Construcción y caracterización de un Fold biorreactor Novela Vocal

1Biomedical Engineering Program, University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering, Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware
Published 8/01/2014
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Bioengineering

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Zerdoum, A. B., Tong, Z., Bachman, B., Jia, X. Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor. J. Vis. Exp. (90), e51594, doi:10.3791/51594 (2014).

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Abstract

Introduction

El pliegue vocal humano, compuesto por una capa epitelial, la lámina propia (LP) y el músculo vocal, es un tejido blando especializada que convierte el flujo de aire de los pulmones a las ondas acústicas para la producción de sonido. 1 Las cuerdas vocales oscilan regularmente durante la fonación normal, exhibiendo cepas de hasta 30% en las frecuencias fundamentales que van desde 100 hasta 300 Hz. 2 adultos vocal LP veces es una estructura compuesta de un gradiente superficial (SLP), un compuesto intermedio (ILP) y un (DLP) capa profunda. Otros grupos de clasificación del epitelio y la SLP como la capa mucosa, y combina la ILP y DLP en el ligamento vocal. 3 La capa SLP contiene principalmente una matriz amorfa con fibras colágenas escasamente dispersas, mientras que el ligamento está enriquecida con colágeno maduro y las fibras de elastina para proporcionar suficiente resistencia. 4 La estructura y la mecánica de las cuerdas vocales recién nacidos varían significativamente de sus contrapartes maduros. Aunque el mecanismos que regulan el desarrollo de las cuerdas vocales y la maduración aún no se entienden completamente, la evidencia experimental ha señalado a los roles que definen a los esfuerzos mecánicos derivados de la vocalización.

Varias condiciones médicas, incluyendo el abuso de la voz, infecciones, irritantes químicos y procedimientos quirúrgicos, pueden dañar la cuerda vocal. Trastornos de las cuerdas vocales afectan a un estimado de 3.9% de la población de los EE.UU.. Los métodos actuales de tratamiento para los trastornos de las cuerdas vocales se limitan 5 y un enfoque de la ingeniería de tejidos a base de células madre se ha convertido en una estrategia prometedora para restaurar la función de las cuerdas vocales. Las células madre mesenquimales (MSC) son una alternativa adecuada a los fibroblastos de las cuerdas vocales principales para la ingeniería de tejidos vocal fold. 6-9 especificación del destino de células madre y el desarrollo del tejido posterior son mediados por el nicho específico que residen en, de los cuales la condición mecánica es un factor vital. 10 Las fuerzas mecánicas son reguladores esenciales de tejidos morfogénesis unND homeostasis, sobre todo para los tejidos que están sometidos rutinariamente a la carga. 11 Desde una perspectiva de la ingeniería de tejidos, se ha demostrado que la exposición a estímulos mecánicos fisiológicamente relevantes promueve la diferenciación de células madre y remodelación de la matriz específica de tejido. 12-15

Biorreactores de cultivo de tejidos están diseñados para simular el entorno fisiológico deseado para la célula o tejido crecimiento in vitro. Para vocal ingeniería tisular veces, es especialmente crítico para recrear el ambiente mecánico de las cuerdas vocales fonación. Un biorreactor de las cuerdas vocales ideal debe cumplir efectivamente las señales vibratorias a células de cultivo, permitiendo el control fácil sobre la frecuencia, amplitud y duración de las vibraciones. Titze y compañeros de trabajo idearon un biorreactor vocal veces (biorreactor T1) 16 que combina estiramiento estático con alta frecuencia (20-200 Hz) oscilaciones para estimular la producción celular de proteínas de la matriz. Usíng este biorreactor, Webb y colegas 17 estudiaron los efectos de 10 días-, 100-Hz vibraciones en fibroblastos dérmicos cultivados en un ácido hialurónico (HA) a base de hidrogel. Las construcciones sometidas a vibraciones mostraron una elevada expresión de HA sintasa-2 (HAS2), decorina, fibromodulina y la metaloproteinasa de matriz-1 (MMP-1), relativa a los controles estáticos. Se encontró que los efectos estimulantes de ser dependiente del tiempo. Más recientemente, nuestro grupo de 18 reunió a un biorreactor de las cuerdas vocales (biorreactor J1) con un amplificador de potencia, un generador de funciones, un altavoz cerrado y una membrana de silicona circunferencialmente ancladas que transfiere el aire oscilante a las células unidas. Fibroblastos de prepucio neonatal cultivados en el biorreactor J1 se sometieron a 1 hora de vibración a 60, 110 o 300 Hz, con una cepa en el plano de hasta 0,05%. Los resultados qPCR sugirieron que la expresión de algunos genes ECM fue alterado moderadamente en respuesta a las múltiples frecuencias vibratoriasy amplitudes.

Estos diseños de biorreactores, mientras intrigante, tienen varias limitaciones. Por ejemplo, el sistema T1 requiere un gran número de conectores y barras de acoplamiento mecánico, la limitación de las frecuencias máximas alcanzables. Por otra parte, las células pueden ser sometidos a agitación y indeseable de fluido perturbación mecánica que complican la interpretación de los datos. El biorreactor J1, por otro lado, exhibe relativamente baja eficiencia de conversión de energía y no es fácil de usar. Además, la vibración con frecuencia separa los constructos de células cargado de la membrana de silicona subyacente. El J2 biorreactor de las cuerdas vocales informado aquí, diseñado basado en el mismo principio que la versión J1, está optimizado para la consistencia y reproducibilidad. Las vibraciones de fonación que imitan se generan aerodinámicamente en cámaras de vibración montados individualmente cuando poli fibrosa poblada-MSC (ε-caprolactona) (PCL) andamios son effectively asegurado. Láser Doppler vibrometría (LDV) permite al usuario verificar el perfil vibratorio del conjunto de membrana / andamio. En nuestra demostración, las MSC se exponen a 200 Hz vibraciones sinusoidales con una (DE) patrón 1-hr-a-1-hr-off para un total de 12 horas al día durante 7 días. Las respuestas celulares a las señales vibratorias impuestas son investigadas sistemáticamente. En general, el pliegue vocal J2 ofrece la mayor cantidad de funciones fáciles de usar, lo que permite estudios de cultivo celular dinámico para llevarse a cabo en un alto rendimiento y la moda reproducible.

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Protocol

1. Asamblea biorreactor (vídeo 1)

  1. Hacer un molde de aluminio (matriz circular + pin espaciador) con las dimensiones internas y externas predeterminadas (Figura 1).
  2. Usando el molde desde el paso 1.1, fabricar una membrana de silicona (diámetro: 42 mm, espesor: 1,5 mm, Figura 1) con un manguito arraigada (diámetro: 12 mm, espesor ~ 0,25 mm, en forma de por el pasador de espaciador en la Figura 1) en el medio utilizando un kit de elastómero de silicona disponible en el mercado.
  3. Hacer un par de bloques de acrílico (Figura 2 (4, 5)) con una abertura circular (diámetro: 24 mm) en el centro, grabar la parte superior (1,8 cm de espesor) e inferior (0,9 cm de espesor) bloques con aristas coincidentes y ranuras . 10
  4. Emparedado de la membrana de silicona entre los bloques de acrílico pareadas. Fije el conjunto con cuatro tornillos de las esquinas con un destornillador de torsión micro ajustado a una fuerza constante (35 cN · m). Como resultado, un estanca al agua, 24 mm de ancho y 18 mm de cámara profunda vibración es creada (Figura 2C).
  5. Montar un "rango extendido mini-woofer 3 (Figura 2D, 8 Ω/20 W) por debajo de la cámara de la vibración a través de otro conjunto de tornillos de las esquinas en el bloque de acrílico inferior. En este punto, un módulo de vibración individual está montado.
  6. Replicar siete módulos de vibraciones adicionales. Coloque cuatro de ellos a uno de dos barras de aluminio fijos (40 cm x 10 cm x 2,5 cm), colocando las bases de altavoz en orificios circulares uniformemente espaciados (diámetro: 7 cm, espesor: 2 cm) cortadas en los bares. Estabilizar cada altavoz mediante la inserción de un tornillo a través del lado de la barra de aluminio en cada agujero circular.
  7. Controlar individualmente los altavoces por un selector de altavoces. Conectar altavoces individuales al selector uniendo cables a las entradas positiva y negativa en el cuerpo de altavoz a continuación a las salidas correspondientes en el selector. El selector del altavoz permite que la señal de tque generador de funciones, después de pasar a través de un amplificador de potencia, para alcanzar los ocho altavoces al mismo tiempo (Figura 2E).
  8. Coloque las dos matrices de cámara, el selector de altavoces y componentes electrónicos asociados en un recinto anti-humedad. Casa todo el conjunto en una incubadora de cultivo celular comercial.
  9. Alimentar a los cables principales (a través de un tubo de PVC de grado médico) que conecta el amplificador de potencia y el selector de altavoz a través del conjunto de filtro en la parte posterior de la incubadora.

2. Fabricación de la estructura y Caracterización

  1. Disolver gránulos de PCL en cloroformo a una concentración de 15% en peso. Cargar la solución en una jeringa de 10 ml tapado con una aguja de punta roma 21 G.
  2. Bloquee la jeringa en una bomba de inyección programable y ajustar la velocidad de flujo a 1 ml / hr.
  3. Coloque el colector de aluminio cubierto de aluminio a través de la aguja en posición horizontal, con una aguja de distancia de punta a colector de ~ 18 cm.
  4. Sujete el alli positivoGator clip a la media de la aguja, y la pinza de cocodrilo de tierra al colector de aluminio, a continuación, establecer el voltaje en la fuente de alimentación de alta tensión de 15 kV. PRECAUCIÓN: alta tensión, mantener la distancia de la aguja.
  5. Convertir secuencialmente en la bomba de jeringa y la fuente de alimentación; rápidamente limpiar / remover la solución de polímero residual que rodea la punta de la aguja con una toalla de papel seca antes de jets fibra estable y Taylor cono 19 se forman.
  6. Dejar que las fibras se acumulan en el colector de Al con un grosor de ~ 250-300 micras (~ 7 h bajo las condiciones de hilado actuales). Guarde los andamios resultantes en un desecador de vacío durante 1-2 días para eliminar cualquier disolvente residual.
  7. Imagen de los andamios, recubrieron por deposición con oro, utilizando un microscopio electrónico de barrido para mostrar la morfología de la fibra consistente. 10

3. Asamblea biorreactor y Caracterización

  1. Haz un disco cilíndrico (diámetro: 8 mm) con cuatro brazos (longitud: 2mm) fuera de la estera como hilado-PCL (Figura 2A) por primera usando un punzón de biopsia de 12 mm de diámetro para cortar el diámetro exterior del disco. A continuación, utilice un segundo, 8 mm punzón de biopsia para hacer cuatro muescas 2 mm de largo espaciados uniformemente alrededor de la hoja circular de anotar dónde están las armas para cortar. Después de anotar con el punzón de 8 mm, utilizar una cuchilla de escalpelo para cortar los bordes de los brazos hacia afuera. Inserte el andamio en la ranura de la membrana de silicona a través de los brazos extendidos (Video 1). Acoplar el andamio insertado presionando suavemente la superficie con unas pinzas de cabeza plana.
  2. Coloque un pedazo pequeño de fina lámina de aluminio (8 mm x 2 mm, de forma ortogonal, Figura 2B) al cadalso PCL para ayudar a la reflexión del láser.
  3. Asegure la membrana de silicona / PCL andamio montado (como se detalla en el paso 1.4) en la cámara de vibración. Añadir 1,5 ml de agua en la cámara con el fin de hidratar el andamio PCL antes de la vibración.
  4. Usando el generador de funciones, introducir señal de vibraciónALS (por ejemplo, 200 Hz ondas sinusoidales con una tensión de pico a pico, Vpp, de 0,1 V) a la cámara de acrílico intercalada. Utilice un voltímetro para medir con precisión el voltaje en cada entrada del altavoz. Nota: la lectura Vpp desde el generador de funciones será diferente de la tensión de la eventual entrega al altavoz.
  5. Montar la LDV de un solo punto y asegurar la cabeza del sensor láser de fibra óptica en un trípode cabeza pan-tilt. Ángulo de la cabeza del sensor de manera que está apuntando perpendicular al tablero de la mesa. Conectar el cabezal del sensor LDV al módulo de adquisición de datos a través de cable coaxial entonces el módulo a la computadora portátil a través de USB.
  6. Enfocar el haz de láser perpendicularmente a diversos puntos predeterminados en la membrana de silicona (Figura 2B y Figura 3).
  7. Utilizando el software de adquisición de datos, registrar el desplazamiento mediados de membrana. Haga clic en "Configuración de adquisición" en el menú "Opciones"; a continuación, cambiar el modo de medición a "FFT221;. A continuación, haga clic en la "medición continua" en la barra de herramientas principal haga clic en el pico que se forma en la frecuencia elegida (Figura 6D) para registrar el desplazamiento.
  8. Trazar el desplazamiento mediados de membrana normal (w 0) como una función de la posición relativa a través del sustrato. Construir un mapa de colores 3D del perfil vibratoria superficie usando Origen software de análisis de datos 8.5.

4. Vibratorio Cultivo Celular

  1. MSC derivadas de médula ósea humana Sub-cultura en frascos de cultivo de tejidos T150 en una densidad de siembra inicial de 4.000-5.000 células / cm 2 en MSC medio de mantenimiento.
  2. Después de 7-8 días de cultivo celular (hasta ~ 85% de confluencia), trypsinize las células con un reactivo de disociación celular como accutase, contar utilizando un hemocitómetro, se centrifuga (440 g durante 5 min), y volver a suspender el sedimento celular en fresca MSC medios de mantenimiento a una concentración de 4,5 x 10 6 células / ml.
  3. Sumerja el Scaffo PCLld en el 70% de etanol O / N. Después de evaporar el disolvente, exponer ambos lados del andamio para germicida de luz UV (254 nm) para 5-8 min.
  4. Remojar el andamio PCL en una solución de fibronectina 20 mg / ml a 37 ° C durante 1 hora. Inserte el andamiaje de fibronectina recubierto en la membrana de silicona. Montar el biorreactor como se detalla en el paso 1.
  5. Distribuir 40 l de la suspensión celular de manera uniforme en el cadalso PCL garantizado. Permitir que las células se unan durante 1-1,5 h antes de la adición de un adicional de 1,5 ml de medio fresco a la cámara de vibración.
  6. Cultura al cadalso PCL-MSC cargado estáticamente durante 3 días y actualizar los medios de comunicación al término de la cultura estática.
  7. Imponer regímenes de vibración seleccionados para los constructos celulares. Nota: A modo de ejemplo, las células se someten a una 1-hr-a-1-hr-desactivación (OF) de vibración a 200 Hz con aw 0 de ~ 40 m durante 12 horas al día durante un máximo de 7 días. Las construcciones sometidas a estímulos vibratorios se designan como muestras Vib y esas culturojo estáticamente en cámaras de vibraciones idénticas servir como controles estáticos (Stat).

5. Evaluaciones biológicas

  1. Recoger 200 l de medios de cultivo celular a partir de cada cámara de cada dos días (días 1, 3, 5, y 7) y agrupar las partes alícuotas de la misma muestra juntos (800 l cada uno).
  2. Cuantificar la producción celular de la matriz metaloproteinasa-1 (MMP1) y HA mediante un kit de ELISA MMP1 Desarrollo y un kit de ELISA competitiva ácido hialurónico, respectivamente, siguiendo el procedimiento de los fabricantes. Mientras tanto, el ensayo de la producción de precursor de la elastina soluble en siguiendo el procedimiento de ELISA se informó anteriormente. 8
  3. Al finalizar el último ciclo de la vibración en el día 7, eliminar rápidamente los constructos celulares de las cámaras de vibración utilizando pinzas afiladas y enjuagarlos con frío tampón fosfato salino (PBS, 4 ° C) brevemente.
  4. Para la tinción vivo / muerto, incubar las construcciones con yoduro de propidio (1:2.000 en PBS) ySyto-13 (1:1.000 en PBS) simultáneamente durante 5 min a TA. Imagen de las construcciones teñidos con un microscopio confocal multifotónica.
  5. Por separado, complemento congelar los constructos celulares se enjuagaron con PBS en hielo seco y se extrae el ARN celular total después de un protocolo se informó anteriormente para el análisis de genes. 9
  6. Verificar, la cantidad y la calidad del ARN extraído usando un espectrofotómetro UV-Vis. Las muestras de ARN con A260/A280 y A260/A230 proporciones de 1.8 a 2.2 se utilizan para el análisis de qPCR posterior.
  7. Transcribir inversamente el ARN (500 ng / muestra) en ADNc usando un kit de transcripción inversa disponibles comercialmente.
  8. Realizar la reacción de PCR en un sistema de detección de secuencias en tiempo real usando una mezcla maestra de PCR disponible comercialmente siguiendo el procedimiento detallado anteriormente. 8
  9. Analizar los resultados qPCR utilizando software comercial para el análisis de datos qPCR. Para garantizar la fiabilidad de los análisis de datos, múltiples genes de referencia (YWHAZ, PDD, PPIA) se emplean como intcontroles ernal, y la varianza de las eficiencias de cebadores específicos se tiene en cuenta. 8

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Representative Results

Los andamios PCL fabricadas por electrospinning contienen poros intersticiales clasificadas micrón y fibras enredadas al azar con un diámetro medio de 4,7 micras (Figura 4). A un aumento superior, ranuras nanoescala y poros son visibles en fibras individuales (Figura 4B). El recubrimiento de los andamios con fibronectina mejora hidrofilicidad y facilita la adhesión celular inicial / difusión en el cadalso PCL (observación no publicada).

Formas de onda sinusoidal con la frecuencia deseada (f, 100-300 Hz) y el voltaje (Vpp: 0 a 0,125 V) se introducen en el altavoz debajo de cada cámara de la vibración, y el aire confinado entre la parte inferior de la membrana de silicona y el cono de papel de un mini-woofer es conducido en oscilación. La oscilación de aire se entrega a la andamio PCL con o sin células. LDV se utiliza para analizar las características de vibración del andamio en una f dada y Vpp,teniendo en cuenta el índice de refracción de agua (1,33). 20 Figura 5 muestra el desplazamiento normal (w 0) en el centro del andamio PCL como una función de Vpp y f. Las frecuencias de vibración se eligen para reflejar frecuencias fundamentales de habla humanos. 21 Existe una relación lineal entre 0 W y VPP en el intervalo de 0 a 0,125 V para todas las frecuencias analizadas. En un Vpp dado, W 0 disminuye a medida que aumenta f entre 100 y 300 Hz.

Una condición específica de vibración (f = 200 Hz, Vpp = 0,1 V) se selecciona para su posterior análisis. El perfil de velocidad como una función del tiempo (Figura 6A) muestra que la señal sinusoidal introducido en el altavoz es capturado por el andamio PCL con alta fidelidad. El centro de la andamio PCL oscila longitudinalmente con una velocidad pico de 52 mm / s, una aceleración máxima de 66 m / seg 2 (~ 6,7 g) y undesplazamiento normal de ~ 40 m. Las señales armónicas en 100, 300, 400 y 500 Hz son al menos un orden de magnitud menor que aquellos a la frecuencia fundamental (200 Hz). Sin embargo, si el valor Vpp es demasiado alta (0,15 V), múltiples picos de armónicos de intensidad comparable a la frecuencia fundamental se detectan (Figura 7). El perfil de la vibración en todo el andamio se crea mediante el control del desplazamiento normal de entre un total de 73 puntos representativos de las direcciones radiales de la superficie PCL (Figura 3). El mapa de colores 3D (Figura 8) demuestra que la vibración detectada en la superficie de la membrana es axisimétrico con respecto al centro y sus posiciones de descanso. El desplazamiento normal se encontró a disminuir de forma monótona desde el centro hasta el borde donde se fija la membrana.

Las MSC cultivadas en andamios PCL se cultivan bajo condiciones de vibración seleccionados. Las células sometidas a un 7-daY de estimulación mantener las propiedades de viabilidad y de proliferación similares a los de los controles estáticos (Figura 9), lo que confirma que los andamios fibrosos fueron citocompatible y la vibración aplicada dieron lugar a ninguna pérdida de viabilidad. Las respuestas celulares a estímulos vibratorios son examinados en los niveles de mRNA en cuanto a la expresión de las proteínas ECM pliegue vocal esenciales, tales como la elastina (ELN), ácido hialurónico sintasa-1 (HAS1), COL3A1 y MMP1 (Figura 10). La DE vibración conduce a un aumento de 2,3 veces en la expresión ELN en el día 7, relativa a los controles estáticos. Las estimulaciones vibratorias también aumentaron la expresión de COL3A1 moderadamente. Es de destacar que la expresión de las principales enzimas de remodelación de ECM, HAS1 y MMP1, se ve aumentada significativamente por las señales de vibración. Específicamente, el tratamiento dinámico resultó en un aumento pliegue de ~ 1,7 y ~ 16.3 para HAS1 y MMP1 expresión (ambos p <0,05), respectivamente, sobre sus controles estáticos en el día 7. En general, el efecto inductivo de las vibraciones en HAS1 y MMP1 se ha mejorado desde el día 3 al día 7.

Para fundamentar aún más los resultados qPCR, la producción celular de HA, elastina soluble y MMP1 se cuantifica mediante ELISA a nivel de traducción (Figura 11). Las células cultivadas producen dinámicamente 4,2 ± 0,1 g / mg (por peso seco andamio) elastina soluble después de 7 días de vibraciones, mientras que los controles estáticos sólo se acumulan 2,7 ± 0,2 mcg / mg) elastina. En promedio, 7-día de las vibraciones resultan en 2,2-y aumento de 4,7 veces en la HA y la secreción de MMP1, con relación a los correspondientes controles estáticos.

Vídeo 1: Una simulación 3D que muestra el conjunto de un biorreactor J2. El video fue creado por Autodesk 3ds Max Design (Cortesía de Congfei Xie).

"Fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 1
. Figura 1 fotografía que ilustra la dimensión del molde Al utilizado para la fabricación de la membrana de silicona con funda atrincherada Ø:. Diámetro, d: grosor / profundidad, h:. Altura Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
.. Figura 2 Diagrama de flujo que muestra el conjunto biorreactor (A) Una fotografía de una forma de andamio PCL de cuatro brazos; (B) Una fotografía que muestra el andamio PCL asegurado en la cámara de vibración y el láser vibrómetro centrado en la parte inferior de la cámara; ( C) Una sección transversalcol vista de la cámara de vibración. 1: andamio PCL (rojo); 2: membrana de silicona (cian); 3: Al barra fija; 4: Bloque de acrílico superior; 5: bloque acrílico inferior; 6: mini-woofer; (D) vista lateral del módulo de vibración, (E) Una fotografía que muestra todo el conjunto. Esta cifra ha sido modificado desde Tong et al. 10 Derechos de autor 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Ejemplo de membrana de silicona radialmente marcado para mediciones LDV solo punto. Esta cifra se ha modificado desde Tong et al. 10 Derechos de autor 2013, Mary Ann Liebert, Inc.


Figura 4. Imágenes de SEM de andamios PCL en diferentes aumentos. (A) 600X, (B) 7000 X. Esta cifra ha sido modificado desde Tong et al. 10 Derechos de autor 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La figura 5
Figura 5. El desplazamiento normal en el centro de la membrana de silicona (W 0) como una función de la frecuencia aplicada (100, 200 y 300 Hz) y la tensión de accionamiento (Vpp = 0 hasta 0,125 V). Esta figura se ha modificado de Tong et al. 10 Derechos de autor 2013, Ma ry Ann Liebert, Inc.

La figura 6
Perfil de velocidad Figura 6. Características de vibración detectada en el centro de la membrana de silicona con f = 200 Hz y un perfil Vpp = 0,1 V. (A) de velocidad como una función de tiempo. (B) como una función de la frecuencia. (C) La aceleración como una función de la frecuencia. (D) de desplazamiento normal (w 0) como una función de la frecuencia. Esta cifra ha sido modificado desde Tong et al. 10. Derechos de autor 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7. Desplazamiento normal detectada en el centro de la membrana (w 0) como una función de la frecuencia cuando una onda sinusoidal de 200 Hz se introduce a la mini-altavoz de graves en un Vpp = 0,15 V.

Figura 8
Figura 8. Mapa de colores 3D construido por grillado superficie usando los datos de desplazamiento normales recogidas de todos los lugares marcados en el cadalso PCL. Esta cifra se ha modificado desde Tong et al. 10 Derechos de autor 2013, Mary Ann Liebert, Inc.

Figura 9
Figura 9. Célula de viabilidad, visualizado por tinción en vivo / muerto, después de 7 días de vibraciones. Esta cifra se ha modificado desde Tong et al. 10 Derechos de autor 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10
Figura 10 respuestas celulares. A los estímulos vibratorios en términos de la expresión de los genes de plegado relevante, ECM vocales. La expresión génica relativa (doble cambio) se normaliza a los respectivos controles estáticos en el día 3 y el día 7 (línea de base de trazos). **: Diferencia significativa (p <0,05) entre los días 3 y 7, #: cambiado significativamente (p <0,05) con relación a la línea de base. Los datos representan la media ± error estándar de la media (SEM, n = 4). La prueba t de Student de dos colas se utiliza para el análisis estadístico, con p <0,05 se consideraron como significativamente diferenc (igual que a continuación). Esta cifra ha sido modificado desde Tong et al. 10 Derechos de autor 2013, Mary Ann Liebert, Inc.

Figura 11
Figura 11. Cuantificación bioquímica de HA (A), soluble ELN (B) y MMP1 (C) producido por las MSC cultivadas en el cadalso PCL bajo Stat y Vib condiciones para 7 días. Cantidad total de moléculas de ECM por el peso del andamio seco (mg) se representa como media ± SEM, n = 4 del ensayo representativo #:. significativamente mayor (p <0,05) en comparación con los controles Stat. Esta cifra ha sido modificado desde Tong et al. 10 Derechos de autor 2013, Mary Ann Liebert, Inc.

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Discussion

Ingeniería con éxito de los tejidos de las cuerdas vocales funcionales in vitro requiere la recreación de un microambiente veces como vocal para mediar en el comportamiento de las células multipotentes. En general se acepta que las estructuras de tejidos u órganos reflejan las funciones que se requieren para llevar a cabo. 22 Para los tejidos de las cuerdas vocales, se proponen las vibraciones de alta frecuencia que se producen durante la fonación a ser importante para la maduración de los tejidos. En nuestro estudio, los andamios PCL se utilizan para proporcionar un soporte estructural similar a un ligamento, mientras que el biorreactor cuerda vocal está diseñado para introducir señales mecánicas fisiológicamente relevantes de las MSC cultivadas. El biorreactor descrito aquí (J2) crea la vibración electromagnéticamente través de los altavoces individuales y transfiere el aerodinámicamente energía para las células cultivadas. En comparación con nuestro diseño anterior, 18 del sistema actual se mueve la fuente de estimulación vibratoria directamente debajo de cada muestra, lo que permite fora la conversión de energía más eficiente. Como resultado, un desplazamiento normal de significativamente más grande y una mayor aceleración se consiguen usando el sistema actual. El diseño modular también minimiza las variaciones del sistema y la perturbación mecánica a través de diferentes cámaras de vibración.

Nuestro diseño se basa en una membrana de silicona para entregar las señales de vibración. Por lo tanto, es importante mantener la integridad de la membrana y la homogeneidad. Después de la solución de precursor se vierte en el molde de aluminio, es deseable eliminar el exceso de líquido arrastrando un portaobjetos de vidrio a través de la superficie del molde. Membranas consistentes sin burbujas de aire atrapadas pueden ser producidos mediante la reducción de la temperatura de curado, mientras que aumentar el tiempo de curado. Además, una solución de etanol al 70% se puede utilizar para hincharse temporalmente en la membrana en la interfase de aluminio para permitir una fácil extracción de la silicona curada. Para dar cabida a las construcciones celulares para la cultura dinámica en 3D, una ranura delgada colocada en el centro is moldeado en la membrana de silicona, de tal manera que los andamios de PCL se pueden anclar periféricamente en la cámara de vibración. La geometría de la ranura es ajustable; por lo tanto la forma de la construcción celular se puede ajustar en consecuencia para imitar mejor la geometría de los pliegues vocales nativas. 23 Si el andamio PCL no esté fijado firmemente en la membrana de silicona, las señales de LDV detectados en el PCL y en la región exterior de la silicona membrana no se solapan perfectamente. Al montar el biorreactor, es crítico que todos los componentes están fijados y apretados en el mismo grado a fin de evitar movimientos no deseados y para reducir al mínimo la cámara a las variaciones de la cámara.

Para validar la utilidad del biorreactor, las MSC se cultivan en andamios PCL y se someten a intermitente (DE) vibraciones durante 7 días. El de las vibraciones durante un período de varias horas por día se emplean para reproducir las condiciones que hablan de usuarios de voz pesados, por ejemplo, cantar profesional dores y maestros. 23 A diferencia de los biorreactores de las cuerdas vocales se informó anteriormente, la nuestra no causan ningún efecto perjudicial o trauma fisiológico a las células.

Las vibraciones 200 Hz se encuentran para regular diferencialmente la producción celular de componentes de ECM importantes. La elastina es una proteína estructural fundamental que se encuentra en todo el LP de las cuerdas vocales, y le imparte resistencia y elasticidad. 24 componentes amorfos intersticiales, como HA, contribuyen al mantenimiento de la viscoelasticidad tisular adecuada y la prevención de la formación de cicatrices. 25,26 MSC sometidos a los 7 días del tratamiento producir una cantidad significativamente mayor de la elastina que las contrapartes estáticamente cultivadas. Biosíntesis de HA también es sensible a las vibraciones, según lo confirmado por los resultados de qPCR en HAS1 y ELISA resultados en HA. Estos hallazgos sugieren que la estimulación vibratoria habilitado por el biorreactor es propicio para la producción de moléculas anti-cicatrización.

jove_content "> rotación ECM equilibrada se basa en la deposición de matriz y la degradación concurrente. 27 colágeno de tipo III es la principal fibra de colágeno reticular encuentran en los pliegues vocales, proporcionando el tejido con propiedades de soporte de carga. 28 Las vibraciones 7-día aplicados en el presente documento mejorar la expresión génica de COL3A1, pero de una magnitud mucho menor que el de la elastina. Por lo tanto, las vibraciones aplicadas diferencialmente regulan la maquinaria celular implicada en la síntesis de colágeno III y elastina. Curiosamente, MMP1, uno de los principales MMP implicadas en la degradación de la matriz y la remodelación tisular 27 , es muy sensible a las señales vibratorias. Estos resultados concuerdan bien con los informes anteriores sobre inducida por la vibración MMP1 la regulación positiva por células atrapadas en una matriz de HA. 29 En general, los estímulos vibratorios generados por el biorreactor de las cuerdas vocales profundamente median funciones MSC mediante la promoción de la homeostasis de vocales matrices plegable similares.

Encimatodo, la novela biorreactor de las cuerdas vocales que aquí se presenta es modular y fácil de usar, lo que permite el cultivo de células dinámico que se realiza de una manera reproducible. Sin embargo, existen varias limitaciones en el diseño actual. En primer lugar, la amplitud de la vibración, aunque mejorado de la versión J1, es todavía pequeña en comparación con el tejido de las cuerdas vocales. En segundo lugar, nuestro biorreactor no simula la colisión bilateral de cuerdas vocales durante la fonación normal. En tercer lugar, nuestra fibrosa andamio PCL no refleja la anisotropía tejido. El trabajo futuro se dedica a mejorar el diseño para imitar mejor las condiciones de fonación nativas. Mientras tanto, los regímenes óptimos para la cultura dinámica 3D serán exploradas para el conjunto vocal funcional exitosa veces in vitro.

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Disclosures

No existen intereses financieros en competencia.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. Jeffrey Caplan para su formación y asesoramiento sobre la imagen confocal. También agradecemos al Keck Microscopía Electrónica y Laboratorios Dr. Chaoying Ni para la asistencia SEM. Este trabajo está financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIDCD, R01DC008965 y R01DC011377). ABZ reconoce NSF Integrativa de Posgrado Formación y programa (IGERT) para la financiación de la investigación de prácticas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone elastomer kit Dow Corning Sylgard 184 Cure the membrane at 100 °C for 2 hr
PCL Sigma Aldrich 440744-500G Mn ~80 kDa, dissolve O/N
Chloroform Sigma Aldrich C7559-5VL
Human bone marrow-derived MSCs Lonza PT-2501 Received with passage 2
MSC maintenance media Lonza PT-3001 10% FBS in basal media supplemented
with L-glutamine, gentamicin and amphotericin
Accutase cell dissociation reagent Life Technologies A11105-01
Ethanol Sigma Aldrich E7023-500ML
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-1MG
MMP1 DuoSet ELISA kit R&D systems DY901
HA ELISA kit Echelon Biosciences  K-1200  
PBS Life Technologies 14190-136
Propidium iodide  Life Technologies P1304MP
Syto-13  Life Technologies S7575
QuantiTect reverse transcription kit  Qiagen 205311
SYBR Green PCR master mix Life Technologies 4309155
Replacement speaker DAYTON audio
(via Parts Express)
DS90-8 Paper cone, full range (80-13,000 Hz), 85 dB
Ergo Micro torque screwdriver Mountz # 020377 Torque range: 20-120 cN·m
Stereo speaker selector RadioShack 40-244 Maximum power handling 50 W
Function generator  Agilent  33220A Frequency range 1 µHz-20 MHz
Power amplifier  PYLE audio PylePro PT2400 Frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker
channels
Cell culture incubator  Thermo Fisher  Steri-Cult 3307
Syringe pump  New Era Pump Systems NE-300
High voltage power supply Spellman CZE 1000R Output voltage: 0-30 kV
Scanning electron microscope  JEOL-USA JSM-7400F
Desk gold sputter coater Denton Vacuum DSK00V-0013
Doppler laser vibrometer  Polytec PDV-100 Non-contact velocity measurement (0-22 kHz)
PCR sequence detection system  Applied Biosystems ABI7300
Multiphoton confocal microscope Zeiss Zeiss 510Meta NLO
UV-VIS Spectrophotometer  NanoDrop Products
via Thermo Scientific
ND-2000
VibSoft Data Acquisition Software Polytec Acquisition bandwidth up to 40 MHz
Origin 8.5 data analysis software  OriginLab
qbasePlus qPCR data analysis software  Biogazelle V2.3
Aluminium alloy  McMaster-Carr Alloy 6061
Acrylic blocks McMaster-Carr
Polycarbonate anti-humidity chamber McMaster-Carr Impact-Resistant Polycarbonate
screws  McMaster-Carr
Electronic cable/wire
Medical grade PVC tubing US Plastic Corp. Tygon S-50-HL Clear, biocompatible
10 ml Syringe  Becton Dickinson 309604
21 G Blunt ended needle Small Parts NE-213PL-25 1-1/2" length
Alligator clip adapters  RadioShack 270-354 Fully insulated
8 mm Biopsy punch Sklar Surgical Instruments 96-1152 Sterile, disposable
12 mm Biopsy punch Acuderm (via Fisher Scientific) NC9998681
Tissue culture flasks Corning Cell culture treated

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References

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