Analyse à haut débit de mammifères olfactifs récepteurs: mesure de activation du récepteur via la luciférase activité

Neuroscience

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Summary

Modèles d'activation des récepteurs olfactifs codent l'identité de l'odeur, mais le manque de données publiées identification des ligands odorants pour les récepteurs olfactifs de mammifères entrave le développement d'un modèle complet de codage de l'odeur. Ce protocole décrit un procédé pour faciliter l'identification à haut débit de ligands de récepteurs olfactifs et la quantification de l'activation du récepteur.

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Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity. J. Vis. Exp. (88), e51640, doi:10.3791/51640 (2014).

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Abstract

Odorants créer des motifs uniques et se chevauchant de l'activation du récepteur olfactif, ce qui permet une famille d'environ 1000 et 400 murin récepteurs humains de reconnaître des milliers de substances odorantes. Ligands odorants ont été publiés pour moins de 6% des récepteurs humains 1-11. Ce manque de données est dû en partie à la difficulté à exprimer fonctionnellement ces récepteurs dans des systèmes hétérologues. Ici, nous décrivons une méthode pour exprimer la majorité de la famille des récepteurs olfactifs dans des cellules Hana3A, suivi d'une évaluation à haut débit de l'activation du récepteur en utilisant un test olfactif rapporteur de la luciférase. Ce dosage peut être utilisé pour (1) des panneaux d'écran de substances odorantes contre les panneaux de récepteurs olfactifs; (2) confirmer interaction odorant / récepteur via des courbes dose-réponse; et (3) comparer les niveaux d'activation du récepteur entre les variants du récepteur. Dans nos données d'exemple, 328 récepteurs olfactifs ont été projetés contre 26 odorants. Paires odorant / récepteurs avec des scores variant de réponse étaient de sélectionted et testé en réponse à la dose. Ces données indiquent que l'écran est une méthode efficace pour enrichir en paires odorant / récepteurs qui vont passer d'une expérience de dose-réponse, à savoir les récepteurs qui ont une réponse de bonne foi à une substance odorante. Par conséquent, ce dosage de la luciférase à haut débit est une méthode efficace pour caractériser les récepteurs-une étape essentielle olfactif vers un modèle de codage d'odeur dans le système olfactif de mammifère.

Introduction

Le système olfactif de mammifère a la capacité de répondre à un grand nombre de stimuli odorants, permettant la détection et la discrimination des milliers de substances odorantes. Les récepteurs olfactifs (RUP) sont les capteurs moléculaires exprimés par les neurones sensoriels olfactifs dans l'épithélium olfactif 12. La reconnaissance de l'odeur de mammifère se produit par l'activation différentielle des RUP par odorants, et la famille ou le gène est vaste, avec environ 1000 murin et 400 récepteurs humains 12-16. Analyses fonctionnelles antérieures de RUP dans les neurones olfactifs et dans les cellules hétérologues ont montré que différentes substances odorantes sont reconnus par unique, mais qui se chevauchent ensembles de RUP 10,17-20. Ligands correspondants à RUP est essentiel pour comprendre le code olfactif et essentiel pour construire des modèles viables de l'olfaction. En raison de la difficulté à exprimer des RUP dans des systèmes hétérologues ainsi que le grand nombre des deux substances odorantes et les RUP, ces données ont été largement absent de la fIELD; en effet, moins de 6% des RUP humains ont un ligand publié 1-11. Ce protocole décrit l'utilisation d'un dosage de la luciférase pour caractériser les interactions odorantes / OU. Ce test permet la caractérisation à haut débit de RUP, une tâche qui est essentielle pour comprendre odorant / OU interactions ainsi que l'élaboration d'un modèle de codage des odeurs.

Études à haut débit de RUP sont confrontées à trois défis majeurs. Tout d'abord, RUP exprimés dans des cellules hétérologues ont été retenues dans le RE et ensuite dégradées dans le protéasome 21,22, ce qui empêche les RUP d'interagir avec des substances odorantes dans le système de dosage de 23 à 25. Ce problème a été résolu par la découverte de protéines accessoires qui facilitent l'expression stable à la surface cellulaire d'un large éventail de RUP 19,26,27. Récepteur-transporteur protéines 1 et 2 (RTP1 et 2) promouvoir ou expression à la surface cellulaire et l'activation en réponse à la stimulation odorante 19. Sur la base de ce travail, les cellules étaient HEK293Tmodifiée pour exprimer de manière stable à long RTP1 (RTP1L) et RTP2, améliorant l'expression du récepteur de protéine 1, et G αolf, résultant dans la lignée cellulaire Hana3A 19,27. En outre, le récepteur de l'acétylcholine muscarinique de type 3 (M3-R) interagit avec RUP à la surface des cellules et augmente en réponse à l'activation 26 des agents odorants. La co-transfection d'un OU avec RTP1S et M3-R en Hana3A cellules résulte de l'expression robuste, cohérente et fonctionnelle d'un large éventail de RUP à la surface de la cellule 27. Deuxièmement, mammifères ou répertoires sont assez grandes. Chez les êtres humains, par exemple, le répertoire OR est un ordre de grandeur plus nombreux que le répertoire des récepteurs gustatifs, et deux ordres de grandeur plus nombreux que le répertoire des récepteurs visuelle. Bien que le clonage d'un simple OU est un protocole relativement simple, important effort initial est nécessaire pour générer une bibliothèque complète. Troisièmement, même si nous savons que dans la vision, la longueur d'onde se traduit par la couleur etla fréquence de l'audition se traduit pas, l'organisation des odeurs est mal comprise, ce qui rend difficile pour les chercheurs d'interpoler à partir d'un échantillon représentatif de substances odorantes. Bien que certains progrès ont été réalisés sur ce front 10,28, la carte du paysage olfactif reste incomplète. Dépistage des dizaines de milliers de molécules contre des centaines de RUP est une tâche ardue; criblages à haut débit dans ce domaine nécessitent des campagnes soigneusement définis. Les principaux défis à relever sont ceux de la logistique et des coûts plutôt que sur les problèmes inhérents à la technique. Bien que le dépistage hétérologue n'a pas été largement utilisé pour identifier des ligands par des groupes universitaires, une société privée a utilisé la même technique pour identifier des ligands pour 100 RUP humaines 29. Malheureusement, ces données restent propriétaires.

Le dosage de la luciférase à haut débit décrit ici présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes alternatives utilisées pour évaluer ou d'activation. Bien que la responsabilitésession de neurones sensoriels olfactifs indigènes ont été mesurées à l'aide d'électrophysiologie et d'imagerie calcique, ces techniques ont des difficultés à taquiner à part qui OU conduit à la réponse d'un neurone en raison du chevauchement dans les propriétés de réponse des neurones olfactifs. Bien que dans un cognement-GFP-étiqueté du récepteur de type 30,31, délivrant par l'intermédiaire de récepteurs spécifiques de l'adénovirus murins neurones olfactifs 32,33, ou d'effectuer une RT-PCR après enregistrements 17,24,33 peuvent lier des enregistrements de types de récepteurs individuels, ces méthodes sont faible débit et ne convient pas pour les écrans de grande envergure. Systèmes de contrôle hétérologues sont plus évolutive, et deux formes principales se trouvent dans la littérature: les journalistes de la voie de l'AMPc et l'inositol triphosphate (IP3) journalistes de la voie. Lors de la stimulation de l'odeur, RUP activent une cascade de signalisation αolf G de transduction qui conduit à la production d'AMP cyclique (AMPc) 12. Par co-transfection d'un gène rapporteur de luciférase de luciole sous le contrôle d'acÉlément de réponse à l'AMP (CRE), la production de la luciférase peut être mesurée en fonction de la réponse de l'odeur, ce qui permet la quantification de l'activation OU. Ou l'activation peut également être lié à la voie IP3 par la co-expression des protéines G telles que G α15/16 ou un G α15-olf chimère 24,25,34. Nous avons choisi le test présenté ici repose sur trois facteurs: (1) la co-expression de RTP1 avec récepteurs olfactifs Rho-marqués améliore l'expression des récepteurs olfactifs à la surface des cellules 19,27; (2) l'utilisation d'un gène rapporteur AMPc-sensible permet la mesure de OU activation par la voie de second messager canonique; et (3) le test est bien adaptée aux écrans à haut débit.

Ce dosage de la luciférase à haut débit est applicable à une variété d'études de grande valeur dans le domaine de l'olfaction. Premièrement, un grand nombre de RUP peut être criblée contre une seule substance odorante en vue de déterminer le motif de l'activation du récepteur pendant une spodorant ecific. Ce type d'étude a identifié OR7D4 comme le OU chargé de répondre à l'androsténone odorant stéroïde 8. Inversement, un ou peut être projeté contre un panneau de substances odorantes afin de déterminer le profil de la réponse du récepteur 10. Lorsque candidat olfactif odorant / OU paires sont identifiés par ces écrans, l'interaction peut être confirmé par la réalisation d'une expérience de dose-réponse examiner la réponse de la salle d'opération à des concentrations croissantes de substance odorante. courbes dose-réponse peuvent également évaluer la variation génétique dans une OU affecte en réponse odorant vitro 8,9,11,35, et ces études peuvent être étendues à interspécifique OU variation, permettant à l'examen de l'évolution des récepteurs à travers les espèces et les mutations causales dans l'évolution 36,37, Enfin, ce dosage peut être utilisé pour cribler des antagonistes d'odeurs qui sont capables d'antagoniser ou une réponse à une substance odorante particulier pour une paire odorant / récepteur connue 38,39. En résumé, cette hauteDosage de la luciférase-débit est applicable à une série d'études qui aideront à caractériser ou des motifs d'activation et de fournir une meilleure compréhension du codage des odeurs dans le système olfactif.

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Protocol

1. Culture de cellules Hana3A

  1. Préparer des milieux M10 en complétant le milieu essentiel minimum (MEM) avec 10% (v / v) de FBS.
  2. Culture Entretien
    1. Maintenir les cellules dans les médias M10. REMARQUE: Les vecteurs d'expression pour RTP1L, RTP2, REEP1, et G αolf confèrent une résistance à la puromycine à cellules Hana3A, mais le maintien des cellules avec cet antibiotique n'affecte pas significativement les résultats du dosage.
    2. Subculture à un rapport de 1:8 en boîtes de 10 cm tous les 2-3 jours.
    3. Incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2.

2. Cellules de placage pour la transfection

  1. Aspirer le milieu d'une confluence de 10 cm de cellules Hana3A 100%.
  2. Laver les cellules en ajoutant 10 ml de PBS, tourner le plat, et aspirer le PBS.
  3. Ajouter 3 ml de 0,05% de trypsine / EDTA et attendre pour que les cellules se dissocient (environ 1 min).
  4. Inactiver la trypsine en ajoutant 5 ml de M10 et de briser les mottes de cellules par trituration environ 10x &# 160; avec une pipette de 10 ml. Pipette avec précaution pour éviter l'introduction de bulles d'air dans les médias.
  5. Pour chaque plaque à 96 puits, le transfert de 1 ml de cellules dans un tube conique de 15 ml, centrifuger à 200 g pendant 5 min, et aspirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire.
  6. Remettre en suspension les cellules dans 6 ml de M10 par 1 ml de cellules transférées à l'étape 2.5.
  7. Introduire à la pipette 50 ul de cellules à chaque puits d'une plaque à 96 puits et incuber pendant une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2.

3. Transfection de récepteurs olfactifs

  1. Préparation d'ADN plasmidique
    1. Préparer l'ADN de plasmide par l'intermédiaire d'un protocole sans endotoxine. NOTE: L'utilisation des kits de préparation d'ADN plasmide désigné «exempt d'endotoxine", ou ajouter une étape d'extraction au phénol-chloroforme pour le protocole de préparation de l'ADN plasmidique.
    2. Diluer l'ADN jusqu'à une concentration de 100 ng / ul dans du tampon TE.
  2. Respecter les cellules étalées (étape 2.7) pour assurer une bonne confluence de rapprochementTely 30-50% par puits et retourner à l'incubateur. REMARQUE: Bien que ce confluence n'est pas optimal pour le réactif de transfection lipide, une confluence de 30 à 50% à cette étape est optimale pour la mesure de l'activité de luciférase 24 heures après transfection.
  3. Préparation du mélange de transfection
    1. Pipette RTP1S-PCI, M3-R-PCI, pCRE-luc, et pSV40-RL plasmides dans du milieu MEM par les volumes détaillés dans le tableau 1 pour rendre le mélange plasmide (volumes indiqués sont par plaque de 96 puits). RTP1S-PCI
      Plasmide mélange
      par puits par plaque de 96 puits
      MEM - 500 pl
      5 ng 480 ng
      M3-R-PCI 2,5 ng 240 ng
      pCRE-luc 10 ng 960 ng
      pSV40-RL 5 ng 480 ng

      Tableau 1. Plasmide composants de mélange. Par puits et par des volumes de plaques à 96 puits de RTP1S-PCI, M3-R-PCI, pCRE-luc, et pSV40-RL, et MEM.
    2. Pour chaque plaque à 96 puits, diluer 18 ul de réactif de transfection lipide dans 450 ul de milieu MEM.
    3. Pipette plasmide mélange (étape 3.3.1), la rhodopsine marqués récepteur olfactif dans pCI plasmide (Rho-OU-PCI), et des lipides mélange de transfection (de l'étape 3.3.2) pour rendre le Complexe détaillée dans le tableau 2. REMARQUE: cette réaction est sensible au temps et ne devrait pas être autorisé à poursuivre pendant plus de 30 min. Le puits + 10% calcul est important de s'assurer un volume suffisant pour les étapes suivantes. Transfection lipide mélange
      Complexe
      par puits par puits + 10%
      Plasmide mélange 4,2 pl 4,58 pi
      Rho-OU-PCI 0,05 ng 0,06 ng
      4,2 pl 4,58 pi
      M10 41,7 pi 45.83 pi

      Tableau 2. Des composants complexes par puits et par puits + 10% des volumes de mélange plasmide (tableau 1), le plasmide de récepteur olfactif (Rho-OU-pCI), et la transfection lipide mélange.. M10 est ajouté pour arrêter la réaction après une incubation de 15 min à température ambiante.
  1. Appuyez sur les médias sur les plaques de la cellule.
  2. Introduire à la pipette 50 ul de complexe à chaque puits et incuber pendant une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2.

4. Odeur Stimulation

  1. Respecter les cellules transfectées pour assurer une bonne confluence de 50-80% par puits et retourner à l'incubateur. Remarque: si des cellules sont à moins de 50% Confluentes, la luciférase de luciole et la luciférase de Renilla lectures peuvent être trop faible pour la mesure de l'activation du récepteur. Considérez jeter la plaque.
  2. Préparer une M d'solutions de chaque odeur dans le DMSO.
  3. Préparer des solutions de stimulation des odeurs en milieu CD293.
    1. Pour les expériences de dépistage, diluer la solution mère de l'odeur à 100 um. Préparer aussi un contrôle sans odeur (CD293 uniquement) afin de contrôler ou de l'activation de fond. NOTE: Pour les expériences de dépistage, chaque paire OU / odeur est testé une seule fois par l'expérience. Parce que certains diffusion des odeurs à travers les puits est possible, il est recommandé de stimuler avec une substance odorante pour chaque plaque.
    2. Pour les expériences de dose-réponse, préparer sept 10 dilutions en série de solution odeur de stock en trois exemplaires à partir de 1 mM pour chaque récepteur. Préparer également les mêmes dilutions d'odeur, en triple exemplaire pour les cellules transfectées par un vecteur vide, afin de contrôler l'odeur de l'activation d'arrière-plan. NOTE: Pour les expériences de dose-réponse, chaque otraitement de concentration de dor devrait être effectuée en triple.
  4. Appuyez sur les médias sur les plaques de la cellule.
  5. Pipette 25 ul de solution de stimulation de l'odeur à chaque puits et incuber pendant 4 heures.

5. Mesure ou une activité par dosage de luciférase

  1. Remettre en suspension substrat luciférase de luciole par les instructions et magasin du fabricant à -80 ° C.
  2. Décongeler 1 ml de substrat de la luciférase de luciole par plaque de 96 puits.
  3. Préparer réaction luciférase de luciole frais quencher et la luciférase de Renilla réactif de substrat (5 ul luciférase quencher / Renilla luciférase de substrat pour 1 ml de tampon). REMARQUE: Environ 1 ml de réactif est nécessaire par plaque de 96 puits.
  4. Préparer le lecteur luminescent de microplaques. Ouvrez le logiciel de lecteur de microplaques. Dans l'icône du système:
    1. Dans le cadre du "pré-chauffage" Tab, cochez la case "ON" et régler la température de la machine à 25 °; C.
    2. Sous l'onglet «distributeur», le premier de chaque distributeur avec 1000 ul de 70% d'éthanol suivie par 1 000 pi d'eau distillée. REMARQUE: Utilisez des portions séparées de l'alcool et de l'eau pour chaque distributeur. L'éthanol est utilisé pour désinfecter les distributeurs, et de l'eau élimine l'éthanol résiduel.
    3. Premier distributeur de chaque 1500 pi de l'air (supprimer les distributeurs de liquide). REMARQUE: amorçage avec de l'air assure que les substrats de luciférase sont pas dilués avec de l'eau résiduelle.
    4. Premier distributeur 1 avec 1080 ul de substrat de la luciférase de luciole (de l'étape 5.2). Premier distributeur 2 avec Renilla substrat de la luciférase (de l'étape 5.3). REMARQUE: Veillez à ne pas contaminer les substrats de luciférase. Amorçage avec des substrats de luciférase remplit l'espace mort dans les distributeurs de réactifs.
  5. Mettre en place le protocole suivant pour lire à la fois luciole et de Renilla luminescence. Dans le logiciel associé au lecteur de microplaques, nonder le menu "Fichier", cliquez sur "Nouvelle tâche". Mettez en surbrillance "Protocoles" et cliquez sur "Créer nouveau". Dans la fenêtre suivante, le cercle à côté de "protocole standard" doit être sélectionné. Cliquez sur "OK". Double-cliquez sur «Procédure» sur le côté gauche de l'écran.
    1. Distribuer 10 ul de substrat de la luciférase de luciole à tous les puits à l'aide de distributeur 1. Dans le menu "Actions", cliquez sur "Dispense". Dans la fenêtre «Distribuer étape", set: «Distributeur» à 1, "Amorçage" à aucun, "Volume Dispense" à 10 pi et "Rate" à 225 pi / sec. Cliquez sur "OK".
    2. Agiter la plaque pendant 30 sec. Dans le menu "Actions", cliquez sur "Shake". Dans la fenêtre «Secouez étape", réglez "Intensity" à moyen et «Durée» à 00h30 MM: SS. Cliquez sur "OK".
    3. Lire la luminescence de tous les puits de 0,5 sec par puits. Dans le menu "Actions", cliquez sur "Lire";. Dans la fenêtre "Lire étape", set: «Méthode de détection" à luminescence, "Lire Type" Endpoint "temps d'intégration" à 00:00:50 MM: SS: ss, "jeux de filtres" à une "émission" Hole, "Optique Position" de la page "Gain" à 135, et "Lire Hauteur" à 1,00 mm. Cliquez sur "OK".
    4. Distribuer 10 ul de substrat de la luciférase Renilla à tous les puits à l'aide de distributeur 2. Définissez les conditions à l'étape 5.6.1, sauf ensemble "distributeur" à 2.
    5. Agiter la plaque pendant 30 secondes. Fixer les conditions que l'étape 5.6.2.
    6. Lire la luminescence de tous les puits de 0,5 sec par puits. Fixer les conditions que l'étape 5.6.3.
  6. Retirez le couvercle de la plaque à 96 puits et placer la plaque dans le lecteur de microplaques. Démarrez le programme mis en place à l'étape 5.5 pour lire plaque luminescence.
  7. Nettoyez les pompes de distribution de réactifs. De l'icône du système sous l'onglet «distributeur»:
    1. Purger 1000 pi de firefly substrat de la luciférase de la luciole luciférase distributeur dans un tube de récupération. REMARQUE: la luciférase de luciole peut être stocké à -80 ° C, et réutilisés.
    2. Premier distributeur de chaque 1000 pi d'eau distillée, puis de 1000 pi de 70% d'éthanol, et enfin 1500 pi de l'air (supprimer les distributeurs de liquide). REMARQUE: L'eau élimine les substrats de luciférase des pompes de réactifs, désinfecte d'éthanol et sèche à l'air tout éthanol résiduel.

6. Analyse des données

  1. Data Export
    1. Dans le logiciel de lecteur de microplaques, double-cliquez sur "Rapport / Export constructeurs» sur le côté gauche de l'écran.
    2. Cliquez sur le bouton "Nouveau Exporter vers Excel" et cliquez sur "OK".
    3. Sélectionnez Export1 et cliquez sur "Modifier".
      1. Sous la rubrique «Contenu» cochez la case «Description du système", "procédure", "Plate Description», et «disposition de la plaque Matrix". Inclure un "données brutes"e "Calculé données".
      2. Sous "Workflow", cochez la case "Exécuter automatiquement à l'issue de la procédure". Sous le mode d'exportation, consultez «Toutes les plaques dans le même classeur» et «En tant que nouvelle feuille de calcul".
      3. Sous "Fichier" puis choisissez le format du nom de fichier et l'emplacement du fichier, et cliquez sur "OK".
      4. Fermez la fenêtre "Rapport / constructeurs exportation".
  2. Pour obtenir des valeurs de luciférase normalisées, diviser la luciférase de luciole lecture de luminescence pour chaque puits (étape 5.6.3) par la lecture de luminescence Renilla pour chaque puits (étape 5.6.6).

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Representative Results

Un écran primaire testé 328 RUP contre 26 odeurs à une concentration de 100 uM. Cette concentration d'odeur a été démontrée pour activer efficacement une grande proportion des RUP avec des ligands connus 10. Tout d'abord, l'activité de la luciférase normalisée a été calculée en divisant la lecture de la luciférase de luciole par la luciférase de Renilla lecture. Ensuite, les valeurs baselined ont été calculées en soustrayant les lectures de la luciférase normalisée pour la commande de pas d'odeur à partir des lectures de la luciférase normalisée pour chaque puits (Figure 1). Les courbes de dose-réponse ont été réalisées sur 48 odorant / OU paires réparties de manière aléatoire sur toute la gamme de valeurs baselined, comme indiqué par des barres de couleur dans la figure 1. RUP ont été traités avec 7 concentrations de substance odorante qui s'étend de 1 nM à 1 mM, et les réponses résultantes ont été ajustées à une courbe sigmoïde en utilisant une régression non linéaire. Un odorant / OU a été considéré comme un agoniste si elle répondait à trois critères: (1) l'erreur-type dela logEC 50 était inférieure à 1 unité de journal; (2) les intervalles de confiance à 95% pour les paramètres du haut et du bas de la courbe ne se chevauchent pas; et (3) le test supplémentaire sommes des carrés a confirmé que la substance odorante activé les cellules OU contenant nettement plus que les cellules de contrôle, qui ont été transfectées avec un vecteur vide. résultats dose-réponse sont résumés dans le tableau 3.

Ces données ont ensuite été utilisées pour déterminer la façon dont les mesures essai dans un écran principal de prédire les résultats de la courbe dose-réponse. Les barres bleues de la figure 1 correspondent à des paires qui ont été classés comme des agonistes dans une expérience dose-réponse complète, tandis que les barres rouges ne répondent pas à nos trois critères énoncés ci-dessus. Les valeurs de l'écran principal prédit les résultats de la dose complète expérience de réponse (aire sous la courbe ROC (AUC) = 0,68, p <0,01, test de Mann-Whitney U), ce qui indique que notre écran principal est une méthode utile pour enrichir odorantes / OU paires qui seront classés comme des agonistes dans une expérience dose-réponse complète (Figure 2).

Figure 1
Figure 1. Fréquence des valeurs de luciférase baselined pour un écran avec un panel de récepteurs et odorants. Histogramme de la fréquence (chef) des valeurs de luciférase baselined calculés pour chaque substance odorante / OU paire dans l'écran principal olfactifs. Sous forme de paires d'activation odorant / réceptrices sont rares, la majorité des valeurs sont centrées à zéro et la grande distribution central estime la distribution de bruit pour ce dosage. Barres de couleur indiquent paires odorant / récepteurs choisis pour l'analyse dose-réponse; barres bleues sont des paires qui ont été classés comme des agonistes sur la base de la réponse de la dose complète, et les barres rouges sont des paires qui n'ont pas été classés comme des agonistes.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51640/51640fig1highres.jpg" target = "_blank"> Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2
Figure 2. Courbe ROC pour l'écran odorant / récepteur. 48 paires odorant / récepteurs ont été classés comme étant des agonistes ou comme n'étant pas des agonistes. Taux positif vrai (sensibilité) est ensuite tracée en fonction du taux de faux positifs (1-spécificité) en utilisant le logiciel statistique R 40. L'aire sous la courbe (AUC) est de 0,68, ce qui indique que les paires odorant / récepteurs avec des valeurs plus élevées de l'écran luciférase sont plus susceptibles de transmettre la réponse de dose que ceux avec des valeurs inférieures. Cliquez ici pour agrandir l'image.

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Valeur baselined Réponse dose
0,051793067 échouer
0,006376956 échouer
0,331936398 passer
0,591006519 passer
0,049093369 passer
0,396788976 passer
-0,013655743 passer
0,011080217 passer
0,004203349 échouer
0,003975049 échouer
-0,077935718 passer
-0,084488317 passer
0,030236078 échouer
-0,042963576 échouer
0,031466406 échouer
0,025897747 échouer
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0,028883452 échouer
0,019402373 échouer
0,047508749 échouer
0.00255344 échouer
0,017221449 échouer
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-0,026912181 échouer
0,037140428 échouer
0,467763017 passer
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0,016784352 passer
0,229959571 passer
0,238381997 échouer
0,074118909 échouer
0,423901128 passer
0,152621022 passer
passer
0,075301806 passer
0,395233972 passer
0,261892958 passer
0,156693306 échouer
2,163418147 passer
3,649862104 passer
0,025716169 passer
-0,033258008 passer
-0,026984127 échouer
-0,338441868 passer
0.37398618 passer

Tableau 3. Olfactive paires récepteur / odeurs testées en réponse à la dose. Valeurs de luciférase baselined et les résultats dose-réponse (réussite ou échec) pour 48 OU / odeur paires choisies de l'écran. Pour 30 paires testées dans l'écran deux fois, les deux valeurs de luciférase baselined sont inclus.

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Discussion

Identité odorant est codé par des motifs d'activation des récepteurs olfactifs, mais les modèles d'activation des récepteurs, y compris les récepteurs qui sont activées et à quel degré, sont connus pour moins de 6% des récepteurs olfactifs humains 1-11. Les efforts visant à caractériser les récepteurs olfactifs ont été limités par leurs méthodes ou de l'applicabilité de main-d'œuvre à un sous-ensemble de la 17,23,24,33,34 de famille de récepteur olfactif. Le système d'expression hétérologue Hana3A soutient l'expression robuste de la majorité des récepteurs olfactifs testés, et peut être utilisé en conjonction avec un système rapporteur de luciférase sensible à l'AMPc contrôler l'activation du récepteur olfactif 19,26,27. Les performances de ce test dans un format de 96 puits en charge un certain nombre de haut-débit des modèles expérimentaux, y compris les écrans afin de déterminer les candidats probables pour les paires odorant / récepteurs olfactifs et courbes dose-réponse pour confirmer les interactions et d'évaluer la façon dont les niveaux d'activation du récepteur sont affected par les variations intra-et inter-spécifiques. Paires odorant / récepteur avec les valeurs d'activité supérieurs à un écran sont plus susceptibles de démontrer une relation dose-réponse significative. Ces données suggèrent que ce procédé de criblage est capable d'enrichir pour des paires odorant / récepteurs qui passe la réponse à la dose, ce qui facilite l'identification de ligands olfactifs et les modes d'activation des récepteurs olfactifs.

Le succès de cet essai optimisée pour l'analyse des récepteurs olfactifs dépend de plusieurs facteurs. Tous les ADN de plasmide doit être préparé par l'intermédiaire d'un protocole sans endotoxine. L'expression du récepteur olfactif conforme à la surface de la cellule est essentielle. La lignée cellulaire Hana3A exprime de façon stable plusieurs protéines accessoires qui aident à OU expression, mais co-transfection de RTP1S et M3-R améliore l'expression du récepteur et l'activation, respectivement 27. Cette combinaison d'expression de la protéine accessoire se traduit par l'expression fiable de la plupart des récepteurs olfactifs, permettant la COMPARAISOn OU activation entre les expériences et les récepteurs. En outre, la surveillance de la confluence cellulaire est importante pour obtenir des résultats cohérents. En supposant les cellules dans le plat original 10 cm 2 sont à peu près 100% de confluence, en suivant le protocole décrit ici se traduira par la confluence cellulaire fiable tout au long de l'expérience. Surtout, suffisamment de cellules seront étalées pour obtenir une lecture de la luciférase mesurables, mais les cellules ne seront pas trop cultivés, une condition qui peut affecter l'activation du récepteur suivant la stimulation odorante. La normalisation de l'expression constitutive de Renilla commande en outre, non seulement pour la densité des cellules, mais aussi pour l'efficacité de transfection. Un luciférase renilla lire plus de 2,5 écarts-types en dessous de la moyenne peut indiquer une perte de cellule. Les cellules doivent être étalés de manière uniforme pour éviter de plaques épaisses qui se détachent plus facilement de la surface de la plaque de cellules clairsemées, et des solutions de transfection et odorantes doivent être ajoutés doucement sur le côté du puits afin d'éviter le détachement cells. perte cellulaire pourrait aussi être due à la mort cellulaire provoquée par la toxicité odorant, un problème qui peut être contourné en abaissant la concentration odorante, ou DMSO excessive, qui peut être évité en gardant les concentrations de DMSO en dessous de 0,5%. Enfin, le traitement de chaque population de cellules exprimant le récepteur avec 1 uM de forskoline, un activateur de l'adénylate cyclase qui provoque l'expression rapporteur de luciférase à partir du promoteur sensible à l'AMPc, peut servir de témoin positif pour le test.

Bien que le test décrit ici représente une amélioration par rapport à d'autres méthodes, y compris un format à haut débit et plus d'une applicabilité générale à la famille des récepteurs olfactifs chez les mammifères, il a ses limites. Tout d'abord, notre analyse in vitro n'a pas beaucoup de composants d'un système olfactif in vivo, y compris des protéines de liaison d'une couche odorantes, des muqueuses, des molécules intracellulaires et les comportements de reniflement. En second lieu, cette méthode repose sur un système de rapporteur de la luciférase pour mesurer récepteur olfactifactivation par contraste avec d'autres méthodes d'imagerie qui utilisent des courants de calcium. Des travaux récents suggèrent que ces deux méthodes peuvent produire des résultats contradictoires; en effet, quelques récepteurs olfactifs répondent à un odorant particulier lorsqu'il est examiné par imagerie calcique mais pas essai luciférase 41. Que l'on type d'essai est plus pertinent pour les études de perception olfactive humaine reste incertaine, mais les deux méthodes pourrait être utile selon le contexte et le type de récepteur. Troisièmement, alors que ce système d'expression fonctionnelle a été utilisée avec succès pour exprimer la majorité des récepteurs olfactifs de mammifères testés, certaines RUP ne se prêtent pas à l'expression en utilisant ce système. Si les récepteurs non définies auparavant ne parviennent pas à répondre à une odeur, il peut être en raison du manque d'expression à la surface cellulaire au lieu d'un manque d'interaction entre le récepteur et la substance odorante. cellulaire des récepteurs expression de surface peut être examinée via immunofluorescence avant de tirer des conclusions à partir de résultats de dosage négatif 27,42 38,39, la plupart des récepteurs doivent d'abord être stimulées avec une odeur afin d'observer une réduction de l'activité de la luciférase.

En dépit de ces limitations, ce système de dosage a la capacité d'augmenter considérablement l'acquisition de données dans le domaine de l'olfaction. Tout d'abord, le format à haut débit de 96 puits rend écrans des récepteurs et / ou odeur à grande échelle possible. En second lieu, le système d'expression hétérologue est applicable à une variété de récepteurs olfactifs de mammifères. Troisièmement, l'activité de la luciférase peut être utilisée pour mesurer l'activation du récepteur olfactif, ce qui est valable dans la description des schémas d'activation du récepteur pour une substance odorante donnée. Quatrièmement, les résultats précédents de systèmes d'essai in vitro similaires à prédire la perception olfactive humaine 8,11,35. Ces caractéristiques sont particulièrement importante étant donné la taille de la famille de récepteur olfactif des mammifères et notre connaissance limitée en ce qui concerne les motifs OU d'activation induites par les odeurs spécifiques. Large application de ce système de dosage optimisé pour l'analyse de récepteur olfactif contribuera à une image plus complète de récepteurs olfactifs / interaction odorant et la base moléculaire de codage des odeurs.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par R01 DC013339, R03 DC011373, et Ruth L. Kirschstein Service national de la recherche Prix T32 DC000014. Une partie des travaux a été réalisée en utilisant le Monell Chemosensory signalisation des récepteurs de base, qui est pris en charge, en partie, par le financement de la P30 DC011735 NIH-NIDCD base Grant. Les auteurs remercient C. Sézille de l'aide à la collecte de données.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hana3A cells Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request
RTP1S-pCI Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request
M3-R-pCI Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request
pCRE-luc Agilent 219076 LUC
pSV40-RL Promega E2231 RL
Minimum Essential Media, Eagle Sigma Aldrich M4655 MEM
FBS Life Technologies 16000-044 FBS
PBS (without Ca2+ and Mg2+) Cellgro 21-040-CV PBS
Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) Life Technologies 25300 Trypsin
CD293 Life Technologies 11913-019 CD293
96-well PDL white/clear plate BD BioCoat 356693 plates
Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Lipofectamine
Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay Promega E2980 dual glo
Synergy S2  BioTek SLAD BioTek S2
Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software BioTek Gen5 Gen5
BIOSTACK BioTek BIOSTACK2WR BioStack
Multiflo BioTek MFP MultiFlo
300 μl GripTips Integra 4433 GripTips
12.5 μl GripTips Integra 4414 GripTips
300 μl GripTips ViaFlo96 Integra 6433 XYZ tips
12.5 μl GripTips 384 XYZ Integra 6403 XYZ tips
384ViaFlo Integra 6030 384ViaFlo
TE buffer Macherey Nagel 740797.1
DMSO Sigma Aldrich D2650-100ML DMSO
Forskolin Enzo Life Sciences BML-CN100-0010 FOR

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