כימות יחיד כלי דם קטנים בחדירות מבודדת-perfused דם עכברוש ריאות הכנה

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

הכנת ריאות perfused הדם המבודדת עושה את זה אפשרי לדמיין רשתות microvessel על פני הריאות. כאן אנו מתארים גישה לכמת חדירות של microvessels אחת ריאות מבודדות באמצעות דימות פלואורסצנטי זמן אמת.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kandasamy, K., Parthasarathi, K. Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation. J. Vis. Exp. (88), e51552, doi:10.3791/51552 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הכנת ריאות perfused דם המבודדת נעשתה שימוש נרחב כדי לחזות ולהגדיר איתות בmicrovessels אחת. על ידי צימוד הכנה זו עם הדמיה בזמן אמת, הוא הופך להיות אפשרי כדי להבחין בשינויים בחדירות microvessels ריאה בודד. במסמך זה אנו מתארים את שלבים לבודד את ריאות עכברוש וינקב אותם עם דם עצמי. לאחר מכן, אנו מתארים את צעדים להחדיר fluorophores או סוכנים באמצעות microcatheter לאזור ריאות קטן. שימוש בהליכים אלה תוארו, קבענו עליות חדירות בmicrovessels ריאות עכברוש בתגובה לחליטות של lipopolysaccharide חיידקים. נתוני המחקר מראה כי lipopolysaccharide מוגבר דליפת נוזל על פני שני מגזרי venular וmicrovessel נימים. לכן, שיטה זו מאפשרת להשוות בין מגזרי תגובות חדירות כלי דם ובכך, מגדיר את ההטרוגניות כל בתגובה. בעוד שיטות נפוצות המשמשות להגדרת חדירות ריאות דורשות postprocessing של דגימות רקמת ריאה,שימוש בהדמיה בזמן אמת מבטלת דרישה זו באה לידי ביטוי החל מהשיטה הנוכחית. לכן, הכנת הריאות המבודדת בשילוב עם הדמיה בזמן אמיתי מציעה מספר יתרונות על פני שיטות מסורתיות לקביעת חדירות כלי הדם ריאה, עדיין היא שיטה פשוטה כדי לפתח וליישם.

Introduction

חדירות כלי הדם מוגברות לריאות מובילה להתפתחות של בצקת מכתשיים וחילוף גזים שנפרצו והוא מאפיין עיקרי של פגיעה חריפה ריאות (עלי) 1-3. לפיכך, הערכות של חדירות כלי דם חשובות בהגדרת היקף פציעת ריאות ויעילות של התערבויות טיפוליות מוצעים. ניתוח gravimetric כגון יחס דם ריאה בחינם רטוב ליבשים ומקדם סינון כלי הדם נמצא בשימוש נרחב בשיטות להעריך 4,5 חדירות. שיטות אחרות כוללות כימותי השמירה של בדיקות רדיואקטיביים או ניאון ברקמת הריאה 6-8. עם זאת, השיטות הנ"ל דורשות עיבוד postexperiment של דגימות רקמת ריאה לכיוון הבהרת נתוני חדירות. יתר על כן, מאחר שבעל חיים אחד יכול לשמש רק לפרוטוקול טיפול יחיד, ייתכן שיהיו צורך מספרי חיה גדולים למחקר מלא. מאפיין משותף של השיטות הנ"ל הוא שהם קובעים את חדירות כלי דם הממוצעת שלכל כלי הדם בדגימת הרקמה. עם זאת, הוא מבוסס היטב כי כלי מאקרו מיקרו וריאה שונים 9 phenotypically. לפיכך, תגובות חדירות עשויות להיות הטרוגנית בין המגזרים השונים, כמו גם כלי 9,10. לפיכך, כימות חדירות ממוצעת של כל כלי ריאתי בדגימת רקמה עשוי שלא משקפת באופן נאות את ההטרוגניות הזאת.

בהכנת ריאות perfused דם המבודדת, ניתן דמיינו כלי דם על פני השטח הריאה על ידי מיקרוסקופ זקוף 4,11,12. זה מאפשר תגובות אפיון בכלי אחד, ולכן, פונה ההטרוגניות כל בתגובות 13. בנוסף לכך, על ידי ניצול דימות פלואורסצנטי של microvessels, ניתן לשלב מבחני הקרינה מבוססת. יתר על כן, microcatheter פרוזדורי שמאל יכול לשמש כדי לספק סוכנים ובדיקות הקרינה לכלי דם 11,14. Microcatheter מגביל את המשלוח לאזור ריאות קטן, ובכך לשעברפוזות רק את כלי דם באזור לסוכנים וfluorophores רוויי. זה מאפשר אזורים קטנים מרובים בתוך אותה הריאה שישמשו לניסויים נפרדים, מה שמוביל לירידה כוללת בבעלים החיים הנחוצים למחקר.

הדמיה בזמן אמת מאפשרת לכידה של שינויים דינמיים בכלי דם וקרינת extravascular של microvessels היחיד של הכנת הריאות המבודדת. לכן, עבור כל דם קטן בתוך שדה תמונה, שינויים בקרינה במהלך העירוי של fluorophores וwashoff יכולים להיות מוקלטים, ולכמת מחובר 14. שימוש בערכים של הקרינה כלי דם המרבית ושייר, ניתן לקבוע מדד חדירות לכל דם קטן בתחום ההדמיה. כדי לקבוע שינויי חדירות בתגובה לסוכנים דלקתיים או פוגעניים, הסוכן הרצוי יכול להינתן ראשון ולאחר מכן מדד החדירות נקבע. בנוסף, שדה התמונה ניתן להגדיר בכל מקום באזור הריאות רווי ידיmicrocatheter, ובכך מאפשר רמה גבוהה של גמישות בבחירת רשת כלי הדם הרצויה. לכן, ההכנה המבודדת-perfused דם הריאה בד בבד עם הדמיה בזמן אמת מספקת מודל ניסיוני אטרקטיבי לכמת חדירות בmicrovessels ריאה אחת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים שבוצעו בבעלי חיים כפי שאושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת טנסי למדעי בריאות במרכז.

1. Tubing תכשירים מרוססים עכברוש ריאות

  1. הכן את מערכת צינורות עם צינורות Tygon (# 18) לזלוף דם כפי שמוצג באיור 1. חבר מתמרים ללחץ (P23XL) ולמקם את צינורות על הבמה מיקרוסקופ.
  2. הגדרת טמפרטורת אמבט מים עד 37 ° C.
  3. חבר את כניסת הריאות ולשקע באופן זמני עם צינור Tygon.

איור 1
איור 1. צינורות טפטוף דם. סכמטית מציגה את התקנת צינורות המשמשת למחזור הדם דרך הכנת ריאות המבודדת. כמו כן ציינו הם הרכיבים הקשורים שדרכו אני צינורותשל מנותב. סכמטי של הלב והריאות כלול להראות אתרים של חיבור בין צינורות ועורק ריאה (הרשות הפלסטינית), והשאיר את פרוזדורי צינורית (LA) (כחול קווים מקווקווים).

2. הכנת ריאות חולדה מבודדות

  1. הרדימי חולדות (חולדות זכרים ספראג-Dawley; 250-300 גר ') עם קטמין (80-100 מ"ג / קילוגרם) ועם xylazine (5-10 מ"ג / קילוגרם). לאחר שווידאת מטוס של הרדמה כירורגית, מקום חי במצב שכיבה.
  2. לבצע ההנשמה, הכנס צינורית לקנה הנשימה (PE-90) ובטוח עם תפר כירורגית.
  3. להשרות הפרין (100-200 U) ללב על ידי לנקב לב (21 מחט פרפר G), לחכות ל60 שניות ודם לגרום לדימום מחודש (~ 12-15 מיליליטר דם).
  4. הכן שתי קנולה (צינור Tygon, בקוטר 3 מ"מ; ארוכה 4 סנטימטר; מתרחבת בקצה אחד) ולמלא עם מי מלח.
  5. לבצע פתיחת בית החזה. עושה חתך (3 מ"מ) בחדר ממני והחלק את הסוף התלקח של צינורית לתוך החתך לכיוון הריאותעורק. Secure צינורית לעורק ריאה עם תפרים כירורגית.
  6. לחתוך (3 מ"מ) את שיאו של החדר השמאלי והחלק את הקצה התלקח של הצינורית השנייה לתוך החתך. להנחות את הצינורית לתוך אטריום השמאל. Secure צינורית לחדר השמאלי עם קלטת טבור (2 מ"מ רוחב).
  7. לנתח את כל רקמת חיבור, ולהסיר את הריאות ולב, יחד עם קנולה המצורפת. הנח ריאות ולב בצלחת פטרי. למקם מחדש את הריאות, כך שמשטח סרעפתי הוא על העליונה. שלוש קנולה לצריכה להתמודד לאותו כיוון.
  8. מניחים את הכנת הריאות בשלב שניתן להשפיע בכיווני XY. כל שלב שמגיע עם מיקרוסקופ יכול להיות שונה כדי להחזיק את צינורות או שלב מחוייט שנבנה, במידת הצורך.

