استقرار الكبدي النمط الظاهري عن طريق الأسطح الاصطناعية محسن

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذه المادة سوف تركز على تطوير البوليمر المغلفة السطوح على المدى الطويل، ثقافة مستقرة من الخلايا الجذعية المستمدة خلايا الكبد البشرية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lucendo-Villarin, B., Cameron, K., Szkolnicka, D., Travers, P., Khan, F., Walton, J. G., Iredale, J., Bradley, M., Hay, D. C. Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces. J. Vis. Exp. (91), e51723, doi:10.3791/51723 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

وقد استخدمت على نطاق واسع المواد البيولوجية في صيانة وتمايز الخلايا الجذعية المحفزة 1. مع تمكين، وهذه ركائز البيولوجية غالبا ما تحتوي على عدد لا يحصى من المكونات غير محددة. Matrigel هو الركيزة تستخدم عادة لزراعة الخلايا الجذعية وتمايز. للأسف، تكوينه المتغير يؤثر وظائف الخلايا والنمط الظاهري. على الرغم من مجموعة متنوعة من المصفوفات البيولوجية البديلة، وأكثر تحديدا استخدمت 2-7، أصل حيواني أو ضعف قابلية يجعلهم مرشحين غير صالحة للتصنيع الصناعي. ولتحديد البدائل الاصطناعية، مع تكوين المعرفة والأداء الموثوق بها، هي الأهداف الرئيسية في أبحاث الخلايا الجذعية.

في محاولة للتغلب على قيود غير محددة ركائز ثقافة الخلية، وقد حددت التخصصات التعاون بين الكيمياء وعلم الأحياء المواد الاصطناعية مع القدرة على دعم النمط الظاهري الخلية. موالفةركائز ETIC هي قابلة للتطوير، فعالة من حيث التكلفة، ويمكن تصنيعها في الهياكل المعقدة 3D، ومحاكاة البيئة في الجسم الحي. بسبب هذه الخصائص ركائز الاصطناعية واستخدمت على نطاق واسع لدعم ودفع التفريق بين العديد من أنواع الخلايا 8-10.

وقد فحوصات متقدمة وعالية الإنتاجية تسهيل الفرز السريع للمواد الاصطناعية، من المكتبات الكبيرة، وتسليم مواد جديدة ذات خصائص مرنة مع تطبيقات واسعة في مجال البحوث الطبية الحيوية والتنمية 11-13. استخدام إنتاجية عالية البوليمر تكنولوجيا الفحص الصغيرة مجموعة، حددنا بسرعة البولي يوريثين بسيط (PU134)، ومناسبة لصيانة الخلايا الجذعية خلايا الكبد البشرية المشتقة. تم العثور على هذا البوليمر لتكون متفوقة على ركائز المستمدة الحيوانية فيما يتعلق التمايز الكبدية وظيفة 14-16. لقد الأمثل لاحقا عملية طلاء الظروف والتضاريس والتعقيم للوصول الآثارعلى الأداء البوليمر في تحقيق الاستقرار في وظيفة الكبدية وعمر. هذا له آثار هامة فيما يتعلق فهم أساسيات علم الأحياء الكبدية لنمذجة تستند خلية والتطبيقات الطب التجديدي.

التكنولوجيا وصفها هنا تمثل مثالا على كيفية سطح البوليمر الاصطناعية يمكن أن يكون الأمثل للحفاظ على النمط الظاهري الخلية. ونحن نعتقد أن الجمع بين هذه التكنولوجيا مع مصل فعال الكبدية المجانية بروتوكول التمايز لديه القدرة على توفير إنتاج قابلة للاستخدام من خلايا الكبد في المختبر، والنمذجة في الطب التجديدي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. توليف PHNGAD (بولى [1،6-hexanodiol / neopentyl غليكول / دي (جلايكول الإثيلين) حمض الأديبيك -alt-] ديول)

مخطط 1

مخطط 1: توليف PHNAGD تمثيل تخطيطي لتركيب PHNAGD. كان من رد الفعل من 1،6-Hexanodiol، جلايكول الاثيلين، وجلايكول neoppentyl وحمض الأديبيك أعدت PHNAGD. PHNAGD، بولي [1،6-hexanodiol / neopentyl غليكول / دي (جلايكول الإثيلين) حمض الأديبيك -alt-] ديول.

  1. تطبيق المعالجة الحرارية للأحادية 1،6-الهيكسنديول، دي (جلايكول الإثيلين) وneopentyl غليكول عند 40 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في فرن فراغ لإزالة أي المياه المتبقية. السماح للبرد وصولا الى RT تحت فراغ.
  2. إضافة 22 مليمول لكل مونومر وحمض الأديبيك (55 ملمول) إلى قاع القارورة ذهابا والعنق اثنين مجهزة أثار شريط ومتصلا جهاز عميد-ستارك.
  3. وضع التجمع كله في ظل فراغ والحرارة بلطف GLAssware عند 40 درجة مئوية لمدة 6 ساعة، من أجل تجنب أي امتصاص الرطوبة خلال إضافة المادة الكيميائية في قارورة.
  4. إضافة عن طريق حقنة، قطرة قطرة، 0.0055 مول من التيتانيوم الحفاز (IV) باتوكسايد.
  5. تحريك خليط التفاعل عند 180 درجة مئوية تحت جو N 2 لمدة 24 ساعة، وجمع المياه المتبقية في فخ عميد-ستارك. السماح لتبريد المنتج إلى RT.

2. توليف PU134

مخطط 2

مخطط 2: توليف PU134 تمثيل تخطيطي لتركيب البولي يوريثين 134. تم بواسطة تفاعل 1.0 EQUIV من PHNGAD مع 2.0 EQUIV من 4،4'-Methylenebis (فينيل الإيزوسيانات) التي أعدت PU134، تليها إضافة 1.0. EQUIV من سلسلة الموسع 1،4-بيوتانديول.

  1. خلط أي ما يعادل واحد من PHNGAD البوليول (مليون ~ 1،800 دا، 3.2 ملمول) مع اثنين من مكافئات من 4"4 Methylenebis (فينيل الإيزوسيانات) (6.4 ملمول) في اللامائية N، N -Dimethylformamide (12 مل).
  2. تحريك خليط التفاعل عند 70 درجة مئوية، وتحت جو N 2.
  3. إضافة عن طريق حقنة، قطرة قطرة التيتانيوم الحفاز (IV) باتوكسايد (0.8٪ بالوزن).
  4. بعد 1 ساعة، إضافة يعادل واحد من سلسلة الموسع 1،4-بيوتانديول (3.2 ملمول). زيادة درجة الحرارة عند 90 درجة مئوية ويقلب لمدة 24 ساعة تحت جو N 2.
  5. بعد رد فعل، وجمع البولي عن طريق الترسيب بإضافة ايثر (الهكسان أو الماء يمكن أن تستخدم أيضا) إسقاط الحكمة في حل رد فعل حتى يحدث هطول الأمطار.
  6. الحل الطرد المركزي في 5،300 x ج لمدة 5 دقائق.
  7. صب طاف وتجفيف قبالة عند 40 درجة مئوية في فرن فراغ حتى يتبخر المذيب.
    ملاحظة: من أجل ضمان أن المنتج النهائي للتفاعل تمتلك المعلمات الصحيحة بشأن لتوزيع الوزن الجزيئي، والحبو وظيفيةملاحظة من البوليمر، وذوبان ودرجات حرارة التحول الزجاجي، وتقنيات وأساليب تحليلية مختلفة يمكن استخدامها، مثل هلام تخلل اللوني الطيفي أو عيد الفطر.

3. إعداد حلول PU134

  1. تزن 200 ملغ من PU134 في زجاجة.
  2. تمييع PU134 إلى تركيز النهائي من 2٪ في عدد من المذيبات: الكلوروفورم، وهو مزيج من الكلوروفورم والتولوين في نسبة 1: 1، رباعي هيدرو الفوران، ومزيج من رباعي هيدرو الفوران وdicloromethane في نسبة 1: 1.
    ملاحظة: انتخاب المذيب المناسب تختلف تبعا لاستخدام البوليمر. مذيبات مختلفة تمتلك نقطة الغليان المختلفة التي يمكن أن تؤثر على ذوبان من البوليمر.
  3. يهز الحل بقوة لمدة 20 دقيقة في RT باستخدام شاكر بسرعة 200 يذكره / دقيقة، حتى يصبح حل متجانس ويتم احترام أي راسب.

4. طلاء الزجاج الشرائح مع PU134

  1. وضع ROUالثانية 15 مم 2 ساترة على المغطي تدور.
  2. تطبيق 50 ميكرولتر من الحل PU134 إلى كل باستخدام ماصة. ضبط مستوى الصوت من الحل PU134 فقا لحجم ساترة يتطلب إبقاء حجم تطفو على السطح نسبة متناسبة.
  3. تدور كل ساترة لمدة 7 ثانية في 23 × ز.
  4. الهواء ساترة الجافة في RT لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التعقيم.

5. تشعيع ساترة

  1. غاما أشرق البوليمر المغلفة ساترة من خلال تطبيق جرعة من 10 غرايز باستخدام irradiator المختبر لمدة 12 دقيقة.
  2. الأشعة فوق البنفسجية أشرق البوليمر المغلفة ساترة باستخدام 30 واط، مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمدة 16 دقيقة كل جانب.
  3. وضع البوليمر المغلفة ساترة في مناسبة لوحة الثقافة الأنسجة وفقا لحجم الشريحة.

6. المجهر الإلكتروني

  1. معطف الذهب البوليمر ساترة بواسطة الاخرق لمدة 200 ثانية في جو من 5 × 10 -1 مليبار من الضغط.
  2. التقاط ميكروغرامraphs من البوليمر المغلفة ساترة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح في تسريع والجهد 20 كيلو فولت في وضع التصوير الإلكترون الثانوي.

7. الملاحظات القوة الذرية الميكروسكوب

  1. مسح مساحة 20 × 20 ميكرون من سطح البوليمر.
  2. إنشاء معدل المسح من 1.32 إلى 1.60 هرتز هرتز.
  3. تشكيل لقرار 512 X 512 بكسل في المنطقة الممسوحة ضوئيا.
  4. حساب الجذر يعني مربع (RMS أو RQ) للطلاء باستخدام متوسط ​​الانحرافات ارتفاع مأخوذة من طائرة بيانات الصورة يعني، معبرا عنه:

    حيث تسى هو القيمة Z الحالية، وN هو عدد من النقاط داخل منطقة معينة.
  5. 7.5 احسب الانحراف أو يعني خشونة السطح (رع) من الصورة باستخدام،

    حيث Z (خ) هو الدالة التي تصف ركان السطح الشخصي تحليلها من حيث الارتفاع (Z) وموقف (س) من العينة على طول التقييم "L". رع يمثل القيمة المتوسطة لسطح نسبة إلى الطائرة المركز.

8. زراعة الخلايا والتمايز

  1. الثقافة والتفريق بين الجنينية البشرية خط الخلايا الجذعية (HESC) H9 كما هو موضح في الحي 17.
  2. فصل الخلايا باستخدام كاشف التفكك وreplate لهم على PU134 الشرائح المغلفة في يوم 9 من عملية التمايز، في حضور وسيط الحرة المصل كما وصف في Szkolnicka 18،19.
    ملاحظة: يفضل استخدام لتفكك خلية الأنزيمية إلى انفصال الخلايا الجسدية.

9. السيتوكروم P450 الفحص وظيفية

  1. قياس النشاط CYP3A باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  2. احتضان HESC خلايا الكبد المشتقة في يوم 13 أو يوم 19، وسائل الإعلام دون خلايا - كعنصر تحكم السلبية، مع SUBSTR المناسبأكل لمدة 5 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  3. جمع supernatants من الخلايا وسائل الإعلام، وإجراء الفحص وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  4. قياس مستوى النشاط CYP وتطبيع قريب للمساحة (سم 2).

10. المناعية

  1. غسل HESC المستمدة خلايا الكبد مع برنامج تلفزيوني، لمدة 1 دقيقة، كرر مرتين.
  2. إضافة الجليد الباردة الميثانول بنسبة 100٪ لإصلاح الخلايا، ومكان في -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق وتكرر مرتين.
  4. احتضان الخلايا مع PBS / T (0.1٪ توين) / 10٪ BSA لمدة 1 ساعة على RT.
  5. نضح حل PBST وإضافة الأجسام المضادة الأولية المناسبة المخفف في PBS / T (0.1٪ توين) / 1٪ BSA، احتضان عند 4 درجات مئوية مع طيف الانفعالات O / N.
  6. غسل الخلايا مع PBS / T (0.1٪ توين) / 1٪ BSA لمدة 5 دقائق وكرر ثلاث مرات.
  7. تمييع الأجسام المضادة المناسب في PBS / T (0.1٪ توين) / 1٪ BSA، إضافة إلى الخلايا واحتضان في الظلام في RT لمدة 1 ساعة مع الإثارة لطيف.
  8. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق وتكرر ثلاث مرات.
  9. إضافة MOWIOL 488 (التي تحتوي على دابي 1: 1،000) إلى كل بئر، إضافة ساترة بلطف للحد من عدد من فقاعات الهواء. تخزين خلايا ثابتة في 4 درجات مئوية في الظلام. مراقبة تلطيخ باستخدام مجهر مع مرشح المناسب ومصباح الفلورسنت. يتم سرد الأجسام المضادة الأولية والثانوية الأمثل في الجدول 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

المذيب البوليمر يؤثر على تضاريس سطح البوليمر المغلفة

كان يذوب البولي يوريثين 134 في الكلوروفورم، إما وحدها أو بالاشتراك مع التولوين أو رباعي هيدرو الفوران أو ثنائي كلورو ميثان والشرائح الزجاجية المغلفة تدور مع تركيبات مختلفة. تم استخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) والمجهري القوة الذرية (AFM) لوصف الخصائص الفيزيائية للطلاء البوليمر (الشكل 1). كان طلاء تم الحصول عليها باستخدام التولوين أو الكلوروفورم يست متجانسة، مما يدل على طلاء غير المتكافئ مع هطول PU134 (الشكل 1A). في المقابل، كان رباعي هيدرو الفوران مذيب مناسب السماح للطلاء تدور على أكثر من ذلك بكثير موحدة السطحية (الشكل 1A). وقد تم قياس تضاريس السطح من خلال AFM باستخدام الجذر يعني مربع (RMS) وخشونة متوسط ​​(رع). PU134 رباعي هيدرو الفوران حل أظهرت انخفاضا بنسبة 40٪ في خشونة بالمقارنة إلى الالبريد غيرها من المذيبات (الشكل 1B و 1C). وتظهر هذه البيانات أن استخدام رباعي هيدرو الفوران كمذيب يوفر طلاء أكثر اتساقا من PU134 لتطبيق البيولوجي.

تضاريس البوليمر له تأثير كبير على وظيفة الكبدية

HESC يمكن التمييز بكفاءة لالأديم الباطن الكبد في المختبر، واظهار العديد من الوظائف الموجودة في الكبد الكبار 17-20. وكان المستحث الكبدي الأديم الباطن التمايز وكان في يوم 9 خلايا شبيهة أرومة كبدية واضح، مع غالبية الخلايا معربا عن cytokeratin 19 (99٪ ± 1.2)، α-بروتين جنيني (99٪ ± 0.6)، والكبد العامل النووي 4α (97٪ ± 2.6). وانخفاض مستويات الزلال (20٪ ± 1.7) (الشكل 2). في هذه المرحلة تم فصل الخلايا باستخدام TrypLE التعبير وreplated على البوليمر المغلفة السطوح المختلفة. كإجراء وظيفة التمثيل الغذائي، السيتوكروم P450 ومرهم تم تقييم 4 أيام بعد replating. لاحظنا زيادة بنسبة 2 أضعاف في النشاط الأيضي في الخلايا replated على رباعي هيدرو الفوران / أسطح PU134 المغلفة (الشكل 3). هذه النتائج تثبت أن HESC المستمدة النشاط الأيضي الكبدية وتحسنت مع طلاء موحد أكثر من PU134، وهذا يتسق مع النهج السابق 21.

آثار تعقيم السطح على الخصائص النشطة بيولوجيا من البوليمر

تم التحقيق أيضا تأثير التعقيم على أداء PU134. تعرضت البوليمر الشرائح الزجاجية المغلفة للأشعة فوق البنفسجية أو أشعة جاما. أظهر مرحلة التصوير النقيض من الشرائح الزجاجية المغلفة PU134 عدم وجود اختلافات صارخة في مرحلة ما بعد الأشعة فوق البنفسجية أو أشعة جاما (الشكل 4A). وتأكدت هذه الملاحظات مزيدا من التحليل SEM (الشكل 4B). تم فحص أداء البيولوجي للPU134 باستخدام خلايا الكبد المشتقة HESC في 10 يوما بعد replating. HESC المشتقةخلايا الكبد replated على الشرائح الزجاجية PU134 المغلفة يشع γ عرض زيادة 3 أضعاف في النشاط CYP3A على خلايا replated على الشرائح الزجاجية PU134 المغلفة يشع الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 4C). أظهرت هذه الملاحظات التي كان التشعيع بأشعة غاما تقنية التعقيم الأمثل لأغراضنا.

الشكل 1
الرقم 1. الأمثل لسطح البولي يوريثين المغلفة 134. والشرائح المغلفة (A) الزجاج بمحلول 2٪ من PU134 مذابة في مذيبات مختلفة. المجهر الإلكتروني (SEM) وصور من مختلف الشرائح الزجاجية المطلية تظهر وجود السطح المطلي متجانسة وعدم وجود البوليمر يترسب عندما استخدمت رباعي هيدرو الفوران مقارنة مع التولوين، والكلوروفورم أو خليط من المذيبات (أسود والسهام البيضاء). أخذت الصور في x1664 التكبير والمقاييس الحانات ع البريد هو مبين أدناه الصور. كان يعمل قوة (BC) الذرية المجهري (AFM) لتحليل خشونة السطوح PU134 المغلفة على مذيبات مختارة. تحليل خشونة RMS (جذر متوسط ​​مربع) (B) ورأس (خشونة متوسط) (C) من PU134 المغلفة السطوح المختلفة تبين أن طلاء الحصول عليها باستخدام رباعي هيدرو الفوران كمذيب زيارتها أسلس السطحية بالمقارنة مع بقية الشروط (ن = 7). يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SD، وتدل ع <0.05 *، P <0.01 راشي **، وتدل ع <0.001 ***، وتقاس من قبل الطلاب اختبار t بالمقارنة مع الشرائح المغلفة مع PU134 تذوب رباعي هيدرو الفوران. أشرطة الخطأ تمثل 1 الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

آيس "> الشكل 2
الشكل 2. توصيف للhepatoblasts HESC مشتقة. كيمياء سيتولوجية مناعية تظهر علامات التعبير الكبدية لوكالة فرانس برس، CK19، HNF4α والزلال في HESC (H9) تستمد الأديم الباطن كبدي. أجريت المقابلة مع ضوابط السلبية المناعي G (مفتش) وتظهر الصور التمثيلية. وقدرت النسبة المئوية للخلايا إيجابية والانحراف المعياري من خمسة على الأقل من المجالات عشوائية نظر تحتوي على ما لا يقل عن 300 خلية لكل عرض. أخذت الصور في 20X التكبير. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SD خطأ تمثل القضبان 1 الانحراف المعياري. HNF4α، الكبدية العامل النووي 4α. وكالة فرانس برس، α-بروتين جنيني. ALB، الزلال. CK19، Cytokeratin 19، مفتش الماعز، المناعي G مكافحة الماعز، مفتش الماوس، المناعي G مكافحة فأر. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فيرسي على هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. الآثار الوظيفية للتضاريس سطح PU134 المغلفة على وظيفة خلايا الكبد HESC مشتقة. قياس النشاط السيتوكروم P450 3A على خلايا الكبد المشتقة HESC حافظت لمدة 96 ساعة على الشرائح الزجاجية المغلفة مع PU134 مذابة في مذيبات مختلفة. تحسن في النشاط السيتوكروم في الحفاظ على خلايا PU134 على الشرائح الزجاجية المغلفة تذوب مع رباعي هيدرو الفوران (ن = 6). يتم التعبير عن البيانات كما تدل يعني ± SD، P <0.05 *، P <0.01 راشي **، وتدل ع <0.001 ***، وتقاس من قبل الطلاب اختبار t بالمقارنة مع خلايا الكبد HESC المستمدة الحفاظ على الشرائح المغلفة مع PU134 تذوب في رباعي هيدرو الفوران. أشرطة الخطأ تمثل 1 الانحراف المعياري.

together.within الصفحات = "دائما"> الرقم 4
الرقم 4. تحسين تعقيم الأسطح المطلية. الصور النقيض المرحلة (A) أو الصور SEM (B) تظهر أي اختلافات صارخة في السطح المطلي PU134 بين γ الإشعاع أو الأشعة فوق البنفسجية (UV) العلاجات. واتخذت صورة النقيض من المرحلة في 40X التكبير وSEM الصور في 1،664X التكبير. (C) تحليل النشاط 3A السيتوكروم P450 على HESC خلايا الكبد المشتقة المحافظة لمدة 10 أيام على الشرائح الزجاجية PU134 المغلفة. زيادة في النشاط 3A السيتوكروم P450 في الخلايا replated على الشرائح الزجاجية PU134 المغلفة يشع γ بالمقارنة مع الخلايا replated على الأشعة فوق البنفسجية يشع الشرائح الزجاجية PU134 المغلفة. يتم التعبير عن وحدة من وحدات النشاط الخفيفة النسبية (RLU) مل -1 -2 سم من سطح الثقافة (ن = 3). يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SD، ع <0.001 طق تدل *** يقاس الطلاب اختبار t بالمقارنة مع خلايا الكبد HESC المستمدة الحفاظ على coverslips الزجاج المطلي PU134 تعقيمها بواسطة γ للإشعاع. أشرطة الخطأ تمثل 1 الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الأجسام المضادة الأولية
المستضد نوع شركة التخفيف
HNF4α الأرنب بولكلونل سانتا كروز 1/100
الزلال الماوس وحيدة النسيلة سيغما 1/500
AFP الماوس وحيدة النسيلة Abcam 1/500
Cytokeratin 19 الماوس وحيدة النسيلة داكو 1/50
مفتش الماوس وحيدة النسيلة داكو 1/500
الأجسام المضادة الثانوية
568 المضادة للأرنب اليكسا الدقيق الماعز إينفيتروجن 1/400
مكافحة الفأر اليكسا 488 الدقيق أرنب إينفيتروجن 1/500

الجدول 1. قائمة الأمثل الأجسام المضادة وتركيزات الابتدائية والثانوية المستخدمة في هذه الدراسة. HNF4α، الكبدية العامل النووي 4α. وكالة فرانس برس، α-بروتين جنيني. مفتش، المناعي G.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تعتمد العديد من الطرق الحالية المستخدمة لتوليد خلايا الكبد من الخلايا الجذعية على المصفوفات غير محددة من أصل حيواني. يمكن لهذه ركائز يكون مكلفا ومتغير بدرجة كبيرة، مما يؤثر على وظائف الخلايا والاستقرار، وهو ما يمثل عائقا كبيرا أمام التطبيق. لذا، أجرينا شاشة للمواد الاصطناعية التي تدعم ثقافة الخلايا الجذعية خلايا الكبد المشتقة. حددنا، والبولي يوريثين بسيط (PU134)، التي شكلتها البلمرة PHNGAD، MDI والموسع، وذلك في توليفة مع نهج التمايز الكبدية قوي، تستقر النمط الظاهري الكبدية ويحسن وظيفة الخلية بالمقارنة مع matrigel 15.

التعامل مع الخلايا الجذعية المصفوفات البيولوجية، التي يشيع استخدامها في زراعة القائمة والتفريق مثل vitronectin 22، 23 أو 521 laminin matrigel، وفعالة للصيانة على المدى القصير. في المقابل، توفر أسطح PU134 المغلفة الركيزة متفوقة لhepatocyثقافة الشركة المصرية للاتصالات. وعلاوة على ذلك، أدت تعظيم الاستفادة من تضاريس سطح والتعقيم البوليمر إلى مزيد من التحسينات في أداء الخلية، عاملا رئيسيا في تقديم نماذج الكبد الإنسان على نطاق واسع مع الأداء يمكن الاعتماد عليها.

طبيعة الموسع سلسلة وفينيل الإيزوسيانات تمثل واحدة من المراحل الحرجة من العملية؛ كما القضاء أو استبدال أي من المكونات شأنه أن يخل بشكل كبير من سطح البوليمر والتعلق بالتالي الخلوي والنشاط الوظيفي للخلايا الكبد من الخلايا الجذعية المشتقة. تكوين البوليمر يؤثر المعلمات المادية مثل مرونة وقابلية الابتلال 24، والذي يؤثر على قدرة البوليمر لامتصاص البروتينات المصفوفة خارج الخلية الرئيسية المشاركة في وظيفة الكبدية. بالإضافة إلى ذلك، الاختلافات في حافز، وقت رد الفعل ودرجة الحرارة تؤثر على توزيع الوزن الجزيئي للبوليمر.

اختيار المذيب للذوبان البوليمر إعادةيقدم نقطة حرجة أخرى في الحصول على البوليمر المغلفة سطح الأمثل. وقد لاحظنا أن طبيعة المذيب تؤثر تضاريس السطح المطلي، والتي لها آثار مباشرة في وظيفة الخلايا 25-31. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الوقت الغزل والسرعة هي أيضا حاسمة في الحصول على هذا الطلاء موحد ومتجانس. خطوة أخرى لتأخذ في الاعتبار هو إجراء التعقيم تطبيقها على سطح البوليمر المغلفة، ونشاط الخلايا يمكن أن تتأثر علاج التعقيم المستخدمة. قد يكون هذا يرجع إلى وجود منطقة حساسة (ق) في غضون هيكل البوليمر لإجراءات التعقيم المختلفة 32-34.

الخلايا الجذعية المحفزة نماذج خلية مقرها الحالية تمتلك المظهرية والقيود الوظيفية. ونحن نعتقد أن هذا البوليمر المغلفة سطح الأمثل يمثل تقدما في هذا المجال، التحايل على بعض القيود المرتبطة استخدام SUBST البيولوجيأسعار الفائدة. وعلاوة على ذلك، فإن إمكانية استخدام البوليمر داخل 3D المصفوفات لدعم مرفق من مختلف أنواع الخلايا الموجودة في الأنسجة من الاهتمام، قد تحسين الإخلاص الخلية.

في الختام، واستخدام المواد الاصطناعية أصبحت ذات أهمية متزايدة في تقديم سوما البشرية من الخلايا الجذعية المحفزة. قمنا بتطوير إجراء سطوح وتلبيس الأمثل هو أن يسلم قوية وموثوق خلايا الكبد البشرية وظيفية مع انعكاسات كبيرة على النمذجة القائمة على الخلايا والطب التجديدي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

DCH هو منظمات المجتمع المدني، مدير مؤسس ومساهم في FibromEd المنتجات المحدودة MB وJPI على المساهمين المؤسسين في FibromEd المنتجات المحدودة

Acknowledgments

ودعمت DCH، MB وFK قبل EPSRC اتبع على الصندوق. BL-V وDS تم دعم كل من MRC درجة الدكتوراة. وأيد KC بتمويل من منهاج الطب التجديدي المملكة المتحدة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
Shaker Edmun Bühler KS-15
Irradiator CIS Biointernational IBL 637 
Spin coater Specialty Coating System P-6708
Scanning Electron Microscope  Philips XL30CPSEM
Atomic Force Microscope DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4 Promega V8902
UV bulb ESCO
NanoScope analysis software VEECO version 1.20
Fluorescence microscope Olympus TH45200 Use Volocity 4 Software
Tissue culture plates Corning, UK  3527
glass slides Scientific Laboratory Supplies MIC3308
Diethylene glycol Sigma–Aldrich 93171
1,6-hexanediol Sigma–Aldrich 240117
Neopentyl glycol Sigma–Aldrich 408255
Adipic acid Sigma–Aldrich 9582
anhydrous N,N-Dimethylformamide Sigma–Aldrich 227056
Diethyl ether Sigma–Aldrich 676845
titanium (IV) butoxide  Sigma–Aldrich 244112
1,4-butanediol  Sigma–Aldrich 493732
Vacuum oven Thermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) Sigma–Aldrich 101688
Tetrahydrofurane Sigma–Aldrich 401757
Sputter coater Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) Gibco 10010031 Store at room temperature
PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20    Scientific Laboratory Supplies Ltd EC607 
Methanol   Scientific Laboratory Supplies Ltd CHE5010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich, UK A7906
MOWIOL 488 DAPI Calbiochem 475904 Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kit Promega V8902
Hepatozyme Gibco 17705021
TryLE express Life Technologies 12604013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, W., et al. SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function. J Cell Sci. 125, (15), 3630-3635 (2012).
  2. Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30, (27), 4695-4699 (2009).
  3. Shanbhag, M. S., et al. Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts. Biomacromolecules. 11, (11), 2936-2943 (2010).
  4. Battista, S., et al. The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation. Biomaterials. 26, (31), 6194-6207 (2005).
  5. Tian, W. M., et al. Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro. Journal of Controlled Release. 102, (1), 13-22 (2005).
  6. Keshaw, H., Forbes, A., Day, R. M. Release of angiogenic growth factors from cells encapsulated in alginate beads with bioactive glass. Biomaterials. 26, (19), 4171-4179 (2005).
  7. Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S., Farrokhi, A. Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 50, (7), 645-652 (2006).
  8. Cameron, K., Travers, P., Chander, C., Buckland, T., Campion, C., Noble, B. Directed osteogenic differentiation of human mesenchymal stem/precursor cells on silicate substituted calcium phosphate. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101, (1), 13-22 (2013).
  9. Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays. Biomedical Materials. 3, (3), 034112 (2008).
  10. Li, Z., Guo, X., Matsushita, S., Guan, J. Differentiation of cardiosphere-derived cells into a mature cardiac lineage using biodegradable poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. Biomaterials. 32, (12), 3220-3232 (2011).
  11. Tare, R. S., Khan, F., Tourniaire, G., Morgan, S. M., Bradley, M., Oreffo, R. O. C. A microarray approach to the identification of polyurethanes for the isolation of human skeletal progenitor cells and augmentation of skeletal cell growth. Biomaterials. 30, (6), 1045-1055 (2009).
  12. Khan, F., Tare, R. S., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C., Bradley, M. Strategies for cell manipulation and skeletal tissue engineering using high-throughput polymer blend formulation and microarray techniques. Biomaterials. 31, (8), 2216-2228 (2010).
  13. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nature Communications. 4, (1335), (2013).
  14. Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2, (7), 505-509 (2013).
  15. Hay, D. C., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Research. 6, (2), 92-102 (2011).
  16. Lucendo-Villarin, B., Khan, F., Pernagallo, S., Bradley, M., Iredale, J. P., Hay, D. C. Maintaining hepatic stem cell gene expression on biological and synthetic substrata. BioResearch Open Access. 1, (1), 50-53 (2012).
  17. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, (34), 12301-12306 (2008).
  18. Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell–Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology. Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).
  19. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Translational Medicine. 3, (2), 141-148 (2014).
  20. Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  21. Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Culture of organized cell communities. Advanced Drug Delivery Reviews. 33, (1-2), 15-30 (1998).
  22. Braam, S. R., et al. Recombinant Vitronectin Is a Functionally Defined Substrate That Supports Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal via αVβ5 Integrin. Stem Cells. 26, (9), 2257-2265 (2008).
  23. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, (3195), (2014).
  24. Thaburet, J. -F. O., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromolecular Rapid Communication. 25, (1), 336-370 (2003).
  25. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell Sensing and Response to Micro- and Nanostructured Surfaces Produced by Chemical and Topographic Patterning. Tissue Engineering. 13, (8), 1879-1891 (2007).
  26. Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116, (10), 1881-1892 (2003).
  27. Biggs, M. J. P., Richards, R. G., Wilkinson, C. D. W., Dalby, M. J. Focal adhesion interactions with topographical structures: a novel method for immuno-SEM labelling of focal adhesions in S-phase cells. Journal of Microscopy. 231, (1), 28-37 (2008).
  28. Karuri, N. W., Porri, T. J., Albrecht, R. M., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Nano- and microscale holes modulate cell-substrate adhesion, cytoskeletal organization, and -beta1 integrin localization in SV40 human corneal epithelial cells. IEEE Transactions on Nanobioscience. 5, (4), 273-280 (2006).
  29. Hamilton, D. W., Brunette, D. M. The effect of substratum topography on osteoblast adhesion mediated signal transduction and phosphorylation. Biomaterials. 28, (1), 1806-1819 (2007).
  30. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, (4), 677-689 (2006).
  31. Dang, J. M., Leong, K. W. Myogenic Induction of Aligned Mesenchymal Stem Cell Sheets by Culture on Thermally Responsive Electrospun Nanofibers. Advanced Materials. 19, (19), 2775-2779 (2007).
  32. Azevedo, E. C., Nascimento, E. M., Chierice, G. O. UV and gamma irradiation effects on surface properties of polyurethane derivate from castor oil. Polímeros. 23, (3), 305-311 (2013).
  33. Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A. Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169, (2), 177-185 (2005).
  34. Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests. Polymer Degradation and Stability. 77, (1), 103-109 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics