خطوة أبعد بريت: الإسفار عن طريق الإثارة غير منضم من التلألؤ (FUEL)

1Plate-Forme d'Imagerie Dynamique, Imagopole, Institut Pasteur, 2Department of Radiation Oncology, Stanford School of Medicine, 3Service Hospitalier Frédéric Joliot, Institut d'Imagerie Biomédicale, 4Vanderbilt School of Medicine, 5The Walter & Eliza Hall Institute of Medical Research, 6Unité INSERM U786, Institut Pasteur, 7Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Institut Pasteur
Published 5/23/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

توسيع المؤسسة وتطبيق الإسفار عن طريق الإثارة غير منضم من التلألؤ (FUEL) من خلال المسح إلى المبادئ ذات الصلة ومما يدل على توافقه مع العديد من fluorophores وظروف استهداف الأجسام المضادة.

Cite this Article

Copy Citation

Dragavon, J., Sinow, C., Holland, A. D., Rekiki, A., Theodorou, I., Samson, C., et al. A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL). J. Vis. Exp. (87), e51549, doi:10.3791/51549 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

مضان من قبل غير منضم الإثارة من التلألؤ (FUEL) هو عملية الإثارة الانبعاثات الإشعاعية التي تنتج زيادة إشارة وتعزيز التباين في التجارب المختبرية والحية. أسهم FUEL الكثير من نفس المبادئ الأساسية كما نقل الطاقة الرنين ضوء بارد (بريت)، ولكن يختلف كثيرا في العمل لمسافات مقبولة بين مصدر الانارة والكيان الفلورسنت. بينما بريت تقتصر على نحو فعال إلى حد أقصى قدره 2 مرات في دائرة نصف قطرها فورستر، عادة أقل من 14 نانومتر، ويمكن أن يحدث FUEL على مسافات تصل الى ميكرون أو حتى سم في حالة عدم وجود امتصاص البصرية. نحن هنا على اساس توسيع وتطبيق FUEL من خلال استعراض المبادئ ذات الصلة وراء هذه الظاهرة وإظهار توافقه مع مجموعة واسعة من fluorophores والنانوية الفلورسنت. أبعد من ذلك، هو استكشاف جدوى استهداف الأجسام المضادة FUEL. الأمثلة المعروضة هنا تقدم دليلا على أن وقود يمكن استخدامها لتطبيق ورقةications حيث بريت غير ممكن، وملء الفراغ المكاني القائم بين بريت والتصوير الحيوان كله التقليدية.

Introduction

التعديل الجيني للكائنات، مثل الفيروسات 1، 2، 3 البكتيريا، أو الثدييات الصغيرة 4 إلى إما لحث أو تلألؤ بيولوجي صريحة جوهري، كان ناجحا للغاية وأظهر على نطاق واسع 5-7. تلألؤ بيولوجي، رد فعل في الجسم الحي chemiluminescent تنطوي على الكواشف التي تحدث بشكل طبيعي، لديه ميزة إنتاج الضوء دون الحاجة إلى مصدر ضوء خارجي. على هذا النحو، لا تعاني التصوير إضاءة الحيوية من العيوب شيوعا من السيارات وغير محددة وجدت إشارة من مضان التصوير 8. بالتالي، تلألؤ بيولوجي لديها نسبة كبيرة إشارة إلى الضوضاء لأن أي إشارة الكشف عن تنبع فقط من مصدر المقصود. بينما العديد من النماذج استغلت الاوبرون لوكس من luminescens Photorhabdus (الحد الأقصى الانبعاثات تركزت بين 480 و 490 نانومتر) لفي المختبر والمجراة في التطبيقات واستخدامه في مام الصغيرةوكان المرض إشكالية نظرا لطبيعة الظروف التصوير؛ وجود السائد من امتصاص البصرية، مثل الهيموجلوبين، وكلاء نثر، مثل الأنسجة والعظام، وتؤثر بقوة الأزرق لموجات الأصفر 3. تعبير عن يراعة luciferase هندسيا (الحد الأقصى للانبعاثات في 617nm) تم تطويره مؤخرا وأدرجت، وتوفير الأداة التي يتغلب بشكل كبير امتصاص البصرية 10، ولكن لا تزال تخضع لنثر الآثار.

ردا على ذلك، كانت هناك محاولات متعددة لتحويل الحمراء المنبعثة إشارة إلى إطار بصري المطلوب من 650-900 نانومتر، وهي منطقة من امتصاص التقليل والتشرذم، وذلك باستخدام الرنين تلألؤ بيولوجي نقل الطاقة (بريت) 11-13. كأداة لتعزيز الكشف عن إشارة، بريت، والذي يستخدم مصدرا للإضاءة الحيوية مثل المانحة وأضاف fluorophore كما متقبل، وقد وجدت نجاحا محدودا. كمثال المنوية من هذه الظاهرة "، أو النقاط الكم إلقاء الضوء على النفس4؛ (SIQDs) 14 تتكون من تعديل Renilla كلوية الشكل luciferases منضمة إلى طبقة البوليمر يسين الخارجية نقاط الكم المتاحة تجاريا (QDS). بالإضافة إلى ذلك على الركيزة، فإن رد الفعل للإضاءة الحيوية الناتجة يدفع الانبعاثات مضان من QDS، وتوليد إنتاج كبير من الفوتونات الحمراء. ومع ذلك، فإن هذه SIQDs تقتصر على تطبيق التصور في الجسم الحي من الأحداث ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. ومن المرجح نظرا لصعوبة ربط التحقيق المزدوج إلى الجهاز، الخلية أو الجينات في المصالح، لأن SIQDs لا يمكن ترميز وراثيا وبالتالي يتطلب تعديل الثانوية للقذيفة البوليمر هذا محدودة التطبيق. لتحسين قابليتها للتطبيق، SIQDs البديلة، حيث لا بد من luciferases مباشرة إلى جوهر الانارة، وقد تم مؤخرا توظيف 15. بناء الخروج من مفهوم SIQD، تم التوصل إلى نظام بريت أكثر قابلية للتطبيق عن طريق ربط Cypridina luciferase المراسل إلى فيdocyanine صبغ 16، والتي كانت قادرة على استهداف تحديدا الاورام في الفئران بينما تنتج تحولا حمراء كبيرة من 460 نانومتر إلى 675 نانومتر. للخضوع لنقل الطاقة غير الإشعاعية، بريت يتبع نفس القيود الأولية مثل نظيرتها الفلورسنت: يجب أن يكون هناك تداخل الطيفية القوية بين الانبعاثات المانحة ومتقبل أطياف الإثارة والمسافة العمل بين الأنصاف اثنين يجب أن يكون بناء على أمر من فورستر دائرة نصف قطرها (5-14 نانومتر اعتمادا على الزوج المانحين متقبل، مع أقصى مسافة الفعال لضعف نصف قطر فورستر 17). هذا الاعتماد مسافة يحد كثيرا من أنواع الأحداث التي يمكن ملاحظتها باستخدام بريت كوسيلة لتعزيز الكشف.

مؤخرا تم تحديد نهج جديد وتظاهر تحت حد سواء في المختبر وفي ظروف الجسم الحي. بناء قبالة أساس بريت، الإسفار عن طريق الإثارة غير منضم من التلألؤ (FUEL) 18، 19 القولونية إضاءة الحيوية معربا عن الاوبرون لوكس وQDS 18، 19. بينما مماثلة تجريبيا لSIQDs، والفرق الأساسي موجود: في FUEL، فإنه ليس من الضروري لمصدر الانارة ليكون جسديا منضمة إلى fluorophore، والذي يسمح للص الترميز الوراثي لجنة التحقيق الانارة. ويرجع ذلك إلى الكشف الناجح لFUEL بين البكتيريا الانارة وQDS، فمن الممكن أن هذه التقنية يمكن تطبيقها على كلا سطحي (الجلد) والأنسجة العميقة (الرئة، الكبد) مثل التهابات المكورات العنقودية الذهبية وKlebsiellia الرئوية.

منذ تقرير أهميتها التجريبية، تطورت لتشمل FUEL نموذج رياضي قوي 20 التي يمكن استخدامها للتنبؤ الانارة مقبولة وأزواج الفلورسنت، وتوسعت لتشمل تطبيقاتها استخدامها في تحديد خصائص photophysical مثل العائد الكم. وصفنا أدناه بعض التقنيات الأساسية من الوقود. الأولى، وتبين لنا الدليل على هذه الظاهرة على حد سواء قصيرة (ميكرون) والطويلة (سم) المسافات العمل، والذي يميز جوهريا FUEL من بريت. الثانية، ونوسع على أزواج FUEL ممكن من خلال دراسة مجموعة واسعة من fluorophores والنانوية الفلورسنت. حجابهند، ويتم التحقيق تطبيقات FUEL بمقارنة أزواج FUEL المستهدفة وغير المستهدفة.

Protocol

1. الكواشف

  1. شراء أو تطوير البكتيريا الانارة وسائل الإعلام والثقافة المناسبة مثل تعديل القولونية التعبير عن ABCDE لوكس 21، الضمة fischeri، اللميعة س. الكلبسيلة الرئوية 22.
  2. إعداد المالحة الفسيولوجية (0.9٪ كلوريد الصوديوم) والحلول سائل الإعلام والثقافة وفقا لصفات القياسية. E. القولونية وK. كانت تزرع في لوريا BERTANI الرئوية (LB) عند 37 درجة مئوية، وV. fischeri واللميعة س في LB تستكمل مع 0.5 M كلوريد الصوديوم في 22 درجة مئوية.
  3. شراء أو الاستحواذ على تحقيقات الفلورسنت مثل Q-705 تعقب (40 نانومتر قطر، ويشار إلى QD705)، Q-800 تعقب (40 نانومتر قطر، ويشار إلى QD800)، فلوري (40 نانومتر قطر) والمجهرية البوليسترين غير الفلورسنت ( 48 قطرها نانومتر)، والأصباغ الفلورية التقليدية.
  4. إعداد الكواشف اللازمة لوضع العلامات البكتيرية.
  5. ضمان الوصول إلىككل تصوير تلألؤ بيولوجي الحيوان، مثل الطيف IVIS، التي هي قادرة على الكشف عن إشارة تحت مجموعة واسعة من الأطوال الموجية الانبعاثات ومرات التعرض. وهناك قارئ لوحة قادرة على قياسات تلألؤ بيولوجي تكفي لمعظم التجارب الموصوفة هنا.

2. خلاصة أساسية FUEL

  1. بدءا من المستعمرات الفردية على لوحات ثقافة القياسية، بدء الثقافات بين عشية وضحاها من البكتيريا الانارة. هنا، V. واستخدمت fischeri.
  2. اليوم من التجريب، والشروع في ثقافات فرعية جديدة، والسماح لهم للتقدم حتى يتحقق على OD 600 من 1-1.5. من أجل تحقيق نتائج قابلة للمقارنة فمن الأفضل لاستخدام البكتيريا في نمو مماثل في الدول التي تنتج إشارات مكثفة. هذا لا يمكن ضمانه عن طريق الحفاظ على OD 600 ثابتة.
  3. الجمع بين aliquots من 100 ميكرولتر من كل سواء مع 5 ميكرولتر من QD705 أو المالحة الفسيولوجية (PS)، ثم قم بإضافة إلى 895 ميكرولتر من PS إلى standacuvettes الثالثة الطيفية. ضع cuvettes شغل في الطيف IVIS وتأخذ القياسات تحت مجموعات التصفية المناسبة. هنا، تم استخدام تصفية الانبعاثات 710-730 نانومتر.

3. FUEL أكثر متفاوتة المسافات

  1. ملء اثنين من انخفاض حجم (1 مل) cuvettes الضوئية البلاستيكية التي تحتوي على إما 50 ميكرولتر من QD705 أو 97.2 ميكرولتر من غير الفلورسنت 48 نانومتر المجهرية البوليسترين في إجمالي حجم 1 مل PS. وهذا يضمن مساحة مماثلة الصلبة في الحجم الكلي بين الكيانين.
  2. إعداد كفيت مصدر الضوء عن طريق التغليف كوفيت الثالث مع الشريط الأسود القياسي أو بعض المواد الأخرى مبهمة قادرة على حجب الضوء. إعداد بعناية نافذتين البصرية متطابقة على طرفي نقيض من كفيت.
  3. ضع cuvettes شغل في السابق مباشرة على جانبي كفيت مصدر الضوء. إضافة قسامة 1 مل من V. ثقافة fischeri أو غيرها (أي كولاي أو الانارة اللميعة قع) من ثقافة فرعية جديدة في كفيت مصدر الضوء، وتغطية ذلك مع مادة مبهمة، مثل ورقة سوداء للحد من أي تلوث الضوء.
  4. تصور cuvettes الثلاث في إطار المرشحات الانبعاثات المناسبة مثل ضوء إجمالي و710-730 المرشحات الانبعاثات نانومتر، مع أوقات التعرض لل10، 30، و 30 ثانية، على التوالي.
  5. إعادة كلا cuvettes الخارجية على مسافات أبعد ما يعادلها من كفيت المركزية، ومن ثم تصور مرة أخرى. كرر حتى يتم التوصل إلى مسافة النهائي وجها لوجه (المركزي إلى انخفاض حجم كفيت) من 3CM. في كل خطوة، والحصول على صورة مضان (450-480 نانومتر الإثارة، 710-730 الانبعاثات نانومتر) للتحقق من صحة موقع QD705.

4. التحقيق أزواج FUEL المحتملة

  1. ملء اثنين من خفض حجم cuvettes مع 1 مل تحتوي على حلول إما fluorophore أو جسيمات متناهية الصغر الفلورسنت من الفائدة في واحد، وPS أو PS مع الجسيمات النانوية غير الفلورسنت مثل سيطرة سلبية في الآخر. في الأظهرت أعمال الإلكترونية هنا، تم التحقيق في مجموعة متنوعة من إمكانات fluorophores FUEL المتاحة تجاريا والنانوية الفلورسنت على النحو المبين في الجدول 1.
  2. إضافة قسامة 1 مل من V. جديدة fischeri أو البكتيريا الانارة أخرى إلى كفيت ثالث ظلام دامس تحتوي على نافذتين الضوئية تساوي جسديا تقع على طرفي نقيض. تغطية كفيت مع مادة مبهمة مثل قطعة من الورق الأسود.
  3. في مكان بعد مسافة قصيرة ولكن على قدم المساواة انخفاض اثنين من حجم cuvettes على جانبي كفيت-ظلام دامس وتصور تحت الفلاتر المناسبة. هنا، تم استخدام مسافة 0.7 سم. أكرر مع fluorophores الأخرى.

5. FUEL المستهدفة

  1. إعداد الأجسام المضادة البيروكسيديز محددة للبكتيريا الانارة. على سبيل المثال، الأجسام المضادة الأولية هنا محددة لK. تم المعقدة البيروكسيديز الرئوية (α-كيمبرلي) باستخدام محلول يحتوي على EZ-رابط سلفو-NHS-LC-البيوتين. إزالة كاشف الزائدة من الأجسام المضادة باستخدام الأعمدة تحلية تحت الطرد المركزي (1،500 x ج) لمدة 2 دقيقة.
  2. استخدام برادفورد مقايسة القياسية لتحديد تركيز البروتين وتحديد درجة الضد biotinylation بواسطة HABA الفحص.
  3. الحصول على الضد البيروكسيديز α-KP-بيو (أب) دفعات عن طريق خلط 100 ميكرولتر (10 ملي، وحلت في برنامج تلفزيوني 1X) مع 40 ميكرولتر α-كيمبرلي الأجسام المضادة، مما أدى إلى درجة النهائي إحلال 16 بقايا البيوتين في أب والنهائي تركيز البروتين من 10 ملغ مل -1.
  4. باستخدام متعددة الثقافات بين عشية وضحاها تكرار، تستهدف البكتيريا غسلها مع الأجسام المضادة المذكورة آنفا التالية البروتوكول المناسب.
    1. على وجه التحديد، وغسل K. الرئوية في برنامج تلفزيوني 1X، وresuspend في برنامج تلفزيوني 1X إلى OD من 4 (حوالي 4 × 10 8 كفو مل -1 OD -1).
    2. لكل تكرار، واحتضان 100 ميكرولتر PBS، α -الأجسام المضادة KP (10 ميكرولتر α-KP-biotB أو 10 ميكرولتر PBS للتحكم)، و 100 ميكرولتر الخلايا لمدة 90 دقيقة في 30 درجة مئوية. غسل الخلايا ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1X، وresuspend في 196 ميكرولتر PBS.
  5. تسمية الخلايا مع المكورات QD705 streptavidin وتقسيمها إلى مجلدين ما يعادلها.
  6. يغسل حل واحد ثلاث مرات وresuspend ثم فإنه في حجم مناسب.
  7. توزيع 100 ميكرولتر من الحلول غسلها وغير مغسولة في الآبار الفردية للأسود لوحة 96 جيدا. قياس التلألؤ الناتجة تحت الضوء إجمالي، 490-510 نانومتر، والمرشحات 710-730 نانومتر. يمكن تحديد تركيز Fluorophore باستخدام 450-480 نانومتر الإثارة وانبعاث 710-730 نانومتر.

Representative Results

نقل الطاقة الرنين (RET) هو التفاعل غير الإشعاعي بين المانحين الانارة ومتقبل الفلورسنت، حيث الطاقة من المانحين خرجت قادر على إحداث استجابة مضان من متقبل من خلال التفاعل ثنائي القطب، ثنائي القطب قوية 13. RET، والتي تم وصفها باستخدام الفلورسنت 23، chemiluminescent 24، وإضاءة الحيوية 13 جهة مانحة، يتطلب أساسا: 1 التداخل الطيفي قوية بين الانبعاثات المانحة والقابل الإثارة أطياف؛ 2 المحاذاة المناسبة التناوب بين الكيانين؛ و3. مسافة عمل لا يزيد عن 0.5 إلى 2 مرات في دائرة نصف قطرها فورستر، R بين المانحين ومتقبل 17. المتناقضة مع RET، يحدث عندما FUEL مصدر الانارة، مثل البكتيريا للإضاءة الحيوية، تنبعث من الفوتون التي يتم امتصاصها وإعادة المنبعثة من قبل كيان الثانية، مثل fluorophore أو جسيمات متناهية الصغر الفلورسنت، وSPECT الانبعاثات تحول الحمراءالروم من مصدر الانارة الأصلي. وبالتالي، FUEL يلي عملية الإثارة الانبعاثات القياسية أقرب إلى ظروف المجهر epifluorescent القياسية، ولكن دون استخدام الإثارة تركيزا. الدليل على ذلك يمكن ملاحظتها بسهولة عن طريق خلط بسيط من البكتيريا الانارة ونقاط الكم عالية الفلورسنت. في وجود س الضمة، لوحظ زيادة كبيرة في إشارة حمراء عندما كانت QD705 أيضا في حل بالمقارنة مع غير الفلورسنت السيطرة البوليسترين المكروية (الشكل 1A). المكونات الضرورية لخلق تلألؤ بيولوجي، أساسا الركيزة ألدهيد، luciferase المراسل، وATP، ويتم إنتاج جميع والواردة في السيتوبلازم. وعلاوة على ذلك، يحدث إنتاج الأنزيمية ملماع داخل السيتوبلازم البكتيري (الشكل 1B). كما تم الإبلاغ عن أي مكان آخر، والمسافة بين الغشاء الداخلي والخارجي من البكتيريا هو عادة أكبر من 30 نانومتر 25-27، على مسافة لا تسمح لRET كبيرةتحدث. وكذلك، فإن الجسيمات النانوية الفلورسنت لا يعبرون الى السيتوبلازم البكتيري، حيث لا يوجد الإلتقام أو غيرها من وسائل امتصاص. معا، وهذه القيود تدل على أن FUEL هو ظاهرة الإثارة الانبعاثات المهيمنة التي تحدث عندما يتم خلط البكتيريا الانارة مع جزيئات الفلورسنت.

كما تبين سابقا، FUEL موجود خارج نطاق RET. للتحقيق في الاعتماد على الوقود بعد، وانخفاض حجم cuvettes الطيفي معيار يمكن استخدامها، مع واحد يحتوي على محلول fluorophore، والثانية تحتوي على عنصر تحكم المناسبة التي يمكن التحكم عن مبعثر، والثالثة تحتوي على قسامة من حل الانارة الطازجة. فمن الضروري أن كفيت المركزي أن يلفها باستخدام شريط أسود أو مواد مبهمة أخرى، باستثناء اثنين على الأقل من النوافذ البصرية متطابقة يقع على وجوه العكس، للحد من أي تلوث محتمل الضوء من مصدر الانارة. أبعد من ذلك، وهما بحاجة إلى cuvettes المتبقيةتوضع equidistantly على جانبي كفيت المركزية. أخيرا، حل الانارة الطازجة، وذلك باستخدام البكتيريا أو لمعان كيميائي، وينبغي أن تستخدم مع كل تجربة الإنتاج لضمان أقصى قدر من الضوء. على الموضع المناسب، والحصول على إشارة التلألؤ تحت المرشحات المطلوب. تم استخدام الضوء إجمالي المرشحات و710-730 نانومتر في هذه الحالة، على الرغم من البيانات فقط من هذا الأخير هو مبين. بعد كل شراء، وزيادة المسافة تدريجيا وجها لوجه من 1.0 سم إلى 3 سم (الشكل 2). أخيرا، وتطبيع كافة البيانات لألمع نقطة. في الأمثلة المستخدمة هنا، حدث هذا في أقصر مسافة (D = 1 سم) بين مصدر الانارة وكفيت يحتوي على QD705. باستخدام هذا النهج، يمكن ملاحظة إشارة FUEL قابلة للحياة ما يصل الى اكتساب النهائي مما يدل على أن، في غياب أي امتصاص البصرية، ويمكن أن يحدث FUEL على مسافات أبعد من أي نقل الطاقة الرنين ممكن، ويمكن فقط أن أوضح أن هناك الإشعاعي بحتةتأثير. تركيب البيانات يكشف عن انخفاض في إشارة كدالة للمسافة D بعد D -1 إلى مد -2 الاعتماد. وهذا يتوقف على التكوين الهندسي، ويتوافق السابق إلى الاعتماد مسافة مكثف والأخير لقانون التربيع العكسي لمصادر نقطة. ولهذه النتيجة تتفق مع شركائنا في العام الإعداد الاستحواذ، نظرا لحجم الفتحة كفيت والمسافة بين مصدر الانارة وfluorophore.

FUEL لا ينطبق فقط على نقاط الكم، ولكن أيضا يمكن ملاحظتها باستخدام مجموعة واسعة من fluorophores بدءا من سلسلة اليكسا لالمجهرية الفلورسنت (الجدول 2). من أجل أن تكون قابلة للمقارنة إلى السيطرة، وتركيزات متساوية من مختلف fluorophores ينبغي أن تستخدم والمساحة الإجمالية للجزيئات ثابتة (الجدول 1). من خلال مقارنة fluorophores والجسيمات النانوية إلى الضوابط المناسبة لها (PS أو PS مع غير الفلورسنتالمجهرية البوليسترين)، لوحظ زيادة كبيرة في إشارة على أقصى الانبعاثات من كل كيان الفلورسنت. تم العثور على أكبر زيادة نسبية في إشارة إلى تحدث فيها الحد الأقصى الانبعاثات الفلورسنت كان أبعد من الحد الأقصى للانبعاثات الانارة. وهذا هو الأرجح بسبب خصوصية المتزايد للإشارة الفلورسنت مقارنة طيف الانبعاث واسعة من مصدر الانارة. على العكس من ذلك، تم العثور على إشارة FUEL الأقل يمكن الاعتماد عليها عند الحدود القصوى للانبعاثات اثنين لم يفصل جيدا. ومن المثير للاهتمام، تم العثور على إشارة FUEL ملحوظ مع المجهرية صفراء على الرغم من أن الفرق الطيفية هو الحد الأدنى، ويرجع ذلك على الأرجح إلى كمية كبيرة من fluorophore الحاضر في حبة (350 حكمه فلوريسئين). النتائج المعروضة هنا تشير إلى أنه في ظل الظروف المناسبة FUEL لا يمكن أن يتحقق مع مجموعة متنوعة من fluorophores، والتي تمكن الخياطة تحقيقات اختار لتطبيقات أكثر أهمية في إطار كل طن المختبر وفي ظروف الجسم الحي. تم تحديد أهمية الإشارة FUEL وحظ باستخدام اختبار t معيار طالب ثنائي الطرف لل. على هذا النحو، تم العثور فقط Alexa555 لتكون متوافقة مع مصدر الانارة المستخدمة.

من أجل استكشاف آثار استهداف على الوقود، واستخدمت لاستهداف الأجسام المضادة البيروكسيديز البكتيريا الانارة وQDS المرتبطة streptavidin. من المهم أن البكتيريا أو مصدر التلألؤ توفير طبقة سميكة بما فيه الكفاية لتقليل إمكانية RET بين ملماع وfluorophore المقابلة. بعد الحضانة والغسيل لإزالة الأجسام المضادة غير منضم، ثم يتم كشفها البكتيريا المسمى البيوتين إلى streptavidin مترافق إما QD705 أو غير QD705 بين functionalized مثل السيطرة، وحلول مقسمة ومجموعة واحدة تتعرض لمزيد يغسل من أجل إزالة أي غير انضمت- QD705. هنا، لجميع الشروط الأربعة، لوحظ التلألؤ الناتجة تحت الضوء إجمالي، 490-510 نانومتر، ود 710-730 مرشحات نانومتر، على الرغم من وتستخدم فقط الأخيرتين مرشحات لتحليل البيانات. تم مقارنة وجود QD705 باستخدام 450-480 نانومتر الإثارة و710-730 المرشحات الانبعاثات نانومتر. بعد التحقيق وجدنا شيئا يذكر لولا الاختلاف في إشارة الحمراء تحولت عندما تركت الحلول في حالة غير مغسولة (الشكل 3). تم العثور على إشارة مضان الناتجة بموجب هذا الشرط أيضا لتكون مشابهة جدا، مما يشير إلى أن عدد متساو من QD705 كان حاضرا في إطار كل من الدولة المستهدفة وغير المستهدفة. ومع ذلك، وغسل العينات لإزالة أي غير منضم QD705 يوفر زيادة ما يقرب من شقين في إشارة حمراء النسبية للبكتيريا المستهدفة مقارنة سيطرتهم غير المستهدفة. التحقيق من قبل مضان يمكن استخدامها للتحقق من وجود أو عدم وجود QD705. نسبيا، أدت حالة غسلها المستهدفة في كثافة مضان أن ما يقرب من ثلاث مرات أقل من حالة غير مغسولة، ومع ذلك فإن الناتج الحمراء التحول بنسبة فقط30٪، مما يشير إلى أنه في ظل ظروف ملزمة بحتة فإن استهداف البكتيريا يؤدي إلى زيادة في الانبعاثات الحمراء تحول. هذا يلمح بشدة فائدة FUEL تستهدف التطبيقات المستقبلية.

الشكل 1
الشكل 1. A FUEL التفاعل بين البكتيريا الانارة ونقاط الكم المتاحة تجاريا يؤدي إلى زيادة في الإنتاج الفوتون الأحمر. امتلأت اثنين cuvettes الطيفي باستخدام محاليل تحتوي على 100 ​​ميكرولتر مأخوذة من V. جديدة ثقافة fischeri مع OD 600 من 1-1.5، 895 ميكرولتر من PS، وإما 5 ميكرولتر من QD705 أو المالحة الفسيولوجية (PS)، قبل أن يوضع في الطيف IVIS وطيف الانبعاث المكتسبة. ويتم تحقيق زيادة كبيرة في إشارة الحمراء بسبب وجودوQD705، كما يمكن أن يلاحظ من خلال الزيادة في الكشف عن الفوتونات • • ثانية -1 سم -2 (ع • • ثانية -1 سم -2) مقارنة بالكنترول تحت التصفية الانبعاثات 710-730 نانومتر (A). هنا، وغشاء مزدوج من البكتيريا يستبعد التفاعل من الأنصاف الانارة (الدوائر الزرقاء) وQD705 (الدوائر السوداء). تم العثور على السابق فقط في السيتوبلازم البكتيري في حين أن الأخيرة توزع بحرية في حل الجزء الأكبر (B). N = 3 لكل حل البكتيرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. الدليل على FUEL تحدث عبر مسافات مجمعاتباستثناء etely نقل الطاقة الرنين. امتلأت cuvettes طيفية باستخدام محاليل تحتوي على إما 50 ميكرولتر من QD705 و 950 ميكرولتر من المياه المالحة الفسيولوجية (PS) أو 97.2 ميكرولتر من غير الفلورسنت المجهرية 48 نانومتر البوليسترين و902.8 ميكرولتر من PS، وضعت equidistantly على طرفي نقيض من كفيت الأسود المركزية تحتوي على 1 مل من الطازجة س الانارة اللميعة في لOD 600 من 1-1.5. كان كفيت المركزية نافذتين البصرية متطابقة السماح الفوتونات المنبعثة لتفريق بحرية. الحصول على الصور على مسافات (D) تتراوح بين 1.0 سم إلى 3 سم، وانخفض الإنتاج لاحظ الضوء الأحمر بوصفها وظيفة من المسافة عرض الأدلة التي يمكن أن تحدث FUEL على مسافات لا يمكن تحقيقه عن طريق نقل الطاقة الرنين. كثافة على ما يبدو D -2 الاعتماد، على غرار قانون التربيع العكسي (يسار). وأعقب البروتوكول نفسه بالنسبة E. القولونية (يمين). مما أدى خطوط الاتجاه يعقد النموذج إلى مفهوم ثار البكتيريا يعملون كمصادر نقطة ضوء. تم الحصول على ما مجموعه ثلاثة قياسات المسافة مستقلة مع بعضها باستخدام ثقافة فرعية فريدة من نوعها. أشرطة الخطأ موجودة في كل نقطة. في بعض الحالات كانت أشرطة الخطأ أصغر من الرموز المستخدمة التي تشير إلى كثافة تطبيع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. مقارنة بين المستهدف (محددة) وغير المستهدفة (الحل بالجملة) FUEL. K. وبين functionalized الرئوية مع الأجسام المضادة البيروكسيديز ثم يتعرض إما المسمى streptavidin (المستهدفة) أو غير المسمى (غير المستهدفة) QD705. كانت الحلول الناتجة DIVI على قدم المساواةدائرة التنمية الاقتصادية ومجموعة واحدة غسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني قبل أن يتم معلق في حجم الأولي في برنامج تلفزيوني. ثم تم الاستغناء عن الحلول في الآبار الفردية للأسود لوحة 96 جيدا وتلألؤ بيولوجي لوحظ تحت المرشحات الانبعاثات نانومتر 490-510 (500 نانومتر) و710-730 نانومتر (720 نانومتر) (المشار إليها باسم أشرطة زرقاء). ع • • ثانية -1 سم -2 جدت من تصفية 720 نانومتر لكل بئر وتطبيع من قبل كل ثانية -1 ع • • سم -2 شدة تلألؤ بيولوجي من 500 نانومتر من نفس البئر. وتم تحديد كثافة مضان النسبية الناتجة عن الإثارة باستخدام المجهر epifluorescent 450-480 نانومتر الإثارة و710-730 المرشحات الانبعاثات نانومتر (المشار إليها باسم الحانات الحمراء). قليل من دون فرق في إشارة للإضاءة الحيوية أو الفلورسنت لوحظ في ظل الظروف غير مغسولة (غير المستهدفة وغير مغسولة المستهدفة غير مغسولة). هذا يشير إلى أن QD705 المربوطة والتعويم الحر كان متحمس بنفس القدر من الفوتونات للإضاءة الحيوية. على الغسيل، نوقد لوحظ في وقت مبكر فرق شقين في إشارة حمراء النسبية للبكتيريا QD705 المسمى (المستهدفة مغسول) مقارنة بالكنترول (عدم استهداف غسلها). وأكد عدم وجود QD705 في عدم استهداف غسلها من عدم وجود إشارة الفلورسنت والتحقق من وضع العلامات QD705 في الدولة المستهدفة غسلها. البيانات هي من أربع ثقافات مستقلة K. الرئوية. من أجل الوضوح، وأسطورة يشير مصدر الإثارة QD705. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

العرض: 108px؛ "اليكسا> 700 الطول: 22px؛ العرض: 108px؛ "> QD800
Fluorophore تركيز ميكرولتر PS (ميكرولتر) λ ماكس السابقين / م (نانومتر) تصفية الانبعاثات (ن م)
الكسا 555 37.2 ميكرومتر 4.77 995.23 555/565 570-590
الكسا 568 37.2 ميكرومتر 4.77 995.23 578/603 590-610
الكسا 633 37.2 ميكرومتر 4.77 995.23 632/637 650-670
37.2 ميكرومتر 4.77 995.23 702/723 710-730
Nonfluorescent 2.62٪ المواد الصلبة 9.72 990.28
μSph الوردي 5٪ مواد صلبة 4.77 995.23 580/605 610-630
μSph الأصفر 5٪ مواد صلبة 4.77 995.23 505/515 510-530
QD705 2 ميكرومتر 5 995 465/705 710-730
2 ميكرومتر 5 995 465/705 790-810

الجدول 1. خصائص fluorophores المستخدمة في جميع أنحاء مظاهرات الوقود.

<الدفتيريا> 6.05 × 10 4
مراقبة مرشح fluorophore مراقبة القيمة ع
ع · · ثانية -1 سم -2 SD ع · · ثانية -1 سم -2 SD
A555 PS 580 1.08 × 10 7 3.31 × 10 6 9.09 × 10 6 1.75 × 10 6 0.233
A568 PS 600 8.47 × 10 6 4.23 × 10 6 4.49 × 10 6 9.71 × 10 5 0.094
A633 PS 660 2.40 × 10 6 1.25 × 10 6 7.85 × 10 5 2.39 × 10 5 0.046
A700 PS 720 5.53 × 10 5 2.46 × 10 5 1.54 × 10 5 0.026
MSPH الأصفر μspheres غير الفلورسنت 520 1.19 × 10 8 4.85 × 10 7 5.79 × 10 7 1.99 × 10 7 0.057
MSPH الوردي μspheres غير الفلورسنت 620 2.37 × 10 7 1.36 × 10 7 2.16 × 10 6 8.00 × 10 5 0.026
QD705 μspheres غير الفلورسنت 720 1.76 × 10 7 7.33 × 10 6 2.08 × 10 5 7.16 × 10 4 0.007
QD800 μspheres غير الفلورسنت 800 7.79 × 10 6 4.72 × 10 6 3.60 × 10 4 1.52 × 10 4 0.023

الجدول 2. تحديد fluorophores والفلورسنت النانوية متوافق مع الوقود.

Discussion

لا يمكن أن يتحقق المظاهرة الأساسية للFUEL ببساطة عن طريق خلط البكتيريا مع الانارة الفلورسنت النانوية أو QDS. سيتم الكيانين المنفصلين جسديا وتظل أبعد من أي مسافة RET كفاءة. أكثر صعوبة هو الوقود إشارة الأمثل سواء في التجارب المختبرية والحية. تحت ظروف في المختبر، مع ودون امتصاص البصرية الحاضر على حد سواء، وعادة إضافة fluorophore الزائدة سوف تكون كافية لتحقيق أقصى قدر من الاستجابة FUEL. ومع ذلك، في تركيزات عالية ظواهر مثل تبريد ثابت أو الاصطدامية يمكن أن يؤدي إلى فقدان إشارة الفلورسنت. سوف إجراء سلسلة التخفيف بشكل مستقل من قبل متفاوتة تركيز مصدر الانارة وfluorophore تساعد على تحسين تركيز المطلوب. إنشاء والأمثل للوقود تحت تركيزات في الجسم الحي هو أكثر صعوبة وتحتاج إلى معالجة على أساس كل حالة على حدة. يمكن أن يكون من الصعب خلق التعاون ndition حيث يمكن الوصول إلى كيان الفلورسنت بصريا من المصدر الانارة. على هذا النحو، بدءا شارك الحقن المباشر للالأنصاف اثنين يمكن أن توفر معلومات بشأن نجاح FUEL تحت الظروف المثلى.

وجود بروتوكولات موحدة لوضع العلامات البكتيريا والخلايا حقيقية النواة مع الكيانات الفلورسنت مثل سلسلة اليكسا وQDS. وغالبا ما يتطلب هذا functionalization السطح أو التنشيط مع الأجسام المضادة، التي يمكن أن تؤدي إلى آثار غير مرغوب فيها مثل تخفيض بقاء الخلية أو تغيير النشاط الأيضي. للتغلب على هذا، فمن المهم لتحديد المبلغ الأمثل من الأجسام المضادة أو وكيل التنشيط اللازمة التي تقلل من الاضطرابات الخلوية مع تعظيم وضع العلامات الفلورية. استخدام QDS هو مفيد لما لها من أطياف واسعة مميز الإثارة والضيقة والانضباطي أطياف الانبعاثات، وإمكانية تحول كبير ستوكس. ومع ذلك، يمكن أن تكون سامة للخلايا وQDS قد لا يكون مرغوبا فيه في بعض الحالات.

الطبقة = "jove_content"> FUEL هو ظاهرة موجودة في العديد من التجارب بريت 13 وينطبق على مجموعة متنوعة من الانارة ومصادر الفلورسنت. حتى الآن، كانت تعتبر الفوتونات الناتجة عن الوقود المنتج من التفاعلات غير محددة أو إشارة الخلفية المؤسفة الناتجة عن سوء تصميم التجارب بريت. مع أنها ليست سوى نوع من التجارب أظهرت هنا أن كنا قادرين على تحديد مدى فائدة هذه الإشارة غير المرغوب فيها. في الأمثلة المعروضة، والبكتيريا الانارة بمثابة مصدر الإثارة منتشر قادرة على انتزاع استجابة الفلورسنت القياسية من مجموعة واسعة من الكيانات الفلورسنت. علاوة على ذلك، نظرا لبعد المسافة عمل كبيرة، وأنها آمنة لإبرام أنه في حين أن وقود يمكن بناؤها دون وقوع بريت، بريت في العام لا يمكن ملاحظتها دون مساهمة من الوقود. الأهم من ذلك، نظرا لعدم وجود شرط الاستهداف، FUEL يمكن استخدامها لتغطية الفجوة المكانية القائمة بين بريت وجتقنيات التصوير كله والحيوان onventional.

Disclosures

يعلن الكتاب المصالح المالية المتنافسة. ساهم دينار، SB، KLR وSLS لEP10290158.4 الأوروبي للبراءات والمنظمة العالمية للملكية الفكرية براءات الاختراع التطبيق WO/2011/117847.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أعرب عن امتنانهم للدعم المالي من مؤسسة باستور نيويورك (دينار، CS، CS)، والاتحاد الأوروبي FP7 برنامج "أتمتة" (لSLS)، وبرنامج معهد كارنو 11 (دينار، ه ، AR، RT، SLS) ومشروع IMNOS (لRT، SLS)، ومؤسسة كوني-مافي الخيرية (SLS)، والماجستير الأوروبي في التصوير الجزيئي (لتقنية المعلومات)، وبرامج منطقة إيل دو فرانس MODEXA (SLS)، السمسم (SLS) وDimMalInf (SLS، RT)، وكالة الاستخبارات الوطنية برنامج جراند INVESTISSEMENT DE L'AVENIR البنى التحتية Nationales أون البيولوجيا-سانتي: فرنسا LifebioImaging (FLI) فرنسا الحياة التصوير (RT، SLS)، فرنسا Bioimaging (دينار، SLS) و معهد باستور في باريس. علاوة على ذلك، فإن الكتاب أود أن أشكر، خوسيه Bengoechea وهربرت شفايتزر للمواد. علاوة على ذلك، فإن الكتاب أود أن أشكر سيندي فيفر الذي ولدت الأجسام المضادة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon  kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer
Klebsiella pneumoniae 52145  52145 is a serotype K2 reference strain
Luria Bertani (LB)  standard growth media
Q-Tracker 705  Life Sciences Q21061MP
Q-Tracker 800 Life Sciences Q21071MP
Alexa 555 Life Sciences S21381
Alexa 568 Life Sciences S11226
Alexa 633 Life Sciences S21375
Alexa 700 Life Sciences S21383
Non-fluorescent microspheres Polysciences, Inc 15913
Pink microspheres Life Sciences F8887 40 nm diameter
Yellow microspheres Life Sciences F8888 40 nm diameter
Ivis Spectrum PerkinElmer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific Pierce 21425
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Scientific Pierce 21425
HABA assay kit  Thermo Scientific Pierce 28005
Bradford assay Bio-Rad 500-0201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, K., et al. A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer. J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).
  2. Contag, C. H., et al. Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter. Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).
  3. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  4. Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).
  5. Condeelis, J., Weissleder, R. In Vivo Imaging in Cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. (2010).
  6. Madero-Visbal, R. A., et al. Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer. Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).
  7. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. 10, (2010).
  8. Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).
  9. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. Luminescent probes and visualization of bioluminescence. Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).
  10. Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light. Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).
  11. Saito, K., et al. Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging. Nat Commun. 3, 1262 (2012).
  12. Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).
  13. Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. The BRET technology and its application to screening assays. Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).
  14. So, M. -K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).
  15. Wu, Q., Chu, M. Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes. Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).
  16. Wu, C., et al. In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).
  17. Piston, D. W., Kremers, G. -J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).
  18. Dragavon, J., et al. in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues. 790210-790219 (2011).
  19. Dragavon, J., et al. In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).
  20. Holland, A. D., et al. In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer. Methods. (2013).
  21. Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).
  22. Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations. Infect Immun. 31, 71-77 (1981).
  23. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications. J Microsc. 247, 119-136 (2012).
  24. Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).
  25. Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria. Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).
  26. Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles. Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).
  27. Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods. Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats