Kvantifiera Single microvessel permeabilitet i Isolerad Blod-perfusion Rat Lung Förberedelse

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Den isolerade blod-perfusion lunga preparat gör det möjligt att visualisera mikrokärls nätverk på lungytan. Här beskriver vi en metod för att kvantifiera permeabilitet av enskilda mikrokärl i isolerade lungor med hjälp av realtids fluorescens avbildning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kandasamy, K., Parthasarathi, K. Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation. J. Vis. Exp. (88), e51552, doi:10.3791/51552 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den isolerade blod-perfusion lunga preparat används ofta för att visualisera och definiera signalering i enskilda mikrokärl. Genom att koppla denna beredning med realtid bildbehandling, blir det möjligt att avgöra permeabilitetsförändringar i enskilda lungmikrokärl. Häri beskriver vi steg för att isolera råtta lungor och BEGJUTA dem med autologt blod. Sedan vi beskriva åtgärder för att ingjuta fluoroforer eller agenter via en kateter in i en liten lung region. Med hjälp av dessa förfaranden som beskrivs, bestämd vi permeabilitet ökar i råttlungmikrokärl som svar på infusioner av bakteriell lipopolysackarid. Data visade att lipopolysackarid ökad vätskeläckage över både venular och kapillär mikrokärlssegmenten. Således gör denna metod det möjligt att jämföra permeabilitet svar bland kärlsegment och därmed definiera eventuella heterogenitet i svaret. Medan vanligaste metoderna för att definiera lung permeabilitet kräver efterbehandling av lungvävnadsprover, detAnvändning av realtidsavbildning undanröjer detta krav som framgår av föreliggande förfarande. Således, den isolerade preparatet lungan kombinerat med realtid bildbehandling erbjuder flera fördelar jämfört med traditionella metoder för att bestämma lungmikrovaskulär permeabilitet, men är en enkel metod för att utveckla och genomföra.

Introduction

Ökad mikrovaskulär permeabilitet i lungorna leder till utveckling av alveolär ödem och nedsatt gasutbyte och är en viktig egenskap av akut lungskada (ALI) 1-3. Således, uppskattningar av vaskulär permeabilitet är viktiga att definiera omfattningen av lungskada och effekt av föreslagna terapeutiska ingrepp. Gravimetrisk analys såsom blod fri lunga våt-till-torr-förhållandet och mikrovaskulära filtreringskoefficient används allmänt metoder för att uppskatta permeabiliteten 4,5. Andra metoder inkluderar att kvantifiera retentionen av radioaktiva eller fluorescerande prober i lungvävnad 6-8. Emellertid är ovanstående metoder kräver postexperiment behandling av lungvävnadsprover mot belysa permeabilitetsdata. Eftersom ett djur kan endast användas för en enda behandlingsprotokoll stora antalet djur kan behövas för en fullständig undersökning. Gemensamt för ovanstående metoder är att de bestäm medel vaskulär permeabilitet föralla blodkärl i vävnadsprovet. Men det är väl etablerat att lung mikro-och makro fartyg är fenotypiskt olika 9. Därför kan permeabilitet svar vara heterogena bland de olika fartygssegment och 9,10. Således kvantifiera genomsnittliga permeabilitet av alla lungkärlen i ett vävnadsprov får inte tillräckligt återspeglar denna heterogenitet.

I det isolerade blod-perfusion lunga förberedelse, kan blodkärl på lungytan visualiseras med en upprätt mikroskop 4,11,12. Detta möjliggör karakteriserar svar i enskilda fartyg och därmed ta itu med eventuella heterogenitet i svaren 13. Dessutom, genom användning av fluorescens avbildning av mikrokärl, fluorescensbaserade analyser kan införlivas. Vidare kan en vänster förmak mikrokateter användas för att leverera agenter och fluorescens sonder i blodkärl 11,14. Den microcatheter begränsar leverans till en liten lung region, alltså exposera endast blodkärlen inom regionen till de infunderas agenter och fluoroforer. Detta gör att flera små regioner inom samma lunga som ska användas för separata experiment, vilket leder till en total minskning av djur som behövs för en undersökning.

Realtids avbildning möjliggör fångst av dynamiska förändringar i kärl-och extravaskulär fluorescens av enskilda mikrokärl i den isolerade lungan förberedelser. Således, för varje mikrokärls inom ett bildfält, kan spelas in förändringar i fluorescens under infusion av fluoroforer och borttvättnings, och kvantifieras offline 14. Använda värden för maximal och resterande kärl-fluorescens, kan en permeabilitet index för varje mikrokärls inom avbildningsområdet fastställas. För att bestämma permeabilitet ändras som svar på inflammatoriska eller skadliga ämnen, kan det önskade medlet administreras först och sedan permeabiliteten index bestämdes. Dessutom kan bildfältet ställas in var som helst i lungområdet infuseras medmicrocatheter, vilket möjliggör en hög grad av flexibilitet i valet av önskad vaskulära nätverket. Således, den isolerade blod-perfusion lunga beredning i tandem med realtid bildbehandling ger en attraktiv experimentell modell för att kvantifiera permeabilitet i enstaka lungmikrokärl.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment som utförs på djur var som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Tennessee Health Science Center.

1. Slangar för perfusion Rat Lung Förberedelser

  1. Förbered ett slangsystem med Tygon-slang (# 18) för genomblödning såsom visas i figur 1. Anslut tryckomvandlare (P23XL) och placera röret på mikroskopställningen.
  2. Ställ vattenbadets temperatur till 37 ° C.
  3. Anslut lung inlopp och utlopp tillfälligt med Tygon slang.

Figur 1
Figur 1. Blodperfusion slangen. Schemat visar slangen inställning används för att cirkulera blodet genom den isolerade lungan förberedelser. Också indikerade är associerade komponenter genom vilken slangen is dirigeras. En schematisk bild av hjärtat och lungan är inkluderad för att visa ställena i anslutning mellan slangen och lungartär (PA) och vänster förmak (LA) kanyl (blå streckade linjer).

2. Framställning av isolerad rått Lungor

  1. Bedöva råtta (Sprague-Dawley-råttor; 250-300 g) med ketamin (80 till 100 mg / kg) och med xylazin (5 till 10 mg / kg). Efter att ha säker en kirurgisk plan av anestesi, placera djuret i ryggläge.
  2. Utför trakeostomi, sätt in en trakeal kanyl (PE-90) och säkra med kirurgisk sutur.
  3. Ingjuta heparin (100-200 U) in i hjärtat från hjärtat (21 G fjäril nål), vänta 60 sekunder och exsanguinate blod (~ 12-15 ml blod).
  4. Bered två kanyler (Tygon slang, 3 mm diameter, 4 cm långa, utsvängda i ena änden) och fyll med koksaltlösning.
  5. Utför en torakotomi. Gör ett snitt (3 mm) på den högra ventrikeln och glida den utsvängda änden av en kanyl in i snittet mot pulmonellartär. Fäst kanylen till lungartären med kirurgiska suturer.
  6. Incise (3 mm) spetsen på den vänstra ventrikeln och skjut vidgade änden av den andra kanylen i snittet. För in kanylen i vänster förmak. Säkra kanyl till den vänstra ventrikeln med en naveltejp (2 mm bredd).
  7. Dissekera någon bindväv, och ta bort lungan och hjärtat tillsammans med bifogade kanyler. Placera lunga och hjärta på en petriskål. Flytta lungan så att diafragma ytan är på topp. De tre kanyler ska vara vänd åt samma håll.
  8. Placera lunga preparat på en scen som kan manipuleras i XY-riktningar. Varje scen som kommer med ett mikroskop kan modifieras för att hålla slangen eller en skräddarsydd scen byggt, om det behövs.

3. Blodperfusion av isolerad rått Lungor

  1. Blanda tömdes på blod blod med en lika stor volym albumin (5%) och lägga till reservoaren. Starta den peristaltiska pumpen och ange flöde råt till 14 ml / min. Låt blodet fyller slangen.
  2. Med shunten öppen, ta bort den tillfälliga lung inlopp-utlopp-kontakt. Fäst lungartären och vänstra förmakets kanyl till lungans inlopp och utlopp, respektive. Säkerställ att det inte finns några luftbubblor i slangen.
  3. Anslut trakealkanylen till en tredje tryckgivare (P23XL). Pumpa lungorna med 30% syre via trakealkanylen och bibehålla trycket vid 5 cm H2O
  4. Stäng shunten med en klämma för att börja lung perfusion. Upprätthålla lungartären och vänster förmakstryck vid ~ 10 och 3 cm H2O respektive.

4. Förbereda Lung för Microvascular Infusion

  1. Höj bakre änden av förlängningsröret för katetern ovanför nivån av lungan och säkert.
  2. Förbered en infusionskateter genom att sätta in ca 30 cm av en 40 cm lång PE10 slangen i en ~ 30 cm lång PE90 slangen. Anslut den exponerade änden av PE10-slangen till en nål (30 g) vidlägger vid en spruta (1 cc).
  3. Sätt i kateterkombination i den upphöjda bakre änden av förlängningsröret. Guide kateter kombination i vänster förmak och in i lungorna tills den möter motstånd. Därefter, tryck på PE10 kateter ensam längre in i lungorna tills den möter motstånd. Observera att använda onödigt våld när du sätter katetern kommer att skada lungorna.
  4. Fyll 1 cc spruta den med Ringers lösning och binda till en sprutpump. Ställ in infusionshastigheten till 10 ul / min.
  5. Infusionsstället blir blek i jämförelse med resten av lungan.
  6. Fukta lungan med koksaltlösning och täcker lungan med plastfolie med ett hål stort nog för att lämna infusionsstället avslöjats.
  7. Torka lite kranen fett på undersidan av en O-ring (skräddarsydd) och placera ett täckglas (# 1.5, 22 mm i diameter) på botten av O-ringen. Placera försiktigt O-ringen med täckglas på infusionsstället. Säkra O-ringen med en vanlig provrörs holder. Den täckglas / O-ringen kombinationen inte snedvrider de håliga strukturer under den, som nyligen rapporterades 15.
  8. Placera en objektiv (20X) av ett fluorescensmikroskop över O-ringen och fokus på lungytan.

5. Imaging fluorescerande dextran Transit Genom mikrokärl

  1. Förbered mikroskop för avbildning FITC blomningstid.
  2. Välj ett område som ska avbildas och få bilder med en hastighet av 1/minute använda bilden förvärvet programvara.
  3. Börja infusion av FITC-dextran 20 kD (0,5 mg / ml) med hjälp av sprutpumpen. Fluorescens i blodkärl kommer att öka successivt och når ett maximum. Fortsätt infusion under 60 minuter.
  4. Byt sedan till Ringers infusions att tvätta bort luminal fluorescens. Bibehåll infusion i över 10 min. Fortsätt bild förvärv vid 1/min under tvätt-off.

6. Bildanalys

  1. Öppna bilden förvärvsfilen.
  2. Place regionerav intresse över mikrokärl inom bildramen.
  3. Spela upp bildfilen bildruta för bildruta och registrera fluorescensintensiteten vid varje område av intresse för alla ramar.
  4. Plotta den förändring i fluorescensintensitet för varje region av intresse som en funktion av tiden.
  5. Kvantifiera den maximala fluorescensintensitet och den kvarvarande fluorescensintensitet efter 10 min av borttvättnings.
  6. Beräkna förhållandet mellan maximal restfluorescensintensiteten vid varje region av intresse för att få permeabiliteten Indexet för mikrokärl som är förknippade med att regionen av intresse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En isolerad blod-perfusion lunga preparat ansluten till perfusion slangar och tillhörande utrustning visas i figur 2. För demonstrationsändamål, använde vi en Sprague Dawley råtta, även om de förfaranden som beskrivs här kan användas med alla råttarter. Infusioner genom en vänster förmaks katetem når endast en liten region av lungan. Den infunderade regionen kan identifieras genom infusions missfärgning (Figur 3). Lungan beredningen som positionerad för realtids bildbehandling visas i figur 4.

Figur 2
Figur 2. Isolerad blod-perfusion lunga beredning. Fotografera visar isolerade rått lungor anslutna till perfusionsslangen och perfusion med autologt blod. Observera att diafragma ytan av lungan vetter mot milmikroskopet mål.

Figur 3
Figur 3. Microcatheter infusion regionen. En microcathether insatt via vänster förmak användes för att ingjuta Ringers lösning i lungan förberedelser. Bilden visar området av vänster lunga (cirkel) tar emot Ringers infusions. Som Ringers infusions förskjuter blodet perfusion genom kärlen visas infunderas regionen blek jämfört med de andra lungregioner. Observera att Ringers infusions är begränsad till ett litet väl avgränsat område av lungan.

Figur 4
Figur 4. Imaging läge för isolerade lung förberedelse. Fotografiet shows en isolerad lunga preparat placeras under ett mikroskop objektiv redo för avbildning. Observera att lungytan är täckt med ett plastomslag för att hålla lungytan fuktig. En O-ring bibehåller lungytan horisontell under avbildning.

I denna studie har vi bestämt förändringar i vaskulär permeabilitet som svar på behandlingar med bakteriell lipopolysackarid (LPS, serotyp 0111: B4), en allmänt använd modell av ALI. Mot detta, infunderas vi LPS (100 ng / ml) i mikrokärl under 30 minuter följt av en Ringers tvätt under 60 min 11. Då vi infunderas FITC dextran 20 kD att kvantifiera permeabilitet index. Återstående FITC-fluorescens var låg i mikrokärl som behandlas med Ringers, men högt i de som behandlats med LPS (Figurerna 5A-D). Dessutom i jämförelse med Ringer-infusion, orsakade LPS-infusion en betydande minskning av permeabiliteten index, vilket tyder på en global ökning av permeabiliteten i alla fartyg inom bilden field (Figur 5E). Permeabiliteten index kvantifieras separat för venoler och kapillärer föreslog att LPS-inducerad permeabilitet ökningen var lägre i venoler än i kapillärerna, men skillnaden var inte signifikant (figur 5F).

Figur 5
Figur 5. LPS ökar vaskulär permeabilitet. Pulmonella mikrokärl behandlades med antingen Ringers eller LPS (100 ng / ml) under 30 min. Efter 60 min, var FITC dextran 20 kD infusion följt av en Ringers tvätt och fluorescensförändringar fångas av realtid avbildning. Då permeabilitet index för blodkärlen i det behandlade området i lungan bestämdes som förhållandet mellan den maximala rest FITC dextran fluorescens. AD) Bilder visar max (A, C) och resterande (B, D) FITC fluorescence i Ringers-(A, B) och LPS-behandlad (C, D) lungmikrokärl. E) LPS infusion minskade permeabiliteten indexet markant inom alla fartygssegment inom bildramen. F) LPS-behandling orsakade en minskad permeabilitet index i båda venoler och kapillärer (* p <0,05 jämfört med Ringers kontroll; upprepades tre gånger vardera, medelvärde ± SEM). Kapillärer (cap) och venoler (ven) identifierades av fartygsdimensioner som erhållits från en bright bild som tagits före infusion av FITC dextran 20 kD. Bilder som visas är en beskuren del av en 850 x 850 ìm bildramen. n = antal fartyg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den isolerade blod-perfusion lunga preparat i kombination med realtid bildbehandling ger ett enkelt verktyg för bestämning av permeabilitetsförändringar i enstaka lungmikrokärl. Vi tillämpade denna metod för att definiera permeabilitetsförändringar som svar på infusioner av LPS. Våra data visar tydligt att LPS infusion orsakat en ökning av mikrovaskulär permeabilitet. Vidare data indikerar också att permeabilitetsförändringar inducerade av LPS var liknande i båda venoler och kapillärer. Således är en stor fördel med denna teknik möjlighet att definiera leakiness av enskilda mikrokärl samt ett globalt nätverk av fartyg. Med tanke på att denna teknik ger också globala permeabilitetsförändringar, är det möjligt att jämföra dessa värden med den som erhålls genom att använda andra vanliga metoder, t.ex. gravimetrisk analys. Sålunda kan föreliggande metod tillåter också jämförelse av mikrovaskulär vätska läcka information med den som rapporterats i andra studier.

I jämförelse med detmer allmänt används tekniker för att bestämma kärl permeabilitetsförändringar, realtid imaging baserad metod kräver ingen efterbehandling av lungvävnadsprover. Omfattningen av fluoroforen behålla fångas under infusionen och efterföljande borttvättnings av fluoroforen. Detta eliminerar helt klart att bevara vävnadsprover och eventuella fel i samband med hanteringen. Utöver upprättandet enskilda mikrokärls permeabilitet via permeabilitet index, den nuvarande metoden underlättar också definiera omfattningen av spår fluorescens ökning, den bifasisk karaktären av förändringstakten av spår fluorescens, och graden av spår fluorescens förfall under tvätta bort. Dessa ytterligare parametrar kan användas för att jämföra svar på olika behandlingar, samt intersegment skillnader i mikrokärl, som beskrivs i vår tidigare rapport 14.

Vi har häri beskrivna förfarandena för att bestämma permeabilitet ändras till följd av en inflammatoriskagent levereras av vaskulär infusion. Emellertid är det möjligt att anpassa förfarandena för att bestämma permeabilitetsförändringar till agenter som levereras via andra vägar också. Därför har vi tidigare fastställt mikrokärls permeabilitet ökar till syra som levereras av alveolär instillation 14.

Som framgår av lung fotografier, mikrokatetern baserad leveransmetod begränsar den levererade produkten till ett litet område av lungan. Således, genom att manipulera mikrokatetern till olika lungregioner, en serie experiment kan genomföras i samma lunga. Sålunda har denna metod en betydande inverkan på det antal djur som behövs för en fullständig studie. Uppgifterna i detta och andra redovisade studier har utnyttjat flera infusioner i samma lungan 4,11,12,14,16. Även om inga skillnader i svaren från de olika regionerna var uppenbara på grund av eventuell recirkulation av de infunderade agenter via perfusatet i den aktuella studien, bör denna möjlighet vara nackdelaridered i experimentell design. Alltså när använder olika regioner i samma lunga för experiment, kan det vara fördelaktigt att avgöra om baslinjen permeabilitet är likartad i de olika lungregioner.

Framgången med den nuvarande metoden beror kritiskt på att inrätta en väl perfusion lunga beredning. Lungan beredningen bör vara av enhetlig färg utan några röda fläckar, vätska som kommer ut ur trakealtub, blod läcka, eller höga lungartärtrycket, vilka alla visar på en skadad lunga. Vidare bör försiktighet iakttas under införande av microcathether in i lungan, som tvingar insättning kommer att leda till venule punktering och skada på lungan.

Den nuvarande intakta lungan metodgränser visualisering till pleura och subpleural fartyg, och därmed tillåter permeabilitet uppskattningar från endast en delmängd av lungkärlen. För visualisering av djupare fartyg, kan två-foton-mikroskopisk avbildning vara ett möjligt alternativ. Sättion av mikrokateterns via vänster förmakskanyl begränsar infusioner i venoler och kapillärer i retrograd riktning. En möjlig väg för att hindra denna begränsning kommer att vara att föra in katetern genom lungartärkanylen. Den enda ändring som krävs för denna alternativa procedur är att fästa en förlängning slang för katetern på lunginloppssidan.

Dessa förfaranden utvecklades med användning av råttlunga som modell. Däremot kan samma steg med vissa smärre modifieringar användas för att bestämma permeabilitetsförändringar i mus lungmikrokärl. För muslunga experiment kan agonist och spårämnet tillsättas till perfusatet och permeabiliteten kvantifieras som liknar den för råttlungor. Vidare kan en annan fluorescensspårämne bytas för att passa kapacitet användarens mikroskop. Storleken på dextran molekyl kan ändras beroende på den förväntade storleken av agonist-inducerad permeabilitet ökar och bör beslutasbaserat på data från initiala experiment. Således totalt sett den isolerade lungan preparatet tillsammans med fluorescens avbildning ger ett kraftfullt verktyg för att bestämma enda kärl permeabilitet i standarddjurmodeller av ALI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgements

Studierna stöds av NIH HL75503 till KP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tygon Tubing Fisher Scientific #18
Pressure Transducer Data Sciences International P23XL Need quantity 3
Butterfly Needle Greiner Bio-One 450081 21 G
Peristaltic pump Cole Parmer Masterflex L/S
PE-90 tubing Becton Dickinson 427421 30 cm needed
PE-10 tubing Becton Dickinson 427401 40 cm needed
Syringe Pump Braintree Scientific BS8000
O-ring Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure O-ring to holder
Upright fluorescence microscope Olympus America BX61WI
Image Acquisition Software Molecular Devices Metamorph
FITC Dextran 20KD Sigma Aldrich 0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values) 
Lipopolysaccharide Sigma Aldrich Serotype 0111:B4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
  2. Matthay, M. A., et al. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
  3. Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).
  4. Parthasarathi, K., et al. Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries. J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).
  5. Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury. Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).
  6. Gorin, A. B., Stewart, P. A. Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).
  7. Boutoille, D., et al. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).
  8. Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
  9. Stevens, T. Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells. Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).
  10. Ofori-Acquah, S. F., et al. Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions. Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).
  11. Kandasamy, K., et al. Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels. Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).
  12. Kandasamy, K., et al. Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels. PloS One. 8, (2013).
  13. Qiao, R. L., Bhattacharya, J. Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed. J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).
  14. Parthasarathi, K. Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).
  15. Wu, Y., Perlman, C. E. In situ methods for assessing alveolar mechanics. J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).
  16. Kuebler, W. M., et al. A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung. Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics