इसके बाद wholemount के लिए पूरी स्पाइनल कॉर्ड चोट और मस्तिष्क विच्छेदन प्रोटोकॉल

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Neuroscience

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Summary

Lampreys एक पूरा रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद हरकत ठीक हो. हालांकि, कुछ रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन्स अच्छा regenerators हैं और दूसरों को नहीं कर रहे हैं. इस पत्र में पूरा रीढ़ की हड्डी लेनदेन उत्पादन और स्वस्थानी संकरण में लिए wholemount दिमाग और रीढ़ की हड्डी डोरियों की तैयारी, आवास समुद्र एक प्रकार की मछली लार्वा (और हाल ही में तब्दील वयस्क) के लिए तकनीक दिखाता है.

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Barreiro-Iglesias, A., Zhang, G., Selzer, M. E., Shifman, M. I. Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey. J. Vis. Exp. (92), e51494, doi:10.3791/51494 (2014).

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Abstract

एक पूरा रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद, पहली बार में समुद्र lampreys transection के स्तर से नीचे लकवा मार जाता है. हालांकि, वे कई हफ्तों के बाद हरकत की वसूली, और इस propriospinal axons और brainstem से रीढ़ की हड्डी में पेश axons की कम दूरी उत्थान (कुछ मिमी) के साथ है. 36 बड़ी पहचान योग्य रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन्स के अलावा, कुछ अच्छा regenerators हैं और दूसरों को बुरा regenerators हैं. ये न्यूरॉन्स सबसे आसानी से wholemount सीएनएस तैयारी में पहचाना जा सकता है. एहसान कि न्यूरॉन आंतरिक तंत्र को समझने या रीढ़ सीएनएस में चोट के बाद अक्षतंतु उत्थान को बाधित करने के लिए, हम अच्छे और बुरे regenerators के बीच जीन अभिव्यक्ति में मतभेद का निर्धारण, और कैसे अभिव्यक्ति रीढ़ की हड्डी transection से प्रभावित है. इस पत्र में सूक्ष्म दृष्टि के तहत पूरा रीढ़ की हड्डी लेनदेन का निर्माण, और बी आर तैयारी, ताजा पानी के टैंक में आवास लार्वा के लिए तकनीक और हाल ही में तब्दील वयस्क समुद्र lampreys दिखाता हैऐन और स्वस्थानी संकरण में के लिए रीढ़ की हड्डी wholemounts. संक्षेप में, जानवरों 16 में रखा जाता है   सी ° और एक प्रकार की मछली घंटी में 1% Benzocaine में anesthetized. रीढ़ की हड्डी एक पृष्ठीय दृष्टिकोण के माध्यम से iridectomy कैंची के साथ transected है और पशु 23 डिग्री सेल्सियस पर ताजा पानी के टैंक में ठीक करने के लिए अनुमति दी है. स्वस्थानी संकरण में के लिए, जानवरों reanesthetized रहे हैं और मस्तिष्क और रस्सी एक पृष्ठीय दृष्टिकोण के माध्यम से हटा दिया.

Introduction

स्तनधारियों में रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) घायल axons आघात क्षेत्र के माध्यम से पुनर्जन्म और उनके उचित लक्ष्यों को जोड़ने नहीं है क्योंकि चोट की साइट से नीचे समारोह की स्थायी नुकसान होता है कि एक विनाशकारी स्थिति है. स्तनधारियों के विपरीत, lampreys एक पूरा रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद हरकत ठीक हो. 1 दिलचस्प है, lampreys क्योंकि उनके बड़े आकार 2,3 (चित्रा 1) के मस्तिष्क की तैयारी माउंट पूरे 36 रीढ़ की हड्डी में व्यक्तिगत रूप से पहचाने जाने योग्य हैं कि न्यूरॉन्स पेश का एक सेट है . इन रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन्स के सभी एक उच्च स्तरीय पूरा रीढ़ की हड्डी transection द्वारा axotomized रहे हैं. हमारे समूह और अन्य लोगों की पिछले अध्ययनों से दूसरों को आमतौर पर चोट की साइट के माध्यम से अपने अक्षतंतु को पुनर्जीवित करते हुए भी इन न्यूरॉन्स के कुछ एक बहुत कम पुनर्योजी क्षमता दिखाने एससीआई के बाद कार्यात्मक वसूली की उपस्थिति में, (वे "बुरा regenerators" माना जाता है) पता चला है कि (वे विचार कर रहे हैं "जीई regenerators "). 2,3 यह विशेषता lampreys बारी में करने का प्रयास है कि न्यूरॉन्स की आंतरिक पुनर्योजी क्षमता में अंतर को बढ़ावा मिलेगा कि अच्छे और बुरे रिजनरेटर रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन्स के बीच जीन अभिव्यक्ति में मतभेद का अध्ययन करने के लिए एक दिलचस्प हड्डीवाला मॉडल बनाता है एक ही बाह्य वातावरण में अपने axons पुनर्जन्म. 1

हम पहले से पता चला है कि इस मॉडल का उपयोग रीढ़ की हड्डी में पेश क्रमश netrin और RGM की निरोधात्मक कार्रवाई मध्यस्थता जो UNC5 4,5 और neogenin, 6 की तरह axonal मार्गदर्शन अणु रिसेप्टर्स की कम पुनर्योजी क्षमता दिखाने अभिव्यक्ति के साथ न्यूरॉन्स. इसके अलावा, इस पद्धति का उपयोग करके अपने समूह में भी केवल अच्छा regenerators चोट के बाद और उत्थान की प्रक्रिया के दौरान neurofilaments की अभिव्यक्ति का एक वसूली चलता है कि दिखाया गया है. हाल ही में, बुश और मॉर्गन 7 बुरा regenerators एक बढ़ाने बताते हैं कि immunofluorescence से पता चला है"बुरा सुधारनेवाला" रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन्स धीरे धीरे एक पूरा रीढ़ की हड्डी transection 5,7,8 के बाद मर जाते हैं तथ्य यह है कि लेखकों द्वारा संबंधित दिया गया है जो चोट के बाद synuclein की एड अभिव्यक्ति,. तो, एक पूरा रीढ़ की हड्डी में चोट की एक प्रकार की मछली मॉडल एक रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन axotomy के बाद एक "बुरा सुधारनेवाला" क्या करता है समझने के लिए एक बहुत ही उपयोगी मॉडल के रूप में उभरा है.

हम स्वस्थानी संकरण में wholemount प्रदर्शन करने के लिए चोट के बाद वांछित समय बिंदुओं पर एक पूरा रीढ़ की हड्डी transection सर्जरी प्रोटोकॉल और एक पीछे मस्तिष्क विच्छेदन प्रदर्शन कर रहे हैं हमारे अध्ययन का संचालन करने के लिए. वर्तमान पद्धति लेख में हम लार्वा lampreys में एक पूरा रीढ़ की हड्डी में चोट की सर्जरी के समुचित निष्पादन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल मौजूद है, पशुओं के बाद रखरखाव और स्वस्थानी संकरण में एक wholemount के लिए अंतिम मस्तिष्क विच्छेदन और मस्तिष्क की तैयारी. एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेलार्वा lampreys के मस्तिष्क में स्वस्थानी संकरण में wholemount rform जैसा कि पहले बताया गया है. 9 इसके अलावा, रीढ़ की हड्डी में चोट और मस्तिष्क विच्छेदन के लिए इस प्रोटोकॉल भी तो immunohistochemistry या अन्य ऊतकीय तरीकों के लिए दिमाग पर कार्रवाई करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सामग्री के लिए 1 टेबल देखें.

प्रयोगों मंदिर विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.

1 पशु

  1. Wildtype लार्वा समुद्र lampreys (Petromyzon marinus एल) प्राप्त, 10 - मेन में डेलावेयर नदी (पेंसिल्वेनिया) या नदियों को सहायक नदियों से, लेक मिशिगन खिला धाराओं से - (7 वर्ष की उम्र 4) लंबाई में 14 सेमी.
  2. 16 डिग्री सेल्सियस पर 50 गैलन मीठे पानी के टैंक में 100 पशु - प्रयोगशाला में, 50 के समूह में लार्वा बनाए रखें. रेखा बजरी की एक इंच के साथ टैंक लार्वा में बिल के लिए, और पानी का कोयला फ़िल्टर और उन में lampreys रखने से पहले क्लोरीन और अन्य अशुद्धियों को दूर करने के लिए कम से कम 48 घंटे के लिए हवा पत्थरों से वातानुकूलित है. उपयोग की सुबह अप करने के लिए, अपने खुद के कतरे रीसायकल जो जानवरों, खिलाने के लिए कोई जरूरत नहीं है.

2 पूर्ण स्पाइनलगर्भनाल transection

  1. रीढ़ की हड्डी की सर्जरी से पहले निम्न संरचना के साथ एक प्रकार की मछली घंटी समाधान तैयार: 110 मिमी NaCl, 2.1 मिमी KCl, 2.6 मिमी 2 CaCl, 1.8 मिमी 2 MgCl और 10 मिमी Tris बफर; 7.4 पीएच.
  2. रीढ़ की हड्डी transection प्रदर्शन करने के लिए, एक छोटे कंटेनर में लार्वा जगह बर्फ के ठंडे घंटी समाधान में 1% tricaine methanesulfonate साथ anesthetized किया जाना है.
  3. Anesthetized जगह एक बार आधा Sylgard (सिलिकॉन) से भरा एक पेट्री डिश में जानवरों और एक पूंछ में, पशु के थूथन पर एक रखा जाता है (शल्य चिकित्सा के लिए स्थिति में जानवरों पकड़ करने के लिए 4 कीट पिन (0.15 मिमी व्यास) का उपयोग और दो ​​5 वें गिल के स्तर पर). लगभग घंटी समाधान के साथ चोटी पर चढ़ पेट्री डिश भरें. Stereomicroscope के तहत सर्जरी प्रदर्शन करते हुए बर्फ पर लार्वा के साथ पकवान रखो.
  4. रीढ़ की हड्डी transection एक पृष्ठीय को करने के लिए midline, 5 वीं के स्तर पर एक स्केलपेल (# 11) के साथ एक अनुदैर्ध्य चीरागिल रीढ़ की हड्डी कल्पना करने के लिए. शुरू में त्वचा सामना करना पड़ रहा है और रीढ़ की हड्डी के ऊपर से देखा जा सकता है जब तक तो मांसपेशियों के ऊतकों बहुत धीरे कट जाता है स्केलपेल ब्लेड की नोक डालने से खुला है. फैशन दो कीट पिन से हुक और रीढ़ की हड्डी transection प्रदर्शन करते हुए शरीर दीवारों खुला पकड़ करने के लिए उन्हें इस्तेमाल करते हैं.
  5. पूरी तरह से, कैंची की एक जोड़ी (8 Castroviejo #) का उपयोग करके 5 वें गिल के स्तर पर रीढ़ की हड्डी आड़ा काट रीढ़ की हड्डी को लंबरूप कैंची डालें. रीढ़ की हड्डी पूरी तरह से एक स्वच्छ कटौती के साथ transected हो गया है. रीढ़ की हड्डी पूरी तरह से transected गया है कि पुष्टि करने के लिए stereomicroscope के तहत रीढ़ की हड्डी में कटौती समाप्त होता है कल्पना. फिर, संदंश की एक जोड़ी (# 5) का उपयोग करके transection के बाद रीढ़ की हड्डी की कटौती समाप्त होता है फिर से संगठित करना.
  6. रीढ़ की हड्डी transection ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ पृष्ठीय शरीर दीवार में घाव को बंद करने और घाव टी अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए बर्फ पर लार्वा डाल प्रदर्शन के बादहे सूखी. बर्फ और लार्वा के बीच फिल्टर कागज के एक टुकड़े डाल दिया है और एक प्रकार की मछली घंटी समाधान के साथ लेना. कम तापमान में यह शुष्क है और इसलिए संक्रमण को रोकने में मदद करने के लिए हवा घाव की अनुमति देता है कि एक ही समय में जीवित जानवरों रहता है.
  7. फिर 24 घंटे के लिए बर्फ के ठंडे पानी के साथ छोटे टैंकों को लार्वा (टैंक प्रति 1 लार्वा) हस्तांतरण.
  8. Behaviorally चोट की साइट के लिए कोई आंदोलन दुम है कि वहाँ की पुष्टि करने के लिए रीढ़ की हड्डी transection के बाद lesioned लार्वा 1 दिन की जाँच करें. लार्वा (5 वें गिल के स्तर पर) चोट की साइट के लिए केवल अपने सिर व्याख्यान चबूतरे वाला स्थानांतरित कर सकते हैं अगर एक रीढ़ की हड्डी transection पूर्ण माना जाता है. अगर इस मामले में लार्वा अब 23 (कमरे के तापमान पर मीठे पानी के साथ टैंक (टैंक प्रति 1 लार्वा) को हस्तांतरित किया जा सकता है डिग्री सेल्सियस) उन्हें चुना समय बिंदुओं के लिए ठीक करने के लिए अनुमति देने के लिए.
  9. वसूली की अवधि के दौरान हर 2 से 3 दिन पानी बदल जाते हैं.

3 ब्रेन विच्छेदन और की तैयारीबगल में संकरण में लिए मस्तिष्क

  1. चोट के बाद वांछित समय बिंदुओं पर लार्वा समुद्र lampreys और जगह फिर से anesthetize और ऊपर के रूप में मस्तिष्क विच्छेदन प्रदर्शन करने के लिए घंटी समाधान के साथ पेट्री डिश में उन्हें पिन.
  2. मस्तिष्क काटना करने के लिए, पहले नथुने और पीनियल अंग के बीच स्केलपेल के साथ एक अनुप्रस्थ चीरा बनाते हैं. यहाँ से संदंश की एक जोड़ी के साथ इसे धारण करते हुए Castroviejo कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर मस्तिष्क आसपास के ऊतकों में कटौती करने के लिए शुरू.
  3. मस्तिष्क उजागर हो जाने के बाद, संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके रंजित जाल को हटाने और कपाल नसों पशु के सिर में फैला है और पर्दाफाश करने के लिए हुक का उपयोग करें. फिर, Castroviejo कैंची से रीढ़ की हड्डी transversally काटा. मस्तिष्क बाहर काटना कपाल नसों में कटौती करने के लिए संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग करते समय संदंश की एक जोड़ी के साथ रीढ़ की हड्डी पकड़ो.
  4. विच्छेदन के बाद, सिलिकॉन के एक छोटे से टुकड़े पर मस्तिष्क डाला और 2 आईएनएस डालने से स्थिति में पकड़रीढ़ की हड्डी में घ्राण बल्ब और 1 में ect पिंस. फिर, पीछे और कैंची से पृष्ठीय midline के साथ मस्तिष्क की cerebrotectal commissures कटौती और पार्श्व Alar प्लेटों से ध्यान हटाने और 4 कीट पिन (चित्रा 2) के साथ सिलिकॉन उन्हें फ्लैट पिन.
  5. एक रोटेटर पर 3 घंटे के लिए कमरे temparature पर तय होने की फॉस्फेट बफर खारा में 4% paraformaldehyde (7.4 पीएच) युक्त ट्यूब को मस्तिष्क के साथ सिलिकॉन का टुकड़ा स्थानांतरण.
  6. पहले से वर्णित के रूप में निर्धारण के बाद स्वस्थानी संकरण में wholemount के लिए दिमाग का उपयोग (स्वाइन एट अल., 1994). नियंत्रण या दिखावा संचालित जानवरों से दिमाग घायल जानवरों से दिमाग के साथ समानांतर में हमेशा चलाया जाना चाहिए. wholemounted लार्वा मस्तिष्क क्योंकि अपने फ्लैट और पतली आकार के और भी कारण मस्तिष्क काफी पारदर्शी बनाता है जो माइलिन 10 का अभाव, स्वस्थानी संकरण में से अध्ययन किया जा सकता है.

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Representative Results

इस पद्धति का उपयोग करते समय प्राप्त किया जा सकता है कि परिणामों के एक उदाहरण के रूप में पहचाने जाने रीढ़ की हड्डी पेश नियंत्रण के न्यूरॉन्स और 2 सप्ताह में neogenin टेप की अभिव्यक्ति दिखा wholemounted दिमाग के प्रतिनिधि छवियों घाव लार्वा समुद्र lampreys चित्रा 2 में दिखाया जाता है के बाद. पाठकों को एक पूर्ण रीढ़ की हड्डी transection और पूरी जानकारी के लिए समुद्र एक प्रकार की मछली के न्यूरॉन्स पेश पहचान योग्य रीढ़ की हड्डी के पुनर्योजी क्षमता के बाद neogenin की अभिव्यक्ति के बीच संबंध रिपोर्टिंग पिछले एक अध्ययन 6 में भेजा जाता है. संक्षेप में, परिणाम की चोट के बाद पहचाने जाने रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन्स में neogenin रिसेप्टर की अभिव्यक्ति में परिवर्तन कर रहे हैं कि पता चला है. Neogenin रिसेप्टर को प्राथमिकता एम 1, I1, I2, I4, या Mth न्यूरॉन्स (चित्रा 2B देखें) इन परिणामों के परिणाम प्रदर्शित करता है, जैसे बुरा regenerators में व्यक्त किया है एक पूरा रीढ़ की हड्डी transection के बाद दो सप्ताहऔर प्रोटोकॉल के neogenin रिसेप्टर इन कोशिकाओं के उत्थान की विफलता में शामिल किया जा सकता है कि सुझाव है.

चित्रा 1
चित्रा 1: पहचान योग्य reticulospinal न्यूरॉन्स के स्थान दिखा समुद्र एक प्रकार की मछली मस्तिष्क के एक पृष्ठीय देखने के योजनाबद्ध ड्राइंग. संक्षिप्त रूपों के लिए Barreiro-इग्लेसियस और Shifman. 5 से Reproduced, नीचे दी गई सूची देखें.

चित्रा 2
पृष्ठीय नियंत्रण (ए) में neogenin प्रतिलेख की अभिव्यक्ति दिखा परिपक्व लार्वा समुद्र एक प्रकार की मछली मस्तिष्क के विचारों और बाद चोट (बी) जानवरों 2 सप्ताह के चित्रा 2 photomicrographs. बी में ध्यान दें कि चोट n के बादeogenin प्रतिलेख preferentially बुरा regenerators होने के लिए जाना जाता न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है (उदाहरण के लिए, एम 1, I1, I2, I4 और Mth न्यूरॉन्स). इसके अलावा, मस्तिष्क (तीर) धारण करने के लिए इस्तेमाल किया पिंस द्वारा छोड़ा छेद की उपस्थिति ध्यान दें. पाठकों नीचे सूची देखें, संक्षिप्त के लिए Shifman और सहकर्मियों. 6 द्वारा पिछले अध्ययन करने के लिए भेजा जाता है.

संकेताक्षर

बी (बी 1-बी -6) कंदाकार क्षेत्र की मुलर कोशिकाओं (मध्य rhombencephalic जालीदार नाभिक)
hab.-ped. टीआर. habenulopeduncular पथ
I1-I6 Isthmic क्षेत्र की मुलर कोशिकाओं
मैंएक्स जिह्वा-ग्रसनी मोटर नाभिक
inf. infundibulum
isth. retic. isthmic जालीदार गठन
एम 1-M4 मुलर कोशिकाओं 1 से 4
महीना Mauthner सेल
महीना ' सहायक Mauthner सेल
SMI परिखा medianus अवर
वीएम त्रिपृष्ठी मोटर नाभिक
एक्स vagal मोटर नाभिक

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Discussion

यहाँ हम लार्वा समुद्र lampreys में एक पूरा रीढ़ की हड्डी transection और पीछे मस्तिष्क विच्छेदन प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. यह प्रक्रिया स्वस्थानी संकरण में एक साबुत माउंट मस्तिष्क के माध्यम से रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद पहचाने जाने रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन्स के बीच जीन अभिव्यक्ति में विश्लेषण मतभेद की अनुमति देता है. प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम धीरे से एक जोड़ी के साथ लार्वा की थूथन छूकर 24 घंटा बाद stereomicrocope तहत रीढ़ की हड्डी की कटौती समाप्त होता देख द्वारा नियंत्रित और इस बात की पुष्टि की जा सकती है जो एक पूर्ण रीढ़ की हड्डी transection का सही प्रदर्शन है, चोट की साइट के लिए कोई आंदोलन दुम अगर वहाँ संदंश को देखने के लिए. यह भी सर्जरी के लिए इस्तेमाल कैंची कुंद नहीं कर रहे हैं कि जानवर की वसूली के लिए महत्वपूर्ण है और एक एकल और साफ कटौती पूरी तरह से रीढ़ की हड्डी आड़ा काट करने के लिए किया जाता है.

चोट के बाद पशुओं के अस्तित्व अत्यधिक anim रखने से सुधार हुआ हैसर्जरी के दौरान और पहले 24 घंटे के लिए हवा शुष्क और फिर बर्फ के ठंडे पानी में घाव अनुमति देने के लिए प्रयोग किया जाता घंटे के दौरान बर्फ पर ए एल एस. इस अवधि के बाद घाव बंद है और जानवरों में पहले से ही कमरे के तापमान पर मीठे पानी के साथ टैंक को हस्तांतरित किया जा सकता है.

लार्वा lampreys. जानवरों का एक बड़ा बहुमत उच्च तापमान पर चोट के बाद पूर्ण हरकत व्यवहार समारोह की वसूली की वजह से कमरे के तापमान पर और नहीं उनके सामान्य ठंड के तापमान पर ठीक करने के लिए 11 की अनुमति दी जाती हरकत की एक सामान्य पद्धति से वसूली 8 से 10 सप्ताह मनाया जाता है पूरा रीढ़ की हड्डी transection के बाद.

यहाँ दिखाया गया के रूप में एक प्रदर्शन करने के लिए लार्वा दिमाग न केवल कार्रवाई की जा सकती चुना समय बिंदुओं पर पूरा रीढ़ की हड्डी transection और मस्तिष्क विच्छेदन प्रदर्शन के बाद स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट, लेकिन यह भी immunohistochemistry जैसे अन्य ऊतकीय तरीकों (के लिए (चित्रा 2) जैसे 7 (जैसे 8) या fluorochrome लेबल कस्पासे inhibitors का उपयोग करके सक्रिय caspases का पता लगाने. 5

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tricaine methane sulfonate Spectrum TR108 Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice
Scalpel #3 Fine Science Tools (FST) 10003-12
Blades for scalpel: #11 Fine Science Tools  10011-00
Castroviejo scissors #8 Fine Science Tools  15002-08
Forceps #4 & #5 Dumont, Switzerland Roboz RS4955 #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges
Dissecting Microscope Olympus SZ51
Sylgard Dow Corning Co. 184
Insect pins 0.15, 0.20 mm Austerlitz No catalogue # 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body
7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps Fisher Scientific 03-337-1
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Science (EMS) 19210 Dilute to 4% in PBS

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References

  1. Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
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