनीतियों को शामिल नहीं करते बटोर उत्पन्न इस प्रकार अब तक नहीं बताया गया है. इसलिए, सहज metastatic आरसीसी का अध्ययन वर्तमान में orthotopic ट्यूमर कोशिका प्रत्यारोपण के मॉडल के लिए प्रतिबंधित है. इन मॉडलों को पहले 2,3 विकसित किया गया है, हालांकि इस प्रोटोकॉल व्यापक रूप से विशेष रूप में, नए उपचार के मूल्यांकन में उपयोग नहीं किया हैयह सबसे अधिक भविष्य कहनेवाला मूल्य हो सकता है जहां perioperative सेटिंग. इस प्रोटोकॉल में विस्तार करने के लिए चिकित्सीय मूल्यांकन में अधिक व्यापक उपयोग की सुविधा हो सकती है कि आवश्यक प्रक्रियाओं का एक कदम दर कदम गाइड करना है. के रूप में वर्णित तकनीक का प्रदर्शन करने में संभावित नुकसान के संदर्भ में, परिणामों को प्रभावित कर सकता है कि कई महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं. सबसे पहले, आरोपण के बाद ट्यूमर सेल रिसाव पेरिटोनियल रोग के प्रसार को ले जा सकता है और इसलिए प्रारंभिक स्थानीय प्राथमिक विकास का प्रतिनिधित्व नहीं. दूसरा, इष्टतम लकीर बार इस्तेमाल प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए स्थापित किया जाना चाहिए. बहुत जल्दी ट्यूमर असर गुर्दे की शल्य nephrectomy बहुत देर हो चुकी सर्जरी, जिससे गैर स्थानीय रोग और (आमतौर पर तिल्ली के लिए) अंग fusing को जन्म दे सकती रोग प्रसार (यानी यह उपचारात्मक हो सकता है), और सर्जरी के लिए अनुमति नहीं हो सकती, क्योंकि यह महत्वपूर्ण है और संभव नहीं प्रारंभिक माउस वसूली. अंत में, bioluminescence साथ सहज metastatic रोग निगरानी के साथ समवर्ती होना चाहिएबीमारी के रूप में पशु रुग्णता के संस्थागत दिशा निर्देशों की निगरानी के संकेत को जिले पालन स्थानीयकरण और समग्र प्रभाव दोनों के मामले में अत्यधिक चर हो सकता है. पशु प्रयोगों के समुचित सांख्यिकीय शक्ति शामिल होने के लिए सभी परिवर्तनशीलता के लिए अनुमति देगा और अधिक ईमानदारी नैदानिक ​​रोग प्रगति और उपचार प्रतिक्रियाओं पुनरावृत्ति होगी. हम प्रदर्शन किया तकनीकों को सफलतापूर्वक preclinical ट्यूमर मॉडल में नैदानिक ​​प्रासंगिकता में सुधार लाने के उद्देश्य से स्थानीय orthotopic आरसीसी और शल्य चिकित्सा के बाद रोग पुनरावृत्ति पुनरावृत्ति करने के लिए इस्तेमाल किया है इस लेख में, साथ में ले ली

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम इस प्रक्रिया के विकास में तकनीकी सहायता और विशेषज्ञता के लिए डॉ. रॉबर्ट एस Kerbel (टोरंटो विश्वविद्यालय, Sunnybrook अनुसंधान संस्थान, टोरंटो, कनाडा) की प्रयोगशाला के लिए आभारी हैं. हम भी डा. सैंड्रा क़ब्र और प्रयोगशाला के पशु संसाधन के Roswell पार्क कैंसर संस्थान विभाग को धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम (JMLE के लिए) Roswell पार्क एलायंस फाउंडेशन की ओर से एक पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine Corning 10-013-CV
FBS Invitrogen 10437-028
0.25% Trypsin EDTA Corning 25-053-CL
1x DPBS without Calcium & Magnesium Corning 21-031-CV
Matrigel BD Biosciences 354234 must be kept on ice
Artifical tears-lubricant opthalmic ointment Akorn Animal Health 17478-162-35
Pocket pro pet trimmer Braintree scientific CLP9931B
Alcohol swab VWR 326895
Betadine solution swab VWR 67618-152-01
MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25 mm blades - 4.5"  Southpointe surgical RS-5982
Iris Forceps, serrated, curved, 10 cm long Kent scientific INS15915 need two of these
10 µl Hamilton syringe Hamilton 7635-01
30 G, 45 degree, RN needle Hamilton 7803-07
Sterile cotton tipped appicator VWR 10805-144
High temperature cautery kit Kent scientific INS500392
5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle  Ethicon J834
Reflex clip applier for 7 mm clips Kent scientific INS500343
Reflex clips, 7 mm, non-sterile Kent scientific INS500344
Removing forceps, 12 cm long Kent scientific INS500347
0.9% Sodium Chloride Baxter Healthcare 2B1322
Buprenorphine 0.01 mg/ml
25 G 5/8" needle VWR BD305122
1 ml syringe w/out needle VWR BD309659
D-Luciferin Gold Bio technology LUCK-1G

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References

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