A Step Beyond BRET: Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL)

1Plate-Forme d'Imagerie Dynamique, Imagopole, Institut Pasteur, 2Department of Radiation Oncology, Stanford School of Medicine, 3Service Hospitalier Frédéric Joliot, Institut d'Imagerie Biomédicale, 4Vanderbilt School of Medicine, 5The Walter & Eliza Hall Institute of Medical Research, 6Unité INSERM U786, Institut Pasteur, 7Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Institut Pasteur
Published 5/23/2014
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Bioengineering
 

Summary

Erweiterung der Grundlagen und Anwendbarkeit der Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL) durch Vermessung der einschlägigen Grundsätze und demonstriert seine Kompatibilität mit einer Vielzahl von Fluorophore und Antikörper-bezogene Bedingungen.

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Dragavon, J., Sinow, C., Holland, A. D., Rekiki, A., Theodorou, I., Samson, C., et al. A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL). J. Vis. Exp. (87), e51549, doi:10.3791/51549 (2014).

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Abstract

Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL) ist ein Strahlungs Anregungs-Emissions-Prozess, erhöhte Signal-und Kontrastverbesserung in vitro und in vivo produziert. FUEL teilt viele der gleichen Grundprinzipien wie Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET), jedoch unterscheidet sich stark in den zulässigen Arbeitsabstand zwischen der Leuchtquelle und dem fluoreszierenden Einheit. Während BRET effektiv auf ein Maximum von 2 mal dem Förster-Radius, üblicherweise weniger als 14 nm beschränkt ist, kann Kraftstoff bei Entfernungen von bis zu &mgr; m oder sogar cm in Abwesenheit eines optischen Absorbers erfolgen. Hier werden wir auf das Fundament und die Anwendbarkeit der FUEL erweitern durch die Prüfung des relevanten Prinzipien, die hinter dem Phänomen und zeigen die Kompatibilität mit einer Vielzahl von Fluorophore und fluoreszierende Nanopartikel. Ferner ist die Nützlichkeit der Antikörper-bezogene FUEL sucht. Die hier gezeigten Beispiele belegen, dass FUEL für appl genutzt werdenikationen wo BRET nicht möglich ist, füllt die räumliche Lücke, die zwischen BRET und traditionelle ganze Tierbildgebung existiert.

Introduction

Die gentechnische Veränderung von Organismen wie Viren 1, 2, 3 Bakterien oder kleine Säugetiere 4 bis entweder induzieren oder konstitutiv Biolumineszenz, ist sehr erfolgreich und weithin demonstriert 5-7. Biolumineszenz in vivo eine chemilumineszierende Reaktion, die natürlich vorkommende Reagenzien, hat den Vorteil der Erzeugung von Licht, ohne die Notwendigkeit für eine externe Lichtquelle. Als solches ist die Biolumineszenz-Bildgebung nicht von den gemeinsamen Nachteile der automatischen und nicht-spezifische Signal von Fluoreszenz-Bildgebungs 8 gefunden leiden. Folglich hat die Biolumineszenz ein signifikantes Signal-zu-Rausch-Verhältnis, da jeder erfaßte Signal vom beabsichtigten Quelle stammt ausschließlich. Während viele Modelle haben die lux-Operon aus Photorhabdus luminescens (Emissionsmaximum zwischen 480 und 490 nm zentriert) für in-vitro-und in vivo-Anwendungen 9 genutzt, deren Verwendung in kleinen mammALS ist aufgrund der Natur der Abbildungsbedingungen problematisch; der durchdringenden Existenz von optischen Absorber, wie Hämoglobin und Streumittel, wie Gewebe und Knochen, stark beeinflussen blau nach gelb 3 Wellenlängen. Der Ausdruck eines konstruierten Leuchtkäfer-Luciferase (Emissionsmaximum bei 617 nm) wurde vor kurzem entwickelt und verarbeitet, die für ein Werkzeug, das stark überwindet optische Absorption 10, ist aber noch unter dem Vorbehalt Streueffekte.

In Reaktion gab es mehrere Versuche, Rotverschiebung des emittierten Signals in das gewünschte optische Fenster 650-900 nm, einem Bereich minimiert Absorption und Streuung, mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) 11-13. Als Mittel zur Signalerfassung zu verbessern, BRET, die ein Biolumineszenz-Quelle als dem Donor-Fluorophor und einem zusätzlichen als Akzeptor verwendet wurden begrenzte Erfolge verzeichnet. Ein Samen Beispiel für dieses Phänomen, "selbstleuchtende Quantenpunkte4; (SIQDs) 14 bestehen aus modifizierten Renilla reniformis Luciferase mit dem externen Polymer-Lysin-Schicht gebunden von kommerziell verfügbaren Quantenpunkte (QP). Nach Substratzugabe, die resultierende Biolumineszenzreaktion induziert Fluoreszenzemission aus den Quantenpunkten, wodurch eine signifikante Produktion von roten Photonen. Allerdings sind diese SIQDs haben Anwendbarkeit in vivo Darstellung von physiologisch relevanten Ereignisse beschränkt. Diese begrenzte Anwendbarkeit ist wahrscheinlich auf die Schwierigkeiten bei der Verknüpfung der dualen Sonde mit der Organ-, Zell-oder Gen von Interesse, da die SIQDs nicht genetisch codiert werden, und daher wäre eine sekundäre Modifikation der Polymerhülle erforderlich. Um ihre Anwendbarkeit zu verbessern, alternative SIQDs, wo die Luciferasen sind direkt mit dem lumineszierenden Kern gebunden ist, wurden kürzlich 15 eingesetzt. Aufbauend auf der SIQD Konzept wurde ein mehr für BRET-System durch das Anbringen Cypridina Luciferase auf einen dadurch erreichtdocyanine Farbstoff 16, der in der Lage gezielt Tumore in Mäusen während eine beträchtliche Rotverschiebung von 460 nm bis 675 nm war. Nicht-strahlenden Energietransfer durchlaufen ist, folgt BRET die gleichen Einschränkungen wie die primäre Leuchtstoffgegen: es muss eine starke spektrale Überlappung zwischen der Donor-Emission und Akzeptor-Anregungsspektren und der Arbeitsabstand zwischen den beiden Einheiten sein müssen, in der Größenordnung von BE Förster-Radius (5-14 nm in Abhängigkeit von der Donor-Akzeptor-Paar, mit einer wirksamen maximalen Abstand von zweimal der Förster-Radius 17). Diese Abstandsabhängigkeit stark begrenzt die Ereignistypen, die mit BRET als Mittel zur Erkennung zu verbessern beobachtet werden können.

Kürzlich wurde ein neuer Ansatz identifiziert und sowohl in vitro als auch in vivo Bedingungen, unter Beweis gestellt. Aufbauend auf den Grundstein für BRET, Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL) 18, 19 Escherichia coli das lux-Operon und QD 18, 19 exprimieren auftreten. Während experimentell ähnlich den SIQDs besteht ein wesentlicher Unterschied: bei Kraftstoff, ist es nicht notwendig, daß die lumineszierenden Quelle zu sein physikalisch gebunden an das Fluorophor, das ermöglicht for genetischen Kodierung des Leuchtsonde. Aufgrund der erfolgreichen Erkennung von FUEL zwischen Leuchtbakterien und Quantenpunkte ist es möglich, dass diese Technik sowohl oberflächlich (Haut) und tiefe Gewebe (Lunge, Leber) Infektionen wie Staphylococcus aureus und Klebsiellia pneumoniae angewendet werden.

Seit dem Bericht seiner experimentellen Bedeutung hat FUEL entwickelt, um eine robuste mathematische Modell 20, die verwendet werden können, um eine akzeptable Lumineszenz-und Fluoreszenzpaare vorherzusagen sind, und ihre Anwendungen haben erweitert, um den Einsatz bei der Identifizierung von photophysikalischen Eigenschaften wie Quantenausbeute aufweisen. Wir beschreiben im Folgenden einige der grundlegenden Techniken der FUEL. Zuerst zeigen wir Beweise für dieses Phänomen über kurz (um) und lang (cm) Arbeitsabstände, die sich grundlegend unterscheidet von FUEL BRET. Zweitens haben wir auf die mögliche Kraftstoffpaare zu erweitern durch die Untersuchung einer Vielzahl von Fluorophoren und fluoreszierende Nanopartikel. Third werden die Kraftstoffanwendungen durch den Vergleich gezielte und nicht gezielte FUEL Paare untersucht.

Protocol

1. Reagenzien

  1. Kauf oder Leuchtbakterien entwickeln und geeignete Kulturmedien wie modifizierte Escherichia coli die Lux ABCDE 21 exprimieren, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22.
  2. Bereiten physiologischer Kochsalzlösung (0,9% NaCl) und Kultur-Media-Lösungen nach Standardrezepturen. E. coli und K. pneumoniae wurden in Luria-Bertani (LB) bei 37 º C gezüchtet und V. und Photobacterium fischeri sp in LB, ergänzt mit 0,5 M NaCl bei 22 ° C.
  3. Kauf erwerben oder Fluoreszenzsonden wie Q-Tracker 705 (40 nm Durchmesser, die als QD705), Q-Tracker 800 (40 nm Durchmesser, die als QD800), Fluoreszenz (40 nm Durchmesser) und nicht fluoreszierenden Polystyrol-Mikrokügelchen ( 48 nm Durchmesser) und herkömmliche Fluoreszenzfarbstoffe.
  4. Bereiten Sie die notwendigen Reagenzien für die bakterielle Kennzeichnung.
  5. Stellen Sie Zugriff aufeine ganze Tier Biolumineszenz-Bildgeber, wie beispielsweise ein IVIS Spectrum, ist, dass in der Lage-Erfassungssignal unter einer Vielzahl von Emissionswellenlängen und Belichtungszeiten. Ein Plattenlesegerät für Biolumineszenz-Messungen wird für die meisten der hier beschriebenen Experimente ausreichen.

2. Zusammenfassung der Grund FUEL

  1. Ausgehend von einzelnen Kolonien auf Standard-Kulturplatten, Start-Nacht-Kulturen von Leuchtbakterien. Hier V. fischeri verwendet.
  2. Der Tag des Experimentierens, initiieren neue Subkulturen und es ihnen ermöglichen, den Fortschritt, bis eine OD 600 von 1 bis 1,5 erreicht. Um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen ist es am besten, um Bakterien in ähnlichen Wachstums Staaten, in denen sie intensive Signale erzeugen zu verwenden. Dies kann, indem die OD 600 konstant gewährleistet werden.
  3. Kombinieren von 100 &mgr; l Aliquots von jeweils entweder 5 ul QD705 oder physiologischer Kochsalzlösung (PS), und dann in 895 ul PS hinzufügen in standard spektroskopische Küvetten. Legen Sie die gefüllte Küvetten in das IVIS Spectrum und die Messungen unter den entsprechenden Filtersätze. Hierbei wurde die 710 bis 730 nm-Emissionsfilter verwendet.

3. FUEL über unterschiedliche Entfernungen

  1. Füllen zwei reduzierten Volumen (1 ml) aus Kunststoff photometrischer Küvetten mit entweder 50 ul QD705 oder 97,2 ul nicht-fluoreszierenden 48 nm Polystyrolmikrosphären in einem Gesamtvolumen von 1 ml PS. Dies gewährleistet ähnliche feste Oberfläche pro Volumen zwischen den beiden Einheiten.
  2. Bereiten Sie eine Lichtquelle Küvette durch einschließen eine dritte Küvette mit Standard-Schwarz-Band oder einem anderen undurchsichtigen Material in der Lage ist, Licht zu blockieren. Zwei identische optische Fenster sorgfältig vorzubereiten auf gegenüberliegenden Seiten der Küvette.
  3. Legen Sie die zuvor gefüllten Küvetten direkt auf jeder Seite der Lichtquelle Küvette. In einer 1 ml-Aliquot V. fischeri oder andere Kultur (dh Leucht E. coli oder Photobacterium sp) aus einer neuen Subkultur in die Lichtquelle einsetzen und decken Sie es mit einem undurchsichtigen Material, wie schwarzes Papier, jede leichte Verschmutzungen zu reduzieren.
  4. Visualisieren Sie die drei Küvetten unter den entsprechenden Emissionsfilter wie der Gesamt Licht und 710-730 nm Emissionsfilter, mit Belichtungszeiten von 10, 30 und 30 Sekunden auf.
  5. Neupositionierung sowohl externe Küvetten bei äquivalenten weiteren Abständen von der zentralen Küvette, und dann wieder zu visualisieren. Wiederholen, bis eine endgültige face-to-face (Zentral reduziert Volumen Küvette) Abstand von 3 cm erreicht. Bei jedem Schritt wird ein Fluoreszenzbild erhalten (450-480 nm Anregung, 710 bis 730 nm Emission), um die Lage QD705 validieren.

4. Untersuchung Mögliche FUEL Pairs

  1. Füllen zwei reduzierten Volumen Küvetten mit 1 ml Lösung, die entweder ein Fluorophor oder eine fluoreszierende Nanopartikel von Interesse in einem, oder PS und PS mit nicht-fluoreszierende Nanopartikel als negative Kontrolle in die andere. In the Arbeit zeigte hier eine Vielzahl von potentiellen Handel erhältlich FUEL Fluorophore und Fluoreszenz-Nanopartikel wurden untersucht, wie in Tabelle 1 dargestellt.
  2. In einer 1 ml-Aliquot frisch V. fischeri oder andere Leuchtbakterien zu einem verdunkelten dritten Küvette mit zwei physikalisch gleiche optische Fenster auf gegenüberliegenden Seiten entfernt. Decken Sie die Küvette mit einem undurchsichtigen Substanz, wie ein Stück schwarzes Papier.
  3. Bei einem kurzen, aber gleichen Abstand Platz die beiden reduzierten Volumen Küvetten auf beiden Seiten des abgedunkelten Küvette und visualisieren unter den entsprechenden Filter. Hier ist ein Abstand von 0,7 cm wurde verwendet. Wiederholen Sie mit den anderen Fluorophore.

5. Gezielte FUEL

  1. Bereiten Sie speziell auf die Leuchtbakterien biotinylierten Antikörpern. Zum Beispiel ist hier primären Antikörper spezifisch an K. pneumoniae (α-Kp) wurden mit einer Lösung, die EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin biotinyliert. Überschüssiges Reagenz von den Antikörpern mit Entsalzungssäulen unter Zentrifugation (1500 × g) für 2 min.
  2. Verwenden Sie ein Standard-Bradford-Test, um die Proteinkonzentration zu bestimmen und bestimmen den Grad der Antikörper Biotinylierung von HABA-Assay.
  3. Erhalten, die α-KP-Biot biotinylierten Antikörpers (Ab) Chargen durch Mischen von 100 &mgr; l (10 mM, in 1x PBS) mit 40 ul α-Kp Antikörper, was zu einer endgültigen Substitutionsgrad von 16 Biotinresten pro Ak und einem abschließenden Proteinkonzentration von 10 mg ml -1.
  4. Die Verwendung mehrerer Kulturen über Nacht zu replizieren, zielen die gewaschenen Bakterien, die mit den oben genannten Antikörpern nach dem entsprechenden Protokoll.
    1. Insbesondere, waschen Sie die K. pneumoniae in 1x PBS und Resuspendieren in 1 × PBS auf eine OD von 4 (ca. 4 × 10 8 CFU ml -1 OD -1).
    2. Für jede Wiederholung, Inkubation 100 ul PBS, α -Kp Antikörper (10 ul α-KP-biotB oder 10 ul PBS für die Kontrolle) und 100 &mgr; l Zellen für 90 min bei 30 ° C. In 1x PBS in 196 ul PBS Waschen Sie die Zellen dreimal, und resuspendieren.
  5. Beschriften Sie die Zellen mit dem QD705 Streptavidin-Konjugat und teilen sie in zwei gleichwertige Bände.
  6. Drei mal waschen und dann eine Lösung resuspendieren sie in die entsprechende Lautstärke.
  7. Verteilen von 100 &mgr; l der gewaschenen und ungewaschenen Lösungen in einzelne Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Platte. Messen Sie die resultierende Lumineszenz unter der Gesamt Licht, 490-510 nm und 710-730 nm-Filter. Fluorophorkonzentration kann mit 450 bis 480 nm Anregungs-und 710 bis 730 nm Emission bestimmt werden.

Representative Results

Resonanzenergietransfer (RET) ist ein nicht-strahl Wechselwirkung zwischen einem lumineszenten Donor und einem fluoreszierenden Akzeptor, wobei die Energie aus dem Spender beendet induzieren kann eine Fluoreszenzantwort von dem Akzeptor durch eine starke Dipol-Dipol-Wechselwirkung 13 ist. RET, die unter Verwendung von fluoreszierenden 23, 24 Chemilumineszenz und Biolumineszenz-13 Spendern, beschrieben hat hauptsächlich benötigt: 1 Starke spektrale Überlappung zwischen Donor-Emission und Akzeptor Anregungsspektren;. 2 Geeignete Drehausrichtung zwischen den beiden Einheiten. und 3. Arbeitsabstand nicht größer als 0,5-bis 2-fache des Förster-Radius R 0, zwischen dem Donor-und Akzeptor-17. Kontrast RET tritt Kraftstoff, wenn ein lumineszierQuelle, wie einer biolumineszierenden Bakterien, emittiert ein Photon absorbiert wird, und durch eine zweite Einheit re-emittierten, wie ein Fluorophor oder eine fluoreszierende Nanopartikel Rotverschiebung der Emission SPECTRum von der ursprünglichen Leuchtquelle. Somit folgt FUEL eine Standard Anregungs-Emissions-Prozesses ähnlich epifluoreszenten Standardbedingungen, aber ohne die Verwendung eines fokussierten Anregungs. Beweis dafür können leicht durch einfaches Mischen von Leuchtbakterien und hochFluoreszenzQuantenPunkten beobachtet werden. In Gegenwart von Vibrio sp wird eine signifikante Zunahme der roten Signal beobachtet, wenn QD705 auch in Lösung im Vergleich zu einer nicht-fluoreszierenden Polystyrol-Mikrokügelchen-Steuerung (Fig. 1A). Die zur Biolumineszenz, im wesentlichen die Aldehyd-Substrat, Luciferase und ATP-Komponenten zu erstellen, werden alle hergestellt und im Zytoplasma enthalten. Weiterhin tritt die enzymatische Luminophors Produktion innerhalb der bakteriellen Zytoplasma (Abbildung 1B). Wie bereits an anderer Stelle beschrieben, ist der Abstand zwischen der inneren und der äußeren Membran der Bakterien in der Regel größer als 30 nm 25-27, eine Distanz, die nicht zu erheblichen RET nicht zulässtauftreten. Wie gut, haben die fluoreszierenden Nanopartikel nicht in die Bakterienzellplasma zu überqueren, da es keine Endozytose oder andere Mittel der Aufnahme. Zusammen bilden diese Einschränkungen zeigen, dass FUEL ist die dominierende Anregungs-Emissions-Phänomen, das bei Leuchtbakterien werden mit fluoreszierenden Nanopartikeln vermischt auftritt.

Wie zuvor gezeigt wurde, besteht FUEL über den Bereich der RET. Zu den Kraftstoffabstandsabhängigkeit zu untersuchen, können Standard-reduzierten Volumen spektrophotometrische Küvetten verwendet werden, wobei eine, die ein Fluorophor-Lösung, eine zweite, die eine geeignete Steuerung, die für die Streu kontrollieren können, und die dritte, die eine aliquote Menge von frischen Leucht Lösung. Es ist wichtig, dass die zentrale Küvette mit schwarzem Klebeband oder einem anderen undurchsichtigen Material, außer für mindestens zwei identische optische Fenster auf gegenüberliegenden Seiten befinden, um eine mögliche Kontamination Licht von der Leuchtquelle reduzieren umhüllt werden. Ferner sind die beiden verbleibenden Küvetten müssengleichem Abstand auf jeder Seite der zentralen Küvette gegeben werden. Schließlich ist eine frische Leucht Lösung, mit Hilfe von Bakterien oder Chemilumineszenz, die bei jedem Experiment verwendet werden, um eine maximale Licht Produktion zu gewährleisten. Auf entsprechende Platzierung erwerben, die Lumineszenz-Signal unter den gewünschten Filter. Die Gesamtlicht und 710 bis 730 nm-Filter wurden in diesem Fall verwendet wird, wenn nur die Daten von diesem gezeigt. Nach jedem Erwerb, erhöhen schrittweise die face-to-face-Abstand von 1,0 cm bis 3 cm (Abb. 2). Schließlich normalisieren alle Daten zum hellsten Punkt. In den hier verwendeten Beispielen trat dies bei kürzester Distanz (D = 1 cm) zwischen der Leuchtquelle und der Küvette, die QD705. Unter Verwendung dieses Ansatzes kann lebensfähigen Kraftstoffsignal bis die endgültige Übernahme darauf hindeutet, dass in der Abwesenheit jeglicher optischer Absorber kann Kraftstoff in Abständen über jeden möglichen Resonanzenergietransfer auf, und kann nur erklärt werden, um eine rein Strahlungs werden beobachtetWirkung. Anpassen der Daten zeigt eine Abnahme des Signals als eine Funktion des Abstands D Ein D -1 bis -2 D Abhängigkeit. In Abhängigkeit von der geometrischen Konfiguration, die erstere entspricht dem Kondensator Entfernungsabhängigkeit und letztere zur inversen quadratischen Gesetz für Punktquellen. Dieses Ergebnis ist daher im Einklang mit unserer Gesamterfassungsaufbau, da die Größe der Öffnung der Küvette und der Abstand zwischen der Leuchtquelle und dem Fluorophor.

FUEL gilt nicht nur für Quantenpunkte, sondern kann auch unter Verwendung einer Vielzahl von Fluorophoren, die von der Serie Alexa fluoreszierenden Mikrosphären (Tabelle 2) beobachtet werden. Um mit der Kontrolle vergleichbar ist, sollte gleich Konzentrationen der verschiedenen Fluorophore verwendet werden, und die gesamte Oberfläche der Nanopartikel konstant gehalten (Tabelle 1). Durch den Vergleich der Fluorophore und Nanopartikel in die entsprechenden Kontrollen (PS oder PS mit nicht-fluoreszierendenPolystyrol-Mikrokugeln), wird eine signifikante Zunahme des Signals am Emissionsmaximum der einzelnen fluoreszierenden Einheit beobachtet. Der größte relative Zunahme Signal gefunden, wenn dem die Fluoreszenzemissionsmaximum am weitesten von der lumineszierenden Emissionsmaximum war. Dies ist wahrscheinlich auf die erhöhte Spezifität des Fluoreszenzsignals gegenüber dem breiten Emissionsspektrum des Leuchtquelle. Im Gegenteil wurde die wenigsten zuverlässige Kraftstoffsignal gefunden wird, wenn die zwei Emissionsmaxima nicht gut getrennt sind. Interessanterweise wurde eine erkennbare FUEL Signal mit den Gelb-Mikrokügelchen, auch wenn die spektrale Unterschied ist minimal, wahrscheinlich aufgrund der erheblichen Menge der pro Perle (350 Fluorescein-Äquivalente) vorhanden Fluorophor gefunden. Die hier gezeigten Ergebnisse zeigen, dass unter geeigneten Bedingungen FUEL kann mit einer Vielzahl von Fluorophoren, die die Anpassung von Sonden für relevante Anwendungen sowohl unter i gewählt, können erreicht werdenn-vitro-und in vivo-Bedingungen. Die Bedeutung der beobachteten FUEL Signal wurde mit einem Standard-two-tailed Student-t-Test bestimmt. Als solches wird nur die Alexa555 wurde gefunden, mit dem Leuchtquelle verwendet unvereinbar.

Um die Auswirkungen der Ausrichtung auf FUEL zu erkunden, wurden biotinylierte Antikörper verwendet, um Leuchtbakterien und Streptavidin-gebundenen QDs Ziel. Es ist wichtig, daß die Bakterien-oder Lumineszenz-Quelle eine Schicht dick genug ist, um die Möglichkeit von RET zwischen dem Luminophor und dem entsprechenden Fluorophors zu minimieren. Nach Inkubation und Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen, die Biotin-markierten Bakterien werden dann entweder mit Streptavidin-konjugierter QD705 oder nicht funktionalisierte QD705 als Kontrolle, die Lösungen unterteilt und einen Satz weiterer Waschungen zur Entfernung belichtet einem nicht haft ausgesetzt QD705. Hier für alle vier Bedingungen, die resultierende Lumineszenz wurde unter der Gesamt Licht, 490-510 nm, beobachtet eind von 710 bis 730 nm-Filter, wobei nur die letzteren zwei Filter für die Datenanalyse verwendet. Die Anwesenheit des QD705 wurde mit 450-480 nm Anregungs-und 710 bis 730 nm Emissionsfilter verglichen. Nach der Untersuchung haben wir wenig bis gar kein Unterschied in rot-verschobene Signal gefunden, wenn die Lösungen in einem ungewaschenen Zustand (Abbildung 3) links. Das resultierende Fluoreszenzsignal unter dieser Bedingung wird auch gefunden, ganz ähnlich zu sein, was darauf hindeutet, dass eine gleiche Anzahl von QD705 sowohl unter die gezielte und nicht gezielte Zustand vorhanden war. Waschen der Proben, um alles ungebundene QD705 entfernen stellt jedoch eine fast zweifache Erhöhung der relativen Rot-Signal für die Zielbakterien im Vergleich zu ihren nicht-zielgerichteten Kontrolle. Untersuchung durch Fluoreszenz kann verwendet werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit des QD705 überprüfen. Vergleichsweise führte die gezielte gewaschen Zustand in einem Fluoreszenz-Intensität, die fast dreimal weniger als die ungewaschenen Zustand, aber die resultierende Rotverschiebung nur vermindert war30%, was darauf hindeutet, daß unter Bedingungen gebunden lediglich die Ausrichtung der Bakterien führt zu einer Erhöhung in den roten Bereich verschobenen Emission führen. Dies impliziert stark den Nutzen der gezielten FUEL für zukünftige Anwendungen.

Figur 1
1. Ein Kraftstoff Wechselwirkung zwischen Leuchtbakterien und kommerziell erhältlich Quantenpunkte führt zu einer Zunahme der roten Photonenproduktion. Zwei spektrophotometrischen Küvette wurden mit Lösungen, die 100 &mgr; l Aliquots von frischer V. gefüllten fischeri Kultur mit einer OD600 von 1-1,5, 895 ul PS und entweder 5 ul QD705 oder physiologischer Kochsalzlösung (PS), bevor sie in einem IVIS Spectrum und dem Emissionsspektrum erfasst platziert. Eine signifikante Zunahme der roten Signal infolge der Anwesenheit erreichtdie QD705, wie durch die Zunahme der detektierten Photonen • sec -1 • cm -2 (p • s -1 • cm -2) gegenüber dem Steuer unter dem 710-730 nm-Emissionsfilter (A) zu verzeichnen. Hier weist die Doppelmembran der Bakterien schließt die Wechselwirkung der Leuchteinheiten (blaue Kreise) und die QD705 (schwarze Kreise). Erstere werden nur in dem bakteriellen Zytoplasma, während der letztere frei in der Masse der Lösung (B) verteilt. N = 3 für jeden Bakterienlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Nachweis der FUEL über Strecken kpl vorkommendenetely außer-Resonanz-Energietransfer. Spektrophotometrische Küvetten wurden mit Lösungen, die entweder 50 ul QD705 und 950 &mgr; l physiologischer Kochsalzlösung (PS) oder 97,2 ul nicht-fluoreszierenden Polystyrol-Mikrokügelchen 48 nm und 902,8 ul PS gefüllt und in gleichen Abständen auf gegenüberliegenden Seiten platziert einer zentralen schwarzen Küvette mit 1 ml frischem Leucht Photobacterium sp bei einer OD 600 von 1-1,5. Die zentrale Küvette hatte zwei identische optische Fenster, durch die die emittierten Photonen frei zu verteilen. Erfassen von Bildern in einer Entfernung (D) im Bereich von 1,0 cm bis 3 cm, die beobachtete Herstellung von rotem Licht verringert als Funktion der Abstandsanzeige Beweis, daß Kraftstoff in Abständen von Resonanzenergietransfer nicht erreichbar auftreten. Die Intensität schien D -2 Abhängigkeit, ähnlich dem Abstandsquadratgesetz (links) haben. Das gleiche Protokoll wurde für E. gefolgt coli (rechts). Die daraus resultierenden Trendlinien halten Form mit dem Konzept that die Bakterien werden als Punktlichtquellen wirken. Eine Gesamtzahl von drei unabhängigen Abstandsmessungen wurden jeweils unter Verwendung einer einzigartigen Subkultur erworben. Fehlerbalken vorhanden sind, an jedem Punkt. In einigen Fällen waren die Fehlerbalken kleiner als die verwendeten Symbole, die die normierte Intensität zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig. 3
Abbildung 3. Ein Vergleich zwischen gezielten (spezifischen) und nicht-zielgerichtete (Groß Lösung) FUEL. K. pneumoniae wurden mit biotinylierten Antikörpern funktionalisiert und dann entweder mit Streptavidin markiert (gezielte) oder nicht markierten (nicht gezielte) QD705 ausgesetzt. Die resultierenden Lösungen wurden ebenso diviDED und ein Satz mit PBS dreimal gewaschen, bevor er in seine Anfangsvolumen in PBS resuspendiert. Die Lösungen wurden dann in die einzelnen Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Platte und der unter den 490 bis 510 nm (500 nm) und von 710 bis 730 nm (720 nm) Emissionsfilter (als blaue Balken dargestellt) beobachtet Biolumineszenz verzichtet. Die p • s -1cm-2 aus der 720-nm-Filter für jeden gut gefunden wurde, durch den jeweiligen p • s -1 • cm -2 Biolumineszenz-Intensität von der 500 nm des gleichen auch normalisiert. Die relative Fluoreszenzintensität von einem Epifluoreszenz Anregung resultierenden wurde mit 450-480 nm Anregungs-und 710 bis 730 nm-Emissionsfilter (als rote Balken dargestellt) bestimmt. Wenig bis kein Unterschied in der Biolumineszenz-oder Fluoreszenzsignal wurde unter den Bedingungen ungewaschenen (Non-Targeted ungewaschen und gezielte ungewaschen) beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die gebundenen und frei schwebenden QD705 waren gleichermaßen von den Biolumineszenz-Photonen aufgeregt. Nach dem Waschen nAnfang eine zweifache Differenz in relativen Rot-Signal wurde für die QD705-markierten Bakterien (gezielte) gewaschen Vergleich zur Kontrolle (nicht gezielte Gewaschene) beobachtet. Das Fehlen von QD705 in der Non-Targeted Washed wurde durch das Fehlen von Fluoreszenzsignal bestätigt und verifiziert die QD705 Kennzeichnung im Gezielte Washed Staat. Die Daten werden von vier unabhängigen Kulturen von K. pneumoniae. Für Klarheit, die Legende zeigt die Quelle der Anregung QD705. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

width: 108px; "> Alexa 700 height: 22px; width: 108px; "> QD800
Fluorophor Konzentration ul PS (ul) λ max ex / em (nm) Emissionsfilter (n m)
Alexa 555 37,2 uM 4,77 995,23 555/565 570-590
Alexa 568 37,2 uM 4,77 995,23 578/603 590-610
Alexa 633 37,2 uM 4,77 995,23 632/637 650-670
37,2 uM 4,77 995,23 702/723 710-730
Nicht-fluoreszierende 2,62% Feststoffe 9,72 990,28
μSph Rosa 5% Fest 4,77 995,23 580/605 610-630
μSph Gelb 5% Fest 4,77 995,23 505/515 510-530
QD705 2 uM 5 995 465/705 710-730
2 uM 5 995 465/705 790-810

Tabelle 1. Eigenschaften der Fluorophore in den FUEL Demonstrationen eingesetzt.

<td> 6.05 x 10 4
Kontrolle Filter Fluorophor Kontrolle p-Wert
p · s -1 · cm -2 SD p · s -1 · cm -2 SD
A555 PS 580 1,08 x 10 7 3,31 x 10 6 9,09 x 10 6 1,75 x 10 6 0.233
A568 PS 600 8,47 x 10 6 4,23 x 10 6 4.49 x 10 6 9,71 x 10 5 0,094
A633 PS 660 2,40 x 10 6 1,25 x 10 6 7,85 x 10 5 2,39 x 10 5 0,046
A700 PS 720 5,53 x 10 5 2,46 x 10 5 1,54 x 10 5 0,026
MSPH Gelb Nicht-fluoreszierende μspheres 520 1,19 x 10 8 4,85 x 10 7 5,79 x 10 7 1,99 x 10 7 0.057
MSPH Rosa Nicht-fluoreszierende μspheres 620 2,37 x 10 7 1,36 x 10 7 2,16 x 10 6 8,00 x 10 5 0,026
QD705 Nicht-fluoreszierende μspheres 720 1,76 x 10 7 7,33 x 10 6 2,08 x 10 5 7,16 x 10 4 0,007
QD800 Nicht-fluoreszierende μspheres 800 7,79 x 10 6 4,72 x 10 6 3,60 x 10 4 1,52 x 10 4 0,023

Tabelle 2. Identifizierung der Fluorophore und fluoreszierende Nanopartikel mit FUEL kompatibel.

Discussion

Die fundamentale Demonstration der FUEL kann einfach durch Mischen mit Leuchtbakterien fluoreszierende Nanopartikel oder Quantenpunkte erreicht werden. Die beiden Elemente werden physisch getrennt und bleiben über jeden effizienten RET Distanz. Schwieriger ist die Kraftstoffsignal Optimierung sowohl in vitro als auch in vivo. Unter in vitro Bedingungen, mit und ohne einem vorhandenen optischen Absorber, üblicherweise die Zugabe eines Überschusses Fluorophor ausreicht, um das Brennstoffverhalten zu maximieren. Bei hohen Konzentrationen Phänomene wie statische oder Stoßlöschung kann zu einem Verlust der Fluoreszenzsignal führen. Durchführen einer Verdünnungsreihe durch unabhängiges Variieren der Konzentration der Leuchtquelle und dem Fluorophor wird helfen, die gewünschten Konzentrationen zu optimieren. Der Aufbau und die Optimierung von FUEL unter in vivo-Konzentrationen ist viel schwieriger und muss auf einer Fall-zu-Fall-Basis behandelt werden. Es kann schwierig sein, ein Co erstellenndition wo die fluoreszierenden Einheit kann optisch durch die Leuchtquelle genutzt werden. Als solche kann beginnend mit Injektionen direkte Zusammenarbeit der beiden Gruppierungen geben Auskunft über den Erfolg der FUEL unter optimalen Bedingungen.

Standard-Protokolle existieren zum Etikettieren Bakterien und eukaryontische Zellen mit fluoreszierenden Einheiten wie die Alexa Serie und QD. Oft erfordert dies Funktionalisierung von Oberflächen oder Aktivierung mit Antikörpern, die zu unerwünschten Wirkungen wie die Lebensfähigkeit der Zellen reduziert oder verändert Stoffwechselaktivität führen kann. Um dies zu überwinden, ist es wichtig zu bestimmen, die optimale Menge des Antikörpers oder Aktivierungsmittel benötigt, die zellulären Störungen minimiert und maximiert die Fluoreszenzmarkierung. Die Verwendung von Quantenpunkten ist wegen ihrer charakteristischen breiten Anregungsspektren, schmal und abstimmbare Emissionsspektren und der Möglichkeit, eine große Stokes-Verschiebung von Vorteil. Allerdings können QDs zytotoxischen und nicht wünschenswert sein kann in einigen Fällen.

13 vorhanden ist, und ist für eine Vielzahl von Lumineszenz-und Fluoreszenzquellen. Bis jetzt wurden die Photonen von FUEL resultierenden als das Produkt von nicht-spezifischen Wechselwirkungen oder einem unglücklichen Hintergrundsignal von schlecht gestalteten BRET Experimente ergeben. Es ist nur mit der Art von Experimenten zeigte, dass hier konnten wir die Nützlichkeit dieses unerwünschte Signal zu identifizieren. In den gezeigten Beispielen verhalten sich die Leuchtbakterien als diffuses Anregungsquelle, die zur Auslösung einer Standardfluoreszenzantwort von einer Vielzahl von Fluoreszenzeinheiten. Außerdem ist es aufgrund der erheblichen Arbeitsabstand, ist es sicher zu dem Schluss, dass, während Kraftstoff kann ohne das Auftreten von BRET konstruiert werden, im allgemeinen BRET kann nicht ohne eine Beteiligung FUEL beobachtet werden. Wichtig ist, dass aufgrund des Fehlens eines Zielanforderung kann Brennstoff verwendet, um die räumliche Lücke zwischen BRET und c besteht abzudeckenonventional ganze Tier-Bildgebungsverfahren.

Disclosures

Die Autoren erklären, konkurrierenden Interessen. JD, SB, KLR und SLS beigetragen Europäischen Patent EP10290158.4 und der Weltorganisation für geistiges Eigentum Patentanmeldung WO/2011/117847.

Acknowledgements

Die Autoren möchten ihre Dankbarkeit für die finanzielle Unterstützung aus dem Pasteur-Stiftung in New York, um JD, AH erstrecken (JD, CS, CS), der EU-FP7-Programm "Automation" (SLS), dem Institut Carnot Programm 11 ( , AR, RT, SLS) und Projekt IMNOS (RT, SLS), der Conny-Maeve Charitable Foundation (SLS), die European Masters in Molecular Imaging (IT), der Region Ile-de-France-Programme MODEXA (SLS), SESAME (SLS) und DimMalInf (SLS, RT), der ANR-Programm Grandes Investissement de l'avenir Infrastrukturen Nationales de Biologie-Santé: Frankreich LifebioImaging (FLI) Frankreich Life Imaging (RT, SLS), Frankreich Bioimaging (JD, SLS) und der Institut Pasteur in Paris. Außerdem möchten die Autoren zu danken für Reagenzien, José Bengoechea und Herbert Schweizer. Weiterhin würde die Autoren gerne Cindy Fevre, die die Antikörper erzeugt danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon  kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer
Klebsiella pneumoniae 52145  52145 is a serotype K2 reference strain
Luria Bertani (LB)  standard growth media
Q-Tracker 705  Life Sciences Q21061MP
Q-Tracker 800 Life Sciences Q21071MP
Alexa 555 Life Sciences S21381
Alexa 568 Life Sciences S11226
Alexa 633 Life Sciences S21375
Alexa 700 Life Sciences S21383
Non-fluorescent microspheres Polysciences, Inc 15913
Pink microspheres Life Sciences F8887 40 nm diameter
Yellow microspheres Life Sciences F8888 40 nm diameter
Ivis Spectrum PerkinElmer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific Pierce 21425
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Scientific Pierce 21425
HABA assay kit  Thermo Scientific Pierce 28005
Bradford assay Bio-Rad 500-0201

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References

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