3. זלוף הדם של ריאות חולדה מבודדות

  1. מערבבים את דם exsanguinated עם אלבומין שווה נפח (5%) פתרון ולהוסיף למאגר. הפעל את משאבת peristaltic ולהגדיר זרימת rאכלתי ל14 מיליליטר / דקה. מאפשר לדם למלא את צינורות.
  2. עם המחלף פתוח, להסיר את מחבר כניסה-לשקע ריאות הזמנית. צרף את עורק הריאה וצינורית פרוזדורי שמאל לכניסת הריאות ולשקע, בהתאמה. ודא שאין בועות אוויר בצינור.
  3. חבר את הצינורית לקנה הנשימה למתמר לחץ שלישי (P23XL). לנפח את הריאות בחמצן 30% באמצעות הצינורית לקנה הנשימה ולשמור על לחץ ב5 סנטימטר H 2 O.
  4. סגור את המחלף עם מהדק להתחיל זלוף ריאות. לשמור על עורק ריאה ולחצי פרוזדורי שמאל ב ~ 10 ו3 ס"מ H 2 O, בהתאמה.

4. הכנת ריאות לכלי דם עירוי

  1. הרם את חלקו האחורי של צינור הארכה לקטטר מעל לרמה של הריאות ומאובטחות.
  2. הכן את צנתר עירוי על ידי הוספה כ 30 סנטימטר של צינורות PE10 ארוכים 40 סנטימטר לתוך צינורות PE90 ~ ארוכים 30 סנטימטר. חבר את הקצה החשוף של צינורות PE10 למחט (30 G) בשעהtached למזרק (1 סמ"ק).
  3. הכנס את שילוב קטטר לתוך חלק אחורי המורם של צינור הארכה. מדריך שילוב הצנתר דרך אטריום השמאל ולתוך הריאות עד שהוא פוגש את ההתנגדות. ואז, לדחוף את הקטטר PE10 לבד יותר לתוך הריאות עד שהוא פוגש את ההתנגדות. שים לב שהפעלת כוח מופרז בעת החדרת הצנתר תפגע הריאות.
  4. מלא את מזרק 1 סמ"ק עם הפתרון של רינגר ולצרף למשאבת מזרק. הגדרת קצב עירוי ל10 μl / min.
  5. אתר עירוי יהיה חיוור בהשוואה לשאר הריאה.
  6. ללחלח את הריאות עם מי מלח ולכסות את הריאות בניילון עם חור גדול מספיק כדי לעזוב את אתר העירוי נחשף.
  7. ספוגית קצת שומן ברזלים על החלק התחתון של O-Ring (מחוייט) ומקום coverslip זכוכית (# 1.5, 22 קוטר מ"מ) בחלק התחתון של טבעת O-. בעדינות עמדת O-הטבעת עם coverslip באתר העירוי. אבטח את O-הטבעת עם חול מבחנה סטנדרטידר. Coverslip / שילוב טבעת O לא לעוות את מבני מכתשיים מתחתיו, כפי שדיווח לאחרונה 15.
  8. מקם אובייקטיבי (20X) של מיקרוסקופ פלואורסצנטי מעל O-Ring ולהתמקד על פני הריאות.

5. ההדמיה פלורסנט Dextran מעבר דרך microvessels

  1. הכן את המיקרוסקופ לתפרחת FITC ההדמיה.
  2. בחר אזור להיות צילם ולרכוש תמונות בשיעור של 1/minute באמצעות תוכנת רכישת תמונה.
  3. להתחיל עירוי של 20 KD FITC-dextran (0.5 מ"ג / מיליליטר) באמצעות משאבת המזרק. הקרינה בכלי דם תעלה בהדרגה ולהגיע למקסימום. המשך עירוי ל60 דקות.
  4. ואז לעבור לעירוי של רינגר כדי לשטוף את הקרינה של אור. לשמור על עירוי במשך 10 דקות. המשך רכישת תמונה ב1/min במהלך לשטוף-off.

6. ניתוח תמונה

  1. פתח את קובץ תמונת רכישה.
  2. אזורי מקוםשל ריבית על פני microvessels בתוך מסגרת התמונה.
  3. נגן את קובץ תמונת מסגרת לפי מסגרת ולהקליט את עוצמת הקרינה בכל אזור של עניין לכל המסגרות.
  4. מגרש את השינוי בעוצמת הקרינה לכל אזור של עניין כפונקציה של זמן.
  5. לכמת את עוצמת הקרינה המרבית ואת עוצמת הקרינה שיורית לאחר 10 דקות של washoff.
  6. לחשב את היחס מרבי לעוצמת הקרינה שיורית בכל אזור של עניין כדי לקבל את מדד החדירות לmicrovessels הקשורים לאזור זה של ריבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הכנת ריאות מבודדת-perfused דם המחובר לצינורות טפטוף והציוד נלווה מוצגת באיור 2. למטרות הדגמה, השתמשנו עכברוש ספראג Dawley, אם כי ההליכים המתוארים במסמך זה יכול לשמש עם כל מיני עכברים. חליטות דרך microcatheter פרוזדורי שמאל להגיע לאזור קטן בלבד של הריאות. האזור רווי יכול להיות מזוהה על ידי שינוי הצבע-Induced עירוי (איור 3). הכנת הריאות כמיקום עבור הדמיה בזמן אמת מוצגת באיור 4.

איור 2
איור 2. מבודד הכנת ריאות perfused דם. תצלום מראה ריאות עכברוש מבודדות מחוברות לצינורות טפטוף וperfused עם דם עצמי. שים לב שעל פני השטח סרעפתי של הריאות עומדים בפני מילcroscope אובייקטיבי.

איור 3
איור 3. אזור עירוי Microcatheter. Microcathether המוכנס דרך אטריום השמאל שימש להחדיר הפתרון של רינגר להכנת הריאות. צילום מראה את האזור של ריאה השמאלית (עיגול) שקיבלה העירוי של רינגר. כעירוי של רינגר מחליף את הדם דרך כלי מרוססים, האזור רווי מופיע חיוור בהשוואה לאזורי ריאה האחרות. שים לב שהעירוי של רינגר מוגבל לאזור מסומן בבירור קטן של הריאה.

איור 4
איור 4. עמדת הדמיה להכנת ריאות מבודדת. Sho התמונהws הכנת ריאות מבודדת ממוקמת תחת מיקרוסקופ האובייקטיבי מוכן הדמיה. שים לב שעל פני השטח הריאות מכוסה בניילון נצמד כדי לשמור על פני שטח הריאות לחים. O-Ring שומר אופקי משטח ריאות במהלך הדמיה.

במחקר זה, אנו קובעים שינויים בחדירות כלי דם בתגובה לטיפולים עם lipopolysaccharide חיידקים (LPS; סרוטיפ 0111: B4), מודל בשימוש נרחב של עלי. לקראת זה, אנו חדורים LPS (100 מיקרוגרם / מיליליטר) לתוך microvessels ל30 דקות אחרי השטיפה של רינגר ל60 דקות 11. אז אנחנו חדורים dextran FITC 20 KD לכמת את מדד החדירות. הקרינה FITC שיורי הייתה נמוכה בmicrovessels טופל ברינגר, אבל גבוהה באלו שטופלו עם LPS (איורים 5 א ', ד'). יתר על כן, בהשוואה לעירוי של רינגר, עירוי LPS, גרם לירידה משמעותית במדד חדירות, המצביעה על גידול עולמי בחדירות בכל הכלים בתוך להרגיש תמונהד (5E איור). מדד החדירות לכמת בנפרד עבור venules ונימים הציע כי עליית החדירות-Induced LPS הייתה נמוכה יותר בvenules מאשר בנימים, אם כי ההבדל לא היה מובהק (איור 5F).

איור 5
איור 5. LPS מגביר חדירות כלי דם. טופלו microvessels ריאה עם או רינגר או LPS (100 מיקרוגרם / מיליליטר) ל30 דקות. לאחר 60 דקות, FITC dextran 20 KD היה חדור ואחרי השטיפה של רינגר ושינויי הקרינה שנתפסו על ידי הדמיה בזמן אמת. אז מדד החדירות של כלי דם באזור המטופל של הריאה נקבע כיחס המרבי לקרינת dextran FITC שיורית. תמונות לספירה) מראות מרבי (A, C) ושיורים (B, D) FITC פלואורידescence בmicrovessels ריאות Ringer's-(A, B) וטופל LPS (C, D). עירוי LPS) E ירד מדד החדירות באופן משמעותי בכל מגזרי הכלי בתוך מסגרת התמונה. טיפול F) LPS גרם לירידה במדד בחדירות שתי venules והנימים (* p <0.05 לעומת השליטה של ​​רינגר; חזרו שלוש פעמים כל אחד; ממוצע ± SEM). נימים (כובע) וvenules (ven) זוהו על ידי ממדי כלי המתקבלים מתמונת brightfield נתפסה לפני העירוי של dextran FITC 20 KD. תמונות המוצגות הן חלק חתוך של מסגרת תמונת מיקרומטר 850 x 850. n = מספר הכלים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הכנת הריאות המבודדת-perfused הדם בשילוב עם הדמיה בזמן אמת מספקת כלי פשוט לקביעת שינויים בחדירות microvessels ריאה אחת. אנחנו מוחלים בשיטה זו כדי להגדיר שינויי חדירות בתגובה לחליטות של LPS. הנתונים שלנו מראים בבירור כי עירוי LPS גרם לעלייה בחדירות כלי הדם. יתר על כן, הנתונים גם מצביעים על כך ששינויי חדירות הנגרמים על ידי LPS היו דומים בשני venules ונימי דם. לכן, יתרון גדול של שיטה זו הוא היכולת להגדיר leakiness של microvessels אחת, כמו גם רשת גלובלית של כלי דם. בהתחשב בכך שטכניקה זו גם תשואות שינויי חדירות גלובליות, ניתן להשוות את הערכים הללו עם זו המתקבלת בשיטות אחרות בשימוש נפוץ, כגון ניתוח gravimetric. לפיכך, השיטה הנוכחית מאפשרת גם השוואה של מידע דליפת נוזל כלי הדם עם זה שדווח במחקרים אחרים.

בהשוואה לשימוש נרחב יותר בטכניקות כדי לקבוע שינויים בחדירות כלי דם, בזמן אמת בשיטת הדמיה המבוססת לא דורש postprocessing של דגימות רקמת ריאה. של החזקת fluorophore המידה הוא נתפס במהלך העירוי וwashoff הבא של fluorophore. זה בבירור מבטל שמירת דגימות רקמה ואת כל שגיאות הקשורות לטיפול שלהם. בנוסף להקמת חדירות microvessel בודדות באמצעות מדד החדירות, השיטה הנוכחית גם מאפשרת להגדיר את גודל גידול הקרינה נותב, הטבע פאזית לשיעור שינוי של הקרינה נותב, וקצב דעיכת הקרינה נותב במהלך לשטוף. יכולים להיות מנוצלים פרמטרים נוספים אלה כדי להשוות את תגובות לטיפולים שונים, כמו גם הבדלים בין מגזרים בmicrovessels, כפי שתוארו בדוח הקודם שלנו 14.

במסמך שתארנו נהלים לקביעת שינויים בחדירות בתגובה דלקתיתסוכן מועבר על ידי עירוי של כלי דם. עם זאת, ניתן להתאים את הנהלים על מנת לקבוע לסוכנים מועברים על ידי מסלולים אחרים, כמו גם שינויים בחדירות. לפיכך, קבענו בעבר עליות חדירות microvessel לחומצה מועברות על ידי החדרת מכתשיים 14.

כפי שעולה מצילומי הריאות, שיטת מסירת microcatheter מבוססת מגבילה את המוצר מועבר לאזור קטן של הריאה. לפיכך, על ידי המניפולציה של microcatheter לאזורי ריאה שונים, סדרה של ניסויים יכולה להתנהל באותה הריאה. לכן, בשיטה זו יש השפעה משמעותית על מספר בעלי החיים הדרושים למחקר מלא. הנתונים במחקר זה ומחקרים אחרים דיווחו שמנוצלים חליטות מרובות באותו הריאות 4,11,12,14,16. אמנם אין הבדלים בתגובות מהאזורים השונים ניכרו עקב סחרור אפשרי של סוכני חדורים באמצעות perfusate במחקר הנוכחי, את האפשרות הזאת צריכה להיות חסרונותidered בעיצוב ניסיוני. וכך, כאשר ניצול אזורים שונים של אותו הריאה לניסויים, זה עשוי להיות מועיל כדי לקבוע אם חדירות בסיסיות היא דומות באזורי הריאה השונים.

ההצלחה של השיטה הנוכחית תלויה באופן קריטי על הגדרת הכנת ריאות perfused היטב. הכנת הריאות צריכה להיות בצבע אחיד, ללא כל כתמים אדומים, נוזל שיוצא מהצינור לקנה הנשימה, דליפת דם, או לחצים גבוהים ריאתי עורקים, אשר כולם מצביעים על ריאות פגומות. יתר על כן, יש להיזהר בעת החדרת microcathether לתוך הריאות, כפי שאלץ את ההכנסה יוביל לניקור ורדיד ונזק של הריאות.

ההדמיה הווה מגבלות שיטת ריאות ללא פגע לכלי צדר וsubpleural, ובכך מאפשרת הערכות חדירות מרק קבוצת משנה של כלי ריאתי. להדמיה של כלי עמוק יותר, הדמיה מיקרוסקופית שני פוטונים עשויה להיות חלופה אפשרית. להכניסיון של microcatheter באמצעות חליטות גבולות צינורית פרוזדורי שמאל לvenules ונימי דם בכיוון המדרדר. דרך אפשרית כדי לשלול מגבלה זו תהיה להכניס את הצנתר דרך צינורית עורק ריאה. השינוי היחיד שנדרש להליך חלופי זה הוא לצרף צינורות הארכה לקטטר בצד מפרצון ריאות.

נהלים אלו פותחו באמצעות ריאות החולדה כמודל. עם זאת, ניתן להשתמש באותם צעדים עם כמה שינויים קלים כדי לקבוע שינויים בחדירות microvessels ריאות עכבר. עבור ניסויי ריאות עכבר, אגוניסט ונותב ניתן להוסיף לperfusate והחדירות לכימות דומה כמו לזה של ריאות חולדה. יתר על כן, נותב הקרינה שונה ניתן להחליף כדי להתאים את היכולות של המיקרוסקופ של המשתמש. גודל מולקולת dextran ניתן לשנות בהתאם לגודל הצפוי של עליית חדירות-Induced אגוניסט וצריך להיות החליטהמבוסס על נתונים מניסויים ראשוניים. לפיכך, הכולל הכנת הריאות המבודדת יחד עם דימות פלואורסצנטי מספקת כלי רב עוצמה כדי לקבוע חדירות כלי שייט יחידה במודלים של בעלי חיים רגילים שלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחקרים שנתמכו על ידי NIH HL75503 לתהליך קימברלי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tygon Tubing Fisher Scientific #18
Pressure Transducer Data Sciences International P23XL Need quantity 3
Butterfly Needle Greiner Bio-One 450081 21 G
Peristaltic pump Cole Parmer Masterflex L/S
PE-90 tubing Becton Dickinson 427421 30 cm needed
PE-10 tubing Becton Dickinson 427401 40 cm needed
Syringe Pump Braintree Scientific BS8000
O-ring Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure O-ring to holder
Upright fluorescence microscope Olympus America BX61WI
Image Acquisition Software Molecular Devices Metamorph
FITC Dextran 20KD Sigma Aldrich 0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values) 
Lipopolysaccharide Sigma Aldrich Serotype 0111:B4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
  2. Matthay, M. A., et al. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
  3. Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).
  4. Parthasarathi, K., et al. Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries. J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).
  5. Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury. Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).
  6. Gorin, A. B., Stewart, P. A. Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).
  7. Boutoille, D., et al. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).
  8. Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
  9. Stevens, T. Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells. Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).
  10. Ofori-Acquah, S. F., et al. Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions. Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).
  11. Kandasamy, K., et al. Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels. Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).
  12. Kandasamy, K., et al. Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels. PloS One. 8, (2013).
  13. Qiao, R. L., Bhattacharya, J. Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed. J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).
  14. Parthasarathi, K. Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).
  15. Wu, Y., Perlman, C. E. In situ methods for assessing alveolar mechanics. J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).
  16. Kuebler, W. M., et al. A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung. Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics