ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

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Zhang, P., Xia, N., Reijo Pera, R. A. Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (91), e51737, doi:10.3791/51737 (2014).

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Abstract

Introduction

ドーパミン作動性(DA)ニューロンは、中脳、視床下部、網膜、および嗅球を含むいくつかの脳領域、で見つけることができます。前脳における線条体に投影し、錐体外路運動系を形成することにより、黒質緻密部(SNpc)制御挙動および運動A9 DAニューロン。 A9 DAニューロンの変性は、第二の最も一般的なヒト神経変性疾患、現在不治であるパー​​キンソン病(PD)、につながる。細胞置換療法、PD 1の治療のための最も有望な戦略の一つであり、したがって、ヒト胚性幹細胞(hESC)との両方を含む、ヒト多能性幹細胞(hPSCs)からA9 DAニューロンを導出することに大きな関心があった最近のヒト人工多能性幹細胞(hiPSCs)。

多くの研究は、さまざまな方法を使用してhPSCsからA9 DAニューロンを導出しようとしている。すべての神経を介してDAニューロンを生成した最も初期の報告ロゼット前駆段階。外部成長の2-4週間、L.ステューダー要因や同僚に成功神経ロゼットを生成するためにヒトES細胞を誘導した3つの他のグループの有無にかかわらずMS5 2またはPA6 3-5間質細胞との共培養することにより。そして、彼らは機械的切開またはさらなる分化のために酵素消化することにより、これらのロゼットを豊かに。他のレポートでは、研究者は、培養、分化6-9フローティング (EB)胚様体を介して神経ロゼットを生成しました。その後、研究者は、彼らは細胞外マトリックス上でのhESCとhiPSCsメッキ単層ベースの微分法10,11を設置し、in vivoでの胚のDAニューロンの発生を模倣DAニューロンへhPSCsの分化を誘導する培養中の異なる成長因子を追加しました。すべてのこれらの研究は、DAニューロンのいくつかの特徴を有する発現細胞チロシンヒドロキシラーゼ(TH)が得られたが、全体の分化プロセスは、時間と労力がかかり、一般的には非効率的な、そしてより重要なことは、これらのニューロンのエンジンA9アイデンティティはLmx1aの異所性発現12と1を除いてほとんどの研究で実証されていませんでