Deux-Photon
1Department of Molecular Cell and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

Neuroscience

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Yu, X., Zuo, Y. Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation. J. Vis. Exp. (87), e51520, doi:10.3791/51520 (2014).

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Abstract

Dans le cortex des mammifères, les neurones forment des réseaux très complexes et l'échange d'informations au niveau des synapses. Changements dans la force synaptique, ainsi que l'ajout / suppression de synapses, se produisent d'une manière dépendant de l'expérience, fournissant la base structurelle de la plasticité neuronale. Comme composants post-synaptiques des synapses excitateurs plus dans le cortex, épines dendritiques sont considérées comme un bon indicateur de synapses. Prendre avantages de la génétique de la souris et des techniques de marquage par fluorescence, des neurones et de leurs structures synaptiques peuvent être marqués dans le cerveau intact. Ici, nous introduisons un protocole d'imagerie transcrânienne utilisant deux photons microscopie à balayage laser à suivre épines dendritiques post-synaptiques marquées par fluorescence dans le temps in vivo. Ce protocole utilise une préparation-crâne amincie, ce qui maintient intact le crâne et évite les effets inflammatoires causées par l'exposition des méninges et le cortex. Par conséquent, les images peuvent être acquises immédiatement après surgery est effectuée. La procédure expérimentale peut être effectuée de manière répétitive au cours de différents intervalles de temps allant de quelques heures à plusieurs années. L'application de cette préparation peut également être étendu pour étudier différentes régions et couches corticales, ainsi que d'autres types de cellules, dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Introduction

Le cortex des mammifères participe à de nombreuses fonctions du cerveau, de la perception sensorielle et contrôle des déplacements à l'abstrait traitement de l'information et de la cognition. Diverses fonctions corticales s'appuient sur différents circuits neuronaux, qui sont constitués de différents types de neurones qui communiquent et échangent des informations au niveau des synapses individuelles. La structure et la fonction des synapses sont constamment modifiés en réponse à des expériences et des pathologies. Dans le cerveau mature, la plasticité synaptique prend la forme de deux changements de résistance et ajout / suppression de synapses, jouant un rôle important dans la formation et l'entretien d'un circuit neuronal fonctionnel. Épines dendritiques sont les composantes post-synaptiques de la plupart des synapses excitatrices dans le cerveau des mammifères. Le chiffre d'affaires constant et les changements morphologiques des épines sont censées servir comme un bon indicateur de modifications dans les connexions synaptiques 1-7.

Biphotonique à balayage laser microscopie offre pénétration profonde à travers épaisses, préparations opaques et faible phototoxicité, qui le rend approprié pour l'imagerie en direct dans le cerveau intact 8. En combinaison avec un marquage fluorescent, l'imagerie à deux photons fournit un outil puissant pour jeter un regard dans le cerveau vivant et suivez réorganisation structurelle au niveau des synapses individuelles à haute résolution spatiale et temporelle. Divers procédés ont été utilisés pour préparer des souris pour l'imagerie en temps réel 9-13. Ici, nous décrivons une préparation-crâne amincie de l'imagerie in vivo à deux photons pour étudier la plasticité structurale des épines dendritiques post-synaptiques dans le cortex de la souris. En utilisant cette approche, nos études récentes ont représenté une image dynamique de l'évolution de la colonne vertébrale dendritiques en réponse à moteur compétence apprentissage Avec la disponibilité croissante des animaux transgéniques avec des sous-ensembles de neurones marqués par fluorescence et le développement rapide des techniques in vivo dans l'étiquetage, les procédures similaires à ceux décrits ici peuvent également être appliqués à enquêted'autres types de cellules et de te régions corticales, combinés à d'autres manipulations, ainsi que utilisé dans les modèles de la maladie 16-23.

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Protocol

Approbation doit être obtenue à partir d'institutions d'origine avant le début de la chirurgie et de l'étude d'imagerie. Les expériences décrites dans ce manuscrit ont été réalisées en conformité avec les directives et règlements de l'Université de Californie, Santa Cruz institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.

Chirurgie 1.

  1. Autoclave tous les instruments chirurgicaux et stériliser l'espace de travail avec 70% d'alcool bien avant la chirurgie.
  2. Anesthésier la souris par voie intrapéritonéale (IP) l'injection d'une solution d'anesthésique KX (200 mg / kg de kétamine et 20 mg / kg de xylazine) en fonction du poids corporel de la souris. Remarque: dosage KX peut être ajustée en fonction de la souche, l'âge et l'état de santé des souris. Consultation vétérinaire pour déterminer la dose optimale est également recommandé.
  3. Effectuer un test de pincement pincée périodiquement en appuyant sur les orteils de la souris et de contrôle pour une réponse réflexe à surveiller l'état de l'anesthésie.Assurez-vous que la souris est totalement anesthésié avant de commencer l'opération. Remarque: Pendant les sessions d'imagerie prolongées, vérifier l'état de l'anesthésie de la souris périodiquement, administrer supplémentaire KX si nécessaire.
  4. Placer la souris sur un coussin chauffant pour maintenir la température du corps pendant l'intervention chirurgicale.
  5. Raser la tête de la souris en utilisant une lame de rasoir pour exposer le cuir chevelu.
  6. Stériliser la zone rasée en essuyant la peau avec une alternance de tampons d'alcool et de la bétadine. Retirez toutes les coupures de cheveux résiduels.
  7. Appliquez doucement la pommade oculaire à lubrifier les deux yeux, empêchant ainsi des dommages permanents causés par la déshydratation pendant l'expérience.
  8. Faire une incision droite le long de la ligne médiane du cuir chevelu, et la peau se déplacer latéralement vers les bords du crâne.
  9. Retirer le tissu conjonctif attaché au crâne.

2. Diluée-crâne Préparation

  1. Identifier la région d'imagerie basée sur ster. coordonnées eotaxic Note: Essayez d'éviter les gros vaisseaux sanguins, ce qui pénétration de la lumière de bloc et le flou des structures de représentation. Vasculaire est mieux observée lorsque le crâne est humide avec une solution saline stérile.
  2. Utilisez le micro forage à grande vitesse à une mince zone circulaire de crâne (diamètre 0,5-1,0 mm). Déplacez le forage parallèle à la surface du crâne, plutôt que de tenir contre le crâne et en appuyant sur. Forage jusqu'à ce que à la fois la couche d'os compact externe et la couche de l'os spongieux milieu sont supprimés. Remarque: Pour éviter les dommages causés par la surchauffe, éviter le contact prolongé entre la foret et le crâne.
  3. Poursuivre l'amincissement de la couche interne de l'os compact avec une lame de microchirurgie dans le centre de la région amincie de forage. Maintenir la lame de microchirurgie à un angle d'environ 45 ° pour gratter le crâne, sans appuyer contre la boîte crânienne jusqu'à ce qu'une petite région amincie de façon égale (200 à 300 um de diamètre) avec une épaisseur d'environly 20 à 30 pm est obtenu. En raison de l'auto-fluorescence du crâne, l'épaisseur peut être mesurée par le balayage de la distance entre les surfaces supérieure et inférieure de la boîte crânienne dans le cadre du deux photons microscope. Remarque: bien que l'épaisseur du crâne de moins de 20 um assure une bonne qualité de formation d'image, il n'est pas recommandé, car il rend le processus d'amincissement en séances de renouvellement d'imagerie suivants difficile. Pour éviter de l'amincissement, l'épaisseur du crâne doit être vérifiée périodiquement au cours de la chirurgie (voir Discussion).

3. Immobilisation

  1. Retirez soigneusement les débris osseux.
  2. Placer une petite goutte de colle cyanoacrylate sur chaque bord de l'ouverture centrale de la plaque de tête stérile, qui a été stérilisé à l'autoclave (voir figure 1). Maintenez la plaque de tête fermement contre le crâne avec la région amincie situé dans le centre de l'ouverture. Remarque: Si la colle contamine le r amincieégion par accident, retirez-le soigneusement avec la lame de microchirurgie.
  3. Tirer doucement la peau contre les parois latérales du crâne vers les bords de l'ouverture centrale de la plaque de tête.
  4. Attendez environ 10 min jusqu'à ce que la plaque de tête est bien fixé sur le crâne.
  5. Placer la plaque de tête sur deux blocs latéraux de la plaque de maintien, puis serrer les vis sur les bords de la plaque de tête pour immobiliser la souris sur la plaque de maintien (voir la figure 1). Remarque: Assurez-vous qu'il n'y a pas la peau ou les moustaches entre la plaque de tête et les blocs avant de serrer les vis. Une bonne préparation immobilisée doit montrer aucun mouvement observable du crâne sous le microscope de dissection lorsque le dos de l'animal est légèrement tapoté.
  6. . Rincer le crâne exposé avec une solution saline pour enlever la colle non polymérisée Remarque: Il est important d'enlever tout résidu de colle, de la colle non polymérisée brouille les images et les dommages de microscope objectifs <./ Li>

4. Imaging

  1. Prenez une photo de la vascularisation du crâne exposé avec la région amincie carte 1, qui est utilisé pour déplacer la région imagée dans les séances d'imagerie suivants (voir Figure 2).
  2. Placer la souris sous le microscope d'imagerie. Localisez la zone amincie sous un objectif d'air 10X en utilisant épifluorescence et déplacer la zone la plus mince au centre de la vue.
  3. Ajouter une goutte de solution saline sur le sommet du crâne et de passer à l'objectif 60X, qui a été rincé avec de l'eau stérile. Sélectionnez une région où les épines dendritiques individuelles sont clairement visibles le long des dendrites. Identifier et étiqueter la région correspondante sur la carte 1 en comparant vasculaire entre la vue à fluorescence et la photo de la vascularisation.
  4. Accordez la longueur d'onde de laser à deux photons selon les fluorophores. Par exemple, 920 nm pour la YFP; 890 nm pour la GFP; 1000 nm pour DsRed et tdTomato 24.
  5. Acquérir des piles d'images avec 2um étapes le long de l'axe z en utilisant l'objectif 60X. Cette pile d'image couvre une zone de 200 x um environ 200 um (512 x 512 pixels) et est utilisée comme carte 2 pour une réinstallation pendant les séances d'imagerie suivants (voir Figure 2).
  6. Acquérir neuf piles d'images au sein de la carte 2 en utilisant un zoom numérique 3x. Chaque pile d'images couvre une superficie approximative de 70 um x 70 um (512 x 512 pixels), avec 0,7 um étapes le long de la z-axe. Remarque: L'intensité du laser doit être inférieure à 40 mW lorsqu'il est mesuré à des échantillons afin de minimiser la phototoxicité.

5. Recovery

  1. Après l'imagerie, détachez la plaque de tête du crâne.
  2. Nettoyer soigneusement le crâne et la peau pour enlever tous les résidus de colle. Remarque: Tous les résidus de colle sur la peau provoque des irritations et ralentir la cicatrisation de la peau tandis que la colle restante sur le crâne provoque l'érosion du crâne et unengiogenesis dans la couche d'os nouvellement développé, ce qui rend la réinstallation subséquente et la nouvelle image difficile.
  3. Rincer le crâne et la peau avec une solution saline à plusieurs reprises.
  4. Suturer le cuir chevelu avec suture chirurgicale stérile.
  5. Gardez l'animal sur un coussin chauffant dans une cage séparée. Administrer la buprénorphine analgésique (0,1 mg / kg) par voie sous cutanée à atténuer la douleur post-opératoire. Retour à l'animal de la cage d'accueil après guérison complète. Surveillance de l'animal de près (vérifier au moins une fois par jour) jusqu'à ce que l'incision est guéri et les sutures sont enlevés. Administrer des injections ultérieures de la buprénorphine analgésique si nécessaire.

6. Recréation d'image

  1. Répétez les étapes 1.1 à 1.8.
  2. Répétez les étapes 3.1 à 3.6
  3. Localiser région précédemment imagée en comparant le modèle du système vasculaire à la carte 1 et le motif de branche dendritique à la carte 2.
  4. Si réimagerie est réalisée dans 1 semaine, répétez l'étape 2.3 pour enlever la fine couche d'os nouvellement augmenté au-dessus de la re amincierégion en utilisant la lame de microchirurgie. Si réimagerie est effectué après plus de 1 semaine, répétez les étapes deux 2.2 et 2.3. Remarque: La couche d'os nouvellement développé se compose d'une structure moins condensée par rapport à la couche d'os compact original, entraînant une réduction de la qualité de l'image. Par conséquent, pour acquérir la même qualité, il est nécessaire de diluer le crâne un peu plus de la session de formation d'image précédente.
  5. Ajustez la position et l'orientation d'obtenir des piles d'images qui correspondent déjà pris des piles d'images au microscope à deux photons.
  6. Acquérir les images comme dans l'étape 4.6.
  7. Répétez les étapes 5.1 à 5.5 après l'imagerie.

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Representative Results

Dans YFP-H ligne 25 souris, la protéine fluorescente jaune exprime dans un sous-ensemble de neurones pyramidaux couche V, qui font saillie de leurs dendrites apicales pour les couches superficielles du cortex. Grâce à la préparation-crâne amincie, les segments dendritiques marquées par fluorescence peuvent être répétitive imagées sous microscope à deux photons sur différents intervalles d'imagerie, allant de quelques heures à plusieurs mois. Ici, nous montrons un exemple de formation d'image à quatre temps des mêmes dendrites de plus de 8 jours dans le cortex moteur d'une souris âgé de 1 mois, où épines individuels ainsi que des filopodes peuvent être clairement visibles le long de la dendrite. Généralement, la profondeur de piles d'images est d'environ 100 à 200 um de la surface piale. Diverses analyses peuvent être effectuées sur la base de ces images. Par exemple, la formation de la colonne vertébrale, l'élimination et la rotation peut être quantifiée en comparant les images de différentes sessions. la densité de la colonne vertébrale peut être calculé en divisant le nombre d'épines par la longueur de la dendritsecteur ic. Les changements de la colonne vertébrale de la motilité et la morphologie peuvent également être analysées.

Figure 1
Figure 1. Immobilisation des plaques de préparation-de crâne amincie pour deux photons imagerie in vivo faites sur mesure. (A) Une photographie de la plaque de tête, qui se compose de deux ou trois lames de rasoir collées ensemble, avec des arêtes vives couverts par des bandes. (B) Une photographie de la plaque de maintien, qui se compose d'une plaque en acier inoxydable, 2 blocs d'acier inoxydable, 2 vis et 2 entretoises.

Figure 2
Figure 2. Transcrânienne d'imagerie à deux photons à travers une préparation-crâne amincie dans le cortex moteur de la souris, images in vivo ont été acquis. (B) Une projection maximale à faible grossissement de branches dendritiques dans le cortex moteur d'un 1 mois souris (carte 2). (C) des images répétitives du même segment dendritique révèlent épines nouvellement formés (pointes de flèche), épines éliminés (flèches), et filopodes (étoiles) au jour 0, 2, 4, et 8. Le panneau de gauche est une vue supérieure grossissement de le segment dendritique représentée sur la région encadrée en (B). Barres d'échelle: 500 um (A), 20 um (B) et 2 pm (C).

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Discussion

Pour obtenir une préparation-de crâne amincie succès, plusieurs étapes de ce protocole sont cruciales. 1) L'épaisseur de la boîte crânienne. L'os crânien a une structure en sandwich, avec deux couches de haute densité osseuse compacte et une couche intermédiaire de faible densité de l'os spongieux. Bien que le micro-foret à haute vitesse est adapté pour enlever les couches externes de l'os compact et l'os spongieux, la lame de microchirurgie est idéal pour l'amincissement de la couche interne de l'os compact. Comme l'épaisseur et la rigidité des augmentations de crâne au cours du développement, l'imagerie de la souris adulte nécessite plus d'os à enlever afin d'obtenir des images de bonne qualité. La zone amincie présente un aspect solide et transparent assure une bonne qualité de formation d'image lorsque l'épaisseur du crâne est d'environ 20 à 30 um. L'épaisseur du crâne doit être vérifiée périodiquement au cours du processus d'amincissement que rend le processus d'amincissement à des séances de réimagerie ultérieures difficile sur amincissement. 2) La taille de la région amincie.Il est important d'établir une configuration de crâne amincie stable, où une cavité en forme de cône est réalisé. L'architecture de la région amincie avec une bonne taille empêche d'endommager le cortex et permet l'amincissement en séances de renouvellement d'imagerie suivantes. Il est recommandé d'effectuer la zone de fond (environ 200 à 300 um de diamètre) de la région amincie plus petite que l'ouverture supérieure (environ 0,5 à 1,0 mm de diamètre). 3) La stabilité des images. Une préparation bien immobilisée contribue à améliorer la qualité de l'image en réduisant des artefacts de mouvement respiratoire induite. Il est important de garder le crâne sec et dépourvu de tissu conjonctif et des débris d'os avant de la plaque de tête est fixé sur le crâne. La colle supplémentaire peut également être appliquée pour combler les lacunes qui subsistent entre la plaque de tête et le crâne. En outre, le ciblage d'un endroit à l'écart de la grande vascularisation minimise également les mouvements provoqués par la circulation du sang.

Enquête sur les changements dans le soutien-gorgedans des animaux avec une résolution spatiale et temporelle en utilisant la microscopie à deux photons vivant nécessite la génération d'une fenêtre optique. En plus de la préparation-crâne amincie, structures marquées par fluorescence peuvent également être visualisés en enlevant le crâne et le remplacer par un couvercle en verre (généralement 3-5 mm de diamètre) qui fournit une fenêtre d'imagerie clair 10, 13. Bien que les deux amincie crâne et des protocoles d'imagerie en plein crâne sont largement appliquées pour des études in vivo d'imagerie, chaque méthode a ses propres avantages et est adapté à différents modèles expérimentaux. Par exemple, la préparation en plein crâne est utile pour les études qui se penchent sur ​​des surfaces relativement importantes du cerveau (par exemple, 5 mm de diamètre) et nécessitent de nombreuses séances d'imagerie avec de courts intervalles (c.-à-jour). Une fois la fenêtre crânienne est implanté avec succès, aucune intervention chirurgicale n'est nécessaire. Toutefois, une période post-chirurgie (habituellement environ 1 mois) est nécessaire avant la première imagesession pour améliorer les réponses inflammatoires potentiels causés par la chirurgie. Ré-imagerie devient impossible lorsque la fenêtre crânienne est bloqué par la repousse de l'os et / ou l'épaississement des méninges. En revanche, les animaux avec une préparation-crâne amincie peuvent être visualisés immédiatement après la chirurgie initiale, le rendant plus adapté pour l'imagerie chronique des animaux plus jeunes (par exemple, 2 semaines). Il est adapté pour investigation avec des intervalles d'imagerie longues (à savoir les mois à plusieurs années), que la repousse de l'os et la dure-épaississant n'est pas problématique. Toutefois, re-amincissement du crâne est habituellement exigé pour les sessions ultérieures re-imagerie (même avec des intervalles de 2 jours) en raison de la repousse osseuse. En outre, la couche d'os nouvellement développé est constitué d'une structure condensée moins par rapport à l'os compact d'origine, ce qui réduit grandement la transparence de la région amincie-crâne. Par conséquent, pour acquérir la même qualité des images, il est nécessaire d'enlever complètement la couche d'os nouvellement développée. Et un telttempts conduisent généralement à l'épaisseur finale du crâne dans la formation d'image ultérieure plus mince que la préparation précédente. Depuis l'épaisseur du crâne avait été préparé à 20-30 um dans la première séance d'imagerie, laissant peu de place pour une nouvelle éclaircie, le temps total d'imagerie de préparation-crâne amincie est généralement moins de 5 fois. Récemment, une nouvelle approche expérimentale nommé poli et renforcé amincie crâne (ports) a été développé pour combiner les deux préparations éclaircis et en plein crâne 11, 26, 27.

Jusqu'à présent, la majorité de l'imagerie in vivo dans le cortex a été effectuée en utilisant des lignées de souris transgéniques exprimant la EGFP ou YFP sous neuronale promoteur Thy1 spécifique. Ces souris transgéniques expriment des protéines fluorescentes à faible densité dans un sous-ensemble, mais la population mixte de neurones corticaux 25. Depuis de nombreuses preuves suggèrent que la plasticité structurelle dépendant de l'expérience qui se passe dans seletypes de cellules ctive de circuits bien définis, il est important d'étiqueter et de l'image d'une manière spécifique au type de cellule. A ce jour, de nombreuses approches ont été appliquées pour atteindre cet objectif. Par exemple, les neurones pyramidaux dans différentes couches corticales peuvent être ciblés en effectuant électroporation in utero à des stades embryonnaires définies 28, 29. De même, l'injection de vecteurs viraux modifiés pour exprimer une protéine fluorescente peut également être utilisé pour marquer des cellules dans différentes régions du cerveau 30. En outre, de nombreuses lignées de souris transgéniques ont été générées pour entraîner l'expression de la recombinase Cre sous promoteurs d'un type de cellule spécifiques 31, 32. L'injection de vecteurs viraux tels que le virus adéno-associé transportant gène rapporteur fluorescent suivant un codon d'arrêt dans ces souris floxé offre la possibilité de cibler une catégorie particulière de neurones dans une région restreinte 33. En combinant ces nouvelles approches étiquetage avec notre-s aminciepréparation Kull, des changements dans les connexions synaptiques des neurones corticaux peut être étudiée à deux photons par l'imagerie in vivo dans un type cellulaire et / ou de manière spécifique de circuit.

Avec la disponibilité croissante des animaux transgéniques avec des populations de cellules marquées par fluorescence et le développement rapide des techniques in vivo dans l'étiquetage, les procédures similaires à ceux décrits ici peuvent également être appliqués à étudier d'autres types de cellules (cellules gliales) et vasculaire dans le cerveau vivant. Combiné avec des manipulations de comportement et des modèles de maladies, à deux photons imagerie in vivo considérablement élargir notre compréhension des mécanismes moléculaires, cellulaires et circuits qui sous-tendent les fonctions cérébrales.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgements

Nous remercions James Perna pour l'illustration graphique. Ce travail a été financé par des subventions de l'Institut national de la santé mentale à YZ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Bioniche Pharma 67457-034-10 Mixed with xylazine for anesthesia
Xylazine Lloyd laboratories 139-236 Mixed with ketamine for anesthesia
Saline Hospira 0409-7983-09 0.9% NaCl for injection and imaging
Razor blades Electron microscopy sciences 72000 Double-edge stainless steel razor blades
Alcohol pads Fisher Scientific 06-669-62 Sterile alcohol prep pads
Eye ointment Henry Schein 102-9470 Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant
High-speed micro drill Fine Science Tools 18000-17 The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area
Micro drill steel burrs Fine Science Tools 19007-14 1.4 mm diameter
Microsurgical blade Surgistar 6961 The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone
Cyanoacrylate glue Fisher Scientific NC9062131 Fix the head plate onto the skull
Suture Havard Apparatus 510461 Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament
Dissecting microscope Olympus SZ61
CCD camera Infinity
Two-photon microscope Prairie Technologies Ultima IV
10X objective Olympus NA 0.30, air
60X objective Olympus NA 1.1, IR permeable, water immersion
Ti-sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP

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References

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