Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

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Biology

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Summary

Beacons bimoleculares proporcional (RBMBs) pode ser usado para imagens simples transcrições de RNA projetados em células vivas. Aqui, nós descrevemos a preparação e purificação de RBMBs, entrega de RBMBs em células de formação de microporos e de imagem fluorescente de transcritos de ARN em tempo real.

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Song, Y., Zhang, X., Huang, L., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons. J. Vis. Exp. (90), e51544, doi:10.3791/51544 (2014).

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Abstract

A crescente compreensão de que tanto a regulação temporal e espacial da expressão de genes pode ter consequências importantes para a função da célula levou ao desenvolvimento de diversas técnicas para visualizar os transcritos de ARN individuais em células vivas individuais. Uma técnica promissor que tem sido recentemente descrito utiliza uma sonda baseada no oligonucleótido óptico, raciométrica baliza bimolecular (RBMB), para detectar transcritos de ARN que foram modificados para conter, pelo menos, quatro repetições em tandem da sequência alvo RBMB na região 3 'não traduzida. RBMBs são especificamente concebidos para emitir um sinal fluorescente brilhante após hibridação com o ARN complementar, mas caso contrário, permanecer extinta. O uso de uma sonda sintética nesta abordagem permite fotoestável, vermelho-deslocado, e corantes orgânicos altamente emissiva para ser usado para imagiologia. A ligação de vários RBMBs para os transcritos de ARN modificadas resulta em manchas discretas de fluorescência quando visto sob um microscópio de fluorescência de campo amplo. Por conseguinte, o movimento de transcritos de ARN individuais podem ser facilmente visualizados em tempo real pelo tempo de tomar uma série de imagens fluorescentes. Aqui descreve-se a preparação e purificação de RBMBs, entrega em células de formação de microporos e vive-célula imagiologia de transcritos de ARN.

Introduction

A expressão e regulação dos transcritos de RNA é um processo complexo e dinâmico, que é em grande parte responsável por controlar o comportamento das células e destino. Embora a importância da RNA em função das células ditando tem sido conhecida há algum tempo, muitas vezes é difícil estabelecer ligações claras entre os dois desde que a maioria das ferramentas de análise de RNA não têm a resolução espacial e temporal exigido para capturar eventos regulatórios importantes, tais como a transcrição de ruptura, RNA tráfico e processamento de RNA localizada. Isto levou ao aparecimento de diversas técnicas que permitem que os transcritos de ARN individuais a serem visualizados em células vivas em tempo real 1. Talvez o mais importante destas técnicas utiliza uma proteína de fusão GFP-MS2 de RNA alvo, que tenha sido modificado para conter repetições em série de local de ligação MS2 na 3'-UTR de 2,3. Ao trazer várias moléculas de GFP em estreita proximidade, transcrições de RNA individuais aparecem manchas fluorescentes como brilhantesatravés de microscopia de fluorescência. O sistema de GFP-MS2 forneceu uma visão sem precedentes sobre o comportamento do RNA, incluindo a visualização direta e medidas de transcrição estourando 4,5, detecção de localização sub-celular exclusivo e processamento de 6-9, e imagens em tempo real do transporte de RNA 10. No entanto, apesar do enorme potencial de o sistema de GFP-MS2, proteínas de fusão GFP-MS2 não ligados podem criar um sinal de fluorescência de fundo elevado, que limita a versatilidade e gama dinâmica desta técnica. Várias abordagens foram desenvolvidas para limitar o sinal de fundo, incluindo compartimentalização subcelular de desacoplado GFP-MS2 10, fragmento de proteína complementação 11, e proteínas de ligação de RNA alternativas e tem como alvo 12. No entanto, todas estas abordagens permanecem sensíveis para a expressão relativa e total do alvo de ARN e proteína de fusão GFP-MS2.

Como umlternative para os sistemas de GFP-MS2, faróis moleculares também têm sido utilizados para detectar transcritos de ARN modificadas com repetições em tandem de o sítio de ligação complementar na 3'-UTR 13,14. Os faróis moleculares são sondas oligonucleotídicas de formação de gancho que estão marcadas, numa extremidade com um extintor e na outra extremidade com um repórter fluorescente. Quando não está ligado ao RNA alvo do repórter fluorescente e extintor permanecem em estreita proximidade, resultando num estado de baixa fluorescência. Após a hibridação, o repórter fluorescente e extintor ser separadas e a fluorescência é restaurado. Semelhante ao sistema de GFP-MS2, a ligação de vários faróis moleculares para um único transcrito de ARN resulta em uma mancha fluorescente brilhante, que pode ser identificado por meio de microscopia de fluorescência; no entanto, a fluorescência de fundo deverá ser de muito menor, devido à configuração da extinta faróis moleculares não ligados. Infelizmente, apesar de o mecanismo de activação inteligente que é incorporada no mprojeto farol olecular, agora há evidências crescentes de que não hibridizada beacons moleculares não permanecem na conformação hairpin quando introduzido em células vivas. Por conseguinte, eles geram um sinal falso-positivo que reduz significativamente a relação sinal-fundo. Para superar essa deficiência, que recentemente desenvolveu uma nova sonda sintética para RNA de imagem em células vivas, balizas bimoleculares proporcional (RBMBs; Figura 1A) 15,16. RBMBs são compostas de duas cadeias oligonucleotídicas 2'-O-metilo que forma uma estrutura híbrida com as características de ambos os ARN curto hairpin (shRNA) e faróis moleculares. O mecanismo de activação circular e de fluorescência é semelhante ao de farol molecular, enquanto que o domínio de cadeia dupla longo com uma saliência 3'-UU é mais característico dos shRNA. Os recursos shRNA são projetados para conduzir exportação nuclear, o que temos encontrado aumenta vida intracelular de> 24 horas, com a degradação observável mínimo, eimpede a abertura não específico do ciclo. Como um resultado RBMBs apresentam um fundo de sinal-para-significativamente mais elevada do que faróis moleculares.

Deve notar-se que RBMBs não pode ser preparado utilizando os oligonucleótidos de ADN, uma vez que sondas baseadas em ADN não possuem as mesmas capacidades de exportação nuclear como sondas baseados no RNA. Estruturalmente, o loop RBMB é tipicamente concebida para estar entre 15 e 21 bases de comprimento, para criar um equilíbrio entre a especificidade e selectividade mediante hibridação de ARN. O curta-tronco que se forma a partir dos dois domínios auto-complementares normalmente é projetado para ser de 4 bases. Se uma haste mais longa for selecionado, a taxa de hibridação entre o loop RBMB e RNA alvo fica lento significativamente 17,18. Por outro lado, quando uma sequência de caule mais curto é seleccionada a temperatura de fusão é frequentemente demasiado baixa para manter a estrutura em ansa pedunculada, a 37 ° C, conduzindo a um sinal de fundo elevado. A especificidade do RBMB também é vermelhouced como o comprimento da haste é encurtado. Como a seqüência do RBMB tronco de loop também pode influenciar o desempenho RBMB, deve ser cuidadosamente selecionados 19. Em particular, as sequências de loop ideal deve ter o mínimo de estrutura secundária, hibridizam com seqüências de RNA com estrutura secundária mínima, evitar locais de ligação de proteínas e evite off-meta vinculativa. Previsões de ambos RBMB e estrutura secundária do RNA pode ser obtida usando softwares como o mfold 20. Complementares locais fora do alvo podem ser identificados através de um trabalho de busca local ferramenta básica de nucleotídeos (BLAST). No entanto, por causa de inconsistências nas previsões do modelo e da dificuldade em identificar sites de licitação de proteínas, a especificidade de todos os RBMBs deve finalmente ser validadas experimentalmente.

Se desejável, um corante de referência unquenched que é insensível ao estado de hibridação pode ser adicionado à RBMB 15. A adição de um corante de referência pode prOvide um marcador para entrega sonda e ser usado para geração de imagens ratiometric, se forem necessárias medições mais precisas de fluorescência celular total. Os corantes de referência permite a medição de ser ajustados para as diferenças no fundo, devido às variações de célula-a-célula no parto. No entanto, na obtenção de imagens de ARN transcritos indivíduo o corante de referência não é necessário. Notavelmente, alguns corantes de referência pode interferir com a exportação de RBMBs a partir do núcleo, conduzindo a um sinal de fundo ligeiramente mais elevada no núcleo.

Quando concebida adequadamente, RBMBs pode ser utilizado para imagem transcritos de ARN individuais em células vivas individuais, se o RNA alvo é modificado para conter, pelo menos, quatro locais de ligação RBMB (Figura 1B) 16. RBMBs pode ser eficientemente entregues em uma ampla gama de tipos de células, através de formação de microporos, com pouco ou nenhum efeito sobre a viabilidade das células 21, e as medições quantitativas da expressão do gene pode seradquirido dentro de 30 min. Além disso, a metodologia é relativamente insensível a níveis de concentração RBMB e RNA alvo, uma vez que a fluorescência a partir de RBMBs não ligadas é extinta eficientemente. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada da metodologia utilizada para preparar e purificar RBMBs, bem como um procedimento geral para a entrega de RBMBs em células vivas através de microporos ea imagem de transcrições de RNA em tempo real.

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Protocol

Neste protocolo, um oligonucleotídeo (RBMB1) foi marcado em sua extremidade 5 'com um corante repórter CF640R e tem a sequência: 5'-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mamama mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3'. Domínios auto-complementares, que levam à formação da estrutura em grampo, estão em negrito. O segundo oligonucleótido (RBMB2) foi marcado na extremidade 3 'com um agente de extinção de Iowa Preto RQ-Sp e tem a sequência: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3'.

1 Preparação de RBMBs

  1. Executar uma rotação rápida dos tubos contendo as RBMB1 e RBMB2 oligonucleótidos, para assegurar o oligonucleótido seca está na parte inferior do tubo, e ressuspender em água DNase e RNase para uma concentração final de 100 uM. Por exemplo, uma amostra de 10 nmol de oligonucleótido deverá ser ressuspenso em 100 ul de água.
  2. Measure a concentração exacta de amostras e RBMB1 banco RBMB2 por espectroscopia de UV-vis.
    1. Misturar 3 ul da amostra RBMB com 117 ul (DPBS sem cálcio e magnésio) em um tubo de microcentrífuga.
    2. Em branco o espectrofotômetro com DPBS e medir a absorvância 200-800 nm. Nota: Pico se as absorvâncias a 260 nm e 650 nm deve ser visível.
    3. Calcula-se a concentração de estoque de amostras RBMB base na absorvância a 260 nm (ou 650 nm para RBMB1), usando a equação:
      Da concentração (M) = 260 * Um coeficiente de factor de diluição / extinção em que A é a absorvância de 260 a 260 nm, e o factor de diluição é de 40.
      Nota: O coeficiente de extinção para a RBMB pode ser encontrado na folha especificação fornecida pelo fabricante do oligonucleótido. O coeficiente de extinção a 650 nm CF640R é 103.000.
  3. Misturar 20 ul de 100 uM RBMB1, 30 ul de 100 uM RBMB2, 6 ul 10x; Tampão fosfato (10x tampão fosfato: 480 mM de K 2 HPO 4, 45 mM de KH 2 PO 4, 140 mM de NaH 2 PO 4, pH 7,2) e 4 mL de água e de DNase isenta de RNase. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 30 min. Nota: Este é normalmente suficiente para cerca de 50 estudos.
  4. Prepara-se uma coluna de cromatografia líquida utilizando 75 grau prep Superdex para remover quaisquer oligonucleótidos RBMB2 não hibridizadas. Usar um 8 mL (0,7 x 20 cm) de coluna de cromatografia líquida com um volume de leito ~ 4 ml para purificar o pequeno volume de sondas mistas.
  5. Lavar e equilibrar o Superdex com ~ 50 ml de tampão de fosfato de 1x usando uma bomba de seringa, rodando a um fluxo a uma taxa de fluxo de 0,6 ml / min. Antes de todo o fluido entra no volume de leito, parar a bomba de seringa, separá-lo e deixar o líquido restante através da coluna vai por gravidade.
  6. Carregar a mistura RBMB (60 uL) na coluna de cromatografia.
    1. Depois a amostra foi completamente RBMBentrou na cama, adicionar lentamente mais 250 ul de 1x tampão de fosfato para o topo do leito para assegurar que toda a amostra entrou completamente a coluna.
    2. Encher a coluna até a borda com tampão de fosfato de 1x. Feche o topo, e ligar a bomba de seringa - a seringa deve ser preenchido com ~ 50 ml de PBS 1x e correr a uma taxa de fluxo de 0,6 ml / min.
    3. Uma vez que o RBMB se aproxima da parte inferior da coluna - a amostra RBMB pode tipicamente ser prontamente visualizado devido à cor do corante incorporado na sonda - recolher o fluxo de passagem em duas gotas por tubo de microcentrifugação (1,5 ml). Pare de coletar a amostra uma vez que a cor dentro dos microtubos se torna claro.
  7. Combine os tubos contendo a amostra RBMB cor - geralmente 5-6 tubos - e carregar em um dispositivo de filtro centrífugo (10.000 MW de corte). Centrifuga-se a amostra a 10000 RCF durante 20 minutos ou até que o volume desejado. Nota: Estas velocidades e tempos normalmenteoriginar um volume final de ~ 30 mL.
  8. Medir a concentração exacta da amostra RBMB purificado por espectroscopia de UV-Vis.
    1. Tomar 3 mL da amostra concentrada RBMB e misturar com 117 DPBS ul em um tubo de microcentrífuga.
    2. Em branco o espectrofotômetro com DPBS e medir a absorvância 200-800 nm. Nota: Pico se as absorvâncias a 260 nm e 650 nm deve ser visível.
    3. Calcular a concentração do estoque RBMB hibridado com base na absorvância a 650 nm, utilizando a equação:
      Da concentração (M) = 650 * Um factor de diluição / coeficiente extinta 650 onde A é a absorvância a 650 nm, o factor de diluição é de 40.
      Nota: O coeficiente de extinção a 650 nm para CF640R é 103.000 e o coeficiente de extinção para Iowa Preto RQ é ~ 20.000. Os coeficientes de extinção são aditivas e não são sensíveis à hibridização. Portanto, a amostra de estoque RBMB tem um coeficiente de extinção combinada de approximately 123 mil a 650 nm.
  9. Rotular o tubo de forma adequada com o nome e concentração e armazenar a -20 ° C para uso futuro.

2: Preparação de poli-d-lisina de 8 poços revestidos ALOJADO lamela

  1. Prepara-se uma solução de 0,2 mg / ml de poli-D-lisina por dissolução de 5 mg de poli-D-lisina (pó liofilizado, g-irradiado) em 25 ml de água esterilizada em ambiente estéril.
  2. Adicionar 200 ul da / ml de solução de poli-D-lisina a 0,2 mg a cada poço de uma lamela 8 poços compartimentado, em um ambiente estéril.
  3. Incubar à temperatura ambiente durante 16-18 horas na capa de cultura de células.
  4. Aspirar a Poli-D-lisina e lavar bem a 3 vezes com água destilada estéril. Nota: As lâminas com câmara revestidas podem ser armazenadas a 4 ° C.

3. Probe Entrega

Nota: O sistema celular utilizado deve conter uma construção de um gene que expressa ARN integrado com, pelo menos, 4-sequencial ligaming sítios para a RBMB na região 3 'não-traduzida (UTR). O alvo deve ser complementar à linha do RBMB. Aconselha-se que, como um controlo negativo, a mesma linha de células ser manipulada para expressar a mesma construção do gene, mas sem as repetições em tandem. Neste protocolo, uma linha de células de fibrossarcoma humano, HT1080, foi manipulada para expressar a GFP de ARN com 96 repetições em tandem da sequência alvo RBMB na 3'-UTR. A linha de células de controlo foi concebido para expressar a GFP de ARN de tipo selvagem.

  1. Células da placa em um frasco de T25 a 40-50% de confluência um dia antes da entrega da sonda. Cultura das células com meio DMEM suplementado com 1% de pen / strep e 10% de soro fetal bovino (FBS), e incuba-se a 37 ° C com 5% de CO 2.
  2. No dia seguinte, ligue o microporos e configurar os parâmetros de formação de microporos para 950 V, 2 pulsos, 25 ms. Nota: Estes parâmetros foram otimizados para as células HT1080, mas eles são do tipo celular dependente e pode ser adjusted para outros tipos de células, tal como descrito nas instruções do fabricante.
  3. Encha o tubo de microporos com 4 ml de tampão eletrolítico e colocá-lo na estação de formação de microporos.
  4. Retire a amostra estoque de RBMB purificado e descongelar. Diluir vários microlitros para uma concentração final de 12 uM com tampão de fosfato de 1x. 1 ml é necessária para cada formação de microporos.
  5. Pipete 1 mL de meio de cultura com FBS, mas sem antibióticos para um tubo de microcentrífuga. Nota: Este será usado para suspender as células imediatamente depois de microporos e pode ser posta de lado, perto do dispositivo de formação de microporos, por enquanto. A inclusão de antibióticos no meio de cultura diminui a viabilidade celular após a formação de microporos.
  6. Remover o meio de cultura celular das células HT1080 modificadas (60-80% confluentes), lavar as células com 1 ml de Ca 2 + e Mg 2 + DPBS -free uma vez, e incuba-se com 1 ml de tripsina durante 1-2 min.
  7. Pare o trypsinization adicionando 1 ml de meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino sem antibióticos, e vermelho de fenol, e transferência das células para dois tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
  8. Girar as células no tubo de microcentrífuga a 200 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender combinar as pelotas de células, num volume final de 1 ml de DPBS.
  9. Tomar 10 ul a partir da suspensão de células, bem misturada, e contar as células.
  10. Pipeta as células para cima e para baixo várias vezes para se certificar de que eles estão bem dispersas e transferir 300 mil células com DPBS em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e girar a 200 xg por 5 min.
  11. Retirar o sobrenadante, tendo o cuidado para não perturbar o sedimento celular. Ressuspender o sedimento em tampão de ressuspensão e 11 ul pipeta cima e para baixo várias vezes, para assegurar que as células são bem dispersa. Cuidado para não gerar eventuais bolhas de ar. Nota: As bolhas de ar fará com que uma faísca durante a formação de microporos e resultar em má entrega RBMB e morte celular.
  12. Adicionar 1 mL do RBMB diluído (12 mM) e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo várias vezes. Novamente tome cuidado para não gerar as bolhas de ar.
  13. Aspirar 10 ul da mistura de células RBMB, utilizando a pipeta de formação de microporos, e inserir a pipeta dentro do tubo de formação de microporos. Pressione o botão Iniciar para iniciar a formação de microporos. Nota: Não deve haver bolhas de ar visíveis na ponta.
  14. Quando o ecrã do microporos mostra conclusão, remover a pipeta da estação, expelir a mistura de 10 uL para dentro do tubo de microcentrífuga que foi preparado anteriormente, com 1 ml de meio de cultura com FBS, mas sem antibióticos. Misture delicadamente balançando os tubos de lado-a-lado várias vezes.
  15. Rodar as células a 200 xg durante 5 min e lava-se as células mais duas vezes, em 1 ml de meio de cultura sem fenol vermelho com FBS, mas sem antibióticos, para remover quaisquer RBMBs que não foram transferidos para as células. Ressuspender com 400 mL de meio de cultura de fenol vermelho livre com FBS, mas semantibióticos.
  16. Placa as células microporated para a poli-D-lisina revestido lamela 8 poços compartimentado em 200 ul por poço ou na confluência desejado.
  17. Opcional: Se for desejável a imagem do núcleo, adicionar Hoescht 33342 para as células a uma concentração final de 0,01 mg / ml.
  18. Coloque as câmaras lamela numa incubadora de cultura de células. Incubar as células durante 1-2 horas antes da imagem, de modo que as células tenham tempo suficiente para assentar sobre a superfície da lamela. Nota: Imagem pode ser realizada assim que 30 min pós-formação de microporos.

4. Image Acquisition

  1. Ligar o sistema de fase celular de incubação superior ao vivo e equilibrar até que atinja 37 ° C, 5% de CO 2, e 75% de humidade.
  2. Ligue a fonte de luz do microscópio e fluorescente e abrir o software Metamorph. Nota: Outros pacotes de software similares para controle de microscópio e de aquisição de imagem também pode ser usado.
  3. Aplique óleo Immersol aoobjectivo.
  4. Transfira a lamela câmaras com células microporated ao estágio de células do sistema superior de incubação ao vivo. Incubar a fase superior do sistema até que a temperatura e os níveis de CO2 estão estabilizados.
  5. Abra a guia Adquirir, em software Metamorph. Clique no botão Show Live para encontrar o campo, ajustar o foco de luz branca e clique no botão Parar ao vivo.
  6. Sob a guia Adquirir, clique e abrir o botão pop-up aquisição fluxo, e configurar os parâmetros de aquisição filme desejado. Adquirir 150 quadros usando o filtro Cy5 / CF640R e salvar as imagens para o disco rígido.

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Representative Results

Pouco tempo após a formação de microporos de células HT1080 na presença de RBMBs, os transcritos de ARN individuais que foram modificados para conter vários locais de ligação RBMB no seu 3'-UTR aparecem como manchas fluorescentes brilhantes quando visualizados por microscopia de fluorescência de todo o campo (Figura 2). Enquanto transcrições de RNA individuais com sítios de ligação de apenas quatro RBMB podem ser visualizados em células vivas, mais sites na 3'-UTR obrigatório RBMB, o sinal fluorescente forte. Além disso, os mais RBMBs que são vinculados a cada transcrição quanto maior o RNA pode ser visualizado antes do sinal é perdido devido à fotodegradação. Neste protocolo, o ARN foi modificado para conter repetições de 96 em tandem da sequência alvo RBMB na 3'-UTR. A aquisição de streaming de imagens permite transcrições de RNA individuais a ser trabalhada em tempo real (Filme 1). Transcrições de RNA individuais podem ser facilmente vistos se movendo dentro do citoplasma e núcleo of as células. Enquanto a maioria dos pontos parece sofrer movimentos browniano ou sub-difusivos, em casos raros, uma RNA passando por transporte dirigido será observado (Filme 2). Teses transcrições de RNA normalmente movem-se rapidamente ao longo de um caminho reto (Figura 3); no entanto, alguns RNA seguem caminhos curvos ou fazer alterações bruscas de direção. Esses movimentos estão em nítido contraste com os movimentos browniano, que são de natureza aleatória e apresentam pequenos deslocamentos globais dentro dos prazos curtos adquiridos aqui (ou seja <1 min). Os movimentos de ARN dirigidas são consistentes com o transporte de ARN ao longo dos microtúbulos e microfilamentos. Estas experiências indicam que RBMBs fornecer uma ferramenta versátil e robusto para imagiologia de transcritos de ARN individuais em células vivas.

Figura 1
Figura1. Esquema de RBMBs e as metodologias de imagem utilizado transcritos de ARN individuais em células vivas. UM) RBMBs na presença e na ausência do ARN alvo complementar. Na ausência ou RNA alvo, RBMB fluorescência se apaga. Na presença de RNA alvo, RBMB fluorescência é restaurada. B) Múltiplas RBMBs vincular cada RNA transcrito a criação de uma mancha fluorescente brilhante que pode ser detectado por microscopia de fluorescência de campo amplo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2 Imagem representativa de células HT1080 expressando estavelmente RNA com A) repete de 96 em tandem, ou b) se repete de 4 em tandem do sítio de ligação do RBMB ema 3'-UTR, após a entrega intracelular de RBMBs. A presença de repetições de 96 em tandem permite que os transcritos de ARN individuais aparecem como manchas brilhantes, fluorescentes. ARN contendo apenas repetições em tandem de 4 também pode ser visualizada, mas a intensidade das manchas fluorescentes é muito fraca e frequentemente só podem ser detectados em zonas de excepcionalmente baixo fundo. O pequeno número de pontos brilhantes em particular corresponde ao RNA que não está em movimento. Barra de escala:. 10 m Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3 Montagem de um transcrito de ARN dirigida submetidas transporte. A trajetória da transcrição é mostrada na mais à esquerda do painel. A trajetória é sobreposto sobre um único frame da série histórica. Barra de escala:. 2,5 um por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme 1. filme representativas de células HT1080, expressando estavelmente ARN com repetições em tandem de 96-o sítio de ligação RBMB na 3'-UTR, após a entrega intracelular de RBMBs. Transcrições de RNA individuais aparecem manchas fluorescentes como brilhantes. Barra de escala:. 10 m Clique aqui para ver o vídeo.

Filme 2. filme representativo de uma transcrição do RNA passando por transporte indicado. Barra de escala:. 10 m Clique aqui para ver o vídeo.

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Discussion

A capacidade de imagens simples transcritos de ARN modificadas em células vivas utilizando um microscópio de campo amplo convencional requer um sinal fluorescente brilhante e fotoestáveis ​​para ser associado com cada transcrição de ARN e um fundo de fluorescência que emana de baixo sondas fluorescentes não ligados. Neste método, um sinal fluorescente brilhante é conseguida por hibridação múltipla (até 96) à base de sondas fluorescentes de oligonucleótidos, ou seja RBMBs, para cada transcrição de ARN. Contudo, apenas quatro sítios de ligações 16 são suficientes. Os sinais coletivas resultar em uma mancha fluorescente brilhante que pode rastreadas em tempo real. A presença de múltiplas sondas também permite tempos de imagem mais longos, uma vez que uma fracção substancial dos corantes fluorescentes deve ser Foto-descoloração antes do sinal colectivo é perdida. Prevê-se que esta técnica vai proporcionar uma visão única na biologia de ARN e permitem o estudo de uma grande variedade de comportamentos de ARN que varia de medição the resposta do tráfico de RNA a vários estímulos externos, observando os padrões de localização subcelular únicas de RNA alvo, estudando o destino eo tempo de vida de RNA, e fornecendo informações sobre regulamentação RNA. Além disso, pode ser possível controlar as alterações (por exemplo, para cima e para baixo-regulação) na expressão de ARN. Embora esta capacidade não foi ainda validado, mostrámos previamente que número de cópias de ARN pode ser quantificada de forma bastante exacta para até 24 horas em 22 células vivas. Além disso, RBMBs não parecem afetar o nível de expressão do gene. Combinados, estes resultados fornecem evidência inicial de que as alterações na expressão do gene ao longo deste período de tempo foram rastreados com precisão, numa base de célula-por-célula, e que RBMBs não levou a um aumento da estabilidade de ARN ou retardou a degradação de RNA. No entanto, não é claro até que ponto a expressão do gene alterado, na verdade, durante este tempo, se de todo.

Em geral, éespera-se que qualquer aumento na expressão do gene seriam facilmente identificados; devido à abundância de RBMB desacoplado na célula que está livre para se ligar transcritos recém-formados. No entanto, o que é menos claro é como RBMBs dissociar da RNA durante a tradução e degradação e, se houver algum atraso entre a expressão de RNA / degradação ea imagem dessas transcrições. Estudos adicionais ainda são necessários para entender melhor desempenho RBMB nestes cenários.

Várias abordagens alternativas à imagem transcrições de RNA têm sido relatados anteriormente. Os primeiros estudos envolveram fluorescently rotulando transcrições de RNA isoladas e de reintrodução dessas transcrições em células, tipicamente por microinjeção 23,24. O sinal-para-fundo desta abordagem é muito elevada, devido à capacidade para remover todos os corantes fluorescentes não ligados, mas existem preocupações sobre se o comportamento observado ARN representa tru precisãoe o processamento do ARN. A solução mais comum para esta dificuldade envolveu transgenes de engenharia, com repetições em tandem no 3'-UTR que podem ser vinculados por um repórter fluorescente, análoga à abordagem RBMB aqui apresentada. Repórteres fluorescentes anteriores incluíram moléculas pequenas que só apresentam fluorescência em cima de aptâmeros de RNA, comumente referido como espinafre 25, e GFP obrigatório. Espinafre ainda não tem sido utilizada para imagiologia transcritos de RNA, mas tem sido utilizado para a imagem de expressão global. Em contraste, a GFP tem sido usado com sucesso para a imagem transcritos de RNA. Nesta abordagem, um repórter GFP é fundido com a proteína de revestimento do fago MS2 bacteriana (GFP-MS2) e liga-se a um RNA de engenharia construir com repetições em série de local de ligação MS2 na 3'-UTR 2,10. Enquanto esta abordagem é muito semelhante à abordagem aqui descrita, RBMBs oferecem várias vantagens. Por exemplo, RBMBs permitir fluoróforos orgânicos a serem utilizados para a imagiologia, o que proporciona uma mais ampla diversity de opções com fotoestabilidade superior e brilho superior em comparação com as proteínas fluorescentes. Além disso, há muitos fluoróforos orgânicos comerciais que emitem no extremo ao infravermelho próximo. A vantagem de escolher corantes com espectros de emissão vermelha-deslocado deriva da autofluorescência celular inferior observada nestes comprimentos de onda. Desde altos níveis de autofluorescência pode facilmente abafar quaisquer sinais fluorescentes associados ao RNA hibridização, a capacidade de reduzir drasticamente autofluorescência fornece um impulso importante na relação sinal-fundo. Outra vantagem importante da utilização de RBMBs é que o sinal a partir de sondas não ligadas é significativamente extinta. Embora, várias abordagens têm sido tomadas para reduzir a fluorescência da GFP independente na abordagem GFP-MS2, por exemplo, o uso de sinais de localização nuclear fundo, controlando os níveis de expressão GFP, e dividir GFP complementação 1,10,11,26,27, o presença de uma moie de têmpera realty dentro do projeto RBMB proporciona aos usuários maior flexibilidade experimental. Por exemplo, a abordagem RBMB é relativamente insensível a ambos o nível relativo de expressão total e ARN e concentração da sonda. De facto, os transcritos individuais pode ser trabalhada com concentrações RBMB que se estendem de uma ordem de magnitude. As vantagens combinadas de maior fotoestabilidade, sinal brilhante, e menor nível de fazer em tempo real experimentos com imagens RNA com RBMBs muito mais acessíveis para usuários de microscopia, com experiência limitada.

Talvez o mais notável desvantagem da utilização de sondas de exógenos, tais como RBMBs, em contraste com um repórter molecular tal como GFP, é a necessidade para entrega intracelular. Felizmente, uma série de opções existem, por exemplo, a microinjeção 28, os agentes de transfecção 29, peptídeos penetradores de células 30 e estreptolisina O (SLO) 31. Pessoalmente, nós descobrimos que é de formação de microporosa opção amigável e versátil mais usuário, geralmente resultando em> 95% de viabilidade e eficiência de entrega 21. Isto é provavelmente porque o processo de electroporação microlitro volume apresenta uma redução nos diversos eventos nocivos, muitas vezes relacionados com a electroporação, incluindo a geração de calor, a dissolução de iões de metal, a variação do pH e a formação de óxido. É importante notar que é também susceptível de formação de microporos para estudos de alta produtividade, uma vez que RBMBs pode ser entregue em> 100.000 células numa única experiência.

Apesar das muitas vantagens de usar RBMBs a localização RNA imagem e movimento em células vivas, uma série de limitações e desafios ainda permanecem. Talvez, o maior desafio é a incapacidade de controlar o ARN por mais de alguns minutos, com exposição contínua. Esta é uma consequência de ambos fotodegradação ea capacidade de RNA para sair do plano de imagem focal. Corantes mais brilhante e mais fotoestáveis ​​pode ajudar alleviate ambas estas deficiências, pelo aumento do número de vezes que cada corante pode ser animado e permitindo que as manchas fluorescentes discretos a ser trabalhada a distâncias maiores a partir do plano focal. Uma abordagem promissora para aumentar fotoestabilidade envolve o uso de corantes de auto-cura, que utilizam trio de estado quenchers em proximidade com o fluoróforo orgânico para estender seu tempo de vida 32. Outra opção pode ser a utilização de amplificação polímeros conjugados fluorescentes, que são compostas de um grande número de fluoróforos ligados que não fazem auto-arrefecimento rápido. Estes polímeros podem ser muitas vezes mais brilhante do que os fluoróforos orgânicos individuais e ainda ser eficiente extinta por uma única porção de têmpera 33,34; no entanto, o trabalho adicional nesta área ainda é necessária. Deve-se notar que a imagem intermitente, com uma taxa de fotogramas> 1 imagem por segundo, não pode ser realizada de uma única imagem de transcrito de ARN por longos períodos de tempo, porque é difícil de assegurar que é tele mesmo RNA transcrito sendo monitorado a partir de quadro-a-quadro. Naturalmente, a avaliação quantitativa da expressão do gene ao nível da célula individual é ainda possível mais longos intervalos de tempo, por meio da contagem de pontos fluorescentes individuais numa base por célula 16,35,36. Neste caso, não é necessário para manter o controle de transcrições individuais. Em geral, acredita-se que RBMBs são capazes de fornecer informação importante sobre a função de RNA e permite que a imagem de transcrições de RNA projetados com equipamento de microscopia convencional e conhecimentos limitados.

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Disclosures

Dr. Mark Behlke e Dr. Ling Huang são empregados pelo IDT, que oferece oligonucleotídeos para venda semelhante a alguns dos compostos descritos no manuscrito. IDT é, no entanto, não é uma empresa de capital aberto e que, pessoalmente, não possui quaisquer acções / equidade na IDT.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela Fundação Ciência CARREIRA Prêmio Nacional (0953583) e do Instituto Nacional de Saúde NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nuclease-free water Life Technologies AM9932 no DEPC-treated
DPBS Life Technologies 14190-144 No Ca2+ and Mg2+
Cary 100 UV-Vis spectrophotometer Agilent Technologies
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific P284-500
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific S381-500
Microcentrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 ml
Chromatography column Kimble Chase Life Science 420400-0720 0.7 x 20 cm
Superdex 75 prep grade GE healthcare 17-1044-01
Syringe pump Braintree Scientific BS-300
Syringe BD 301035 60 ml, Luer-lok tip
Centrifugal filter units Millipore UFC501096 MW 10,000 cutoff
Centrifuge 5418 Eppendorf
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P7280-5MG lyophilized powder, g-irradiated
8-well chambered coverglass Fisher Scientific 155409 Working volume 0.2-0.5 ml
HT1080 ATCC CCL-121 Human Fibrosarcoma cell line
Cell culture flask Corning 430639 25 cm2
DMEM Life Technologies 11965084 High glucose
DMEM without phenol red Life Technologies 21063029 High glucose
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442-500ML
Penecillin/streptomycin Life Technologies 15140122
Trypsin Life Technologies 25300054 0.05% Trypsin-EDTA
Neon transfection system Life Technologies MPK5000
Neon transfection system kit Life Technologies MPK1096
Hemacytometer Fisher Scientific 02-671-10
Hoescht 33342 Life Technologies H1399
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus
SOLA light engine Lumencor
Metamorph Molecular Devices Software controlling microscope
Immersol oil 518F Fisher Scientific 12-624-66B

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References

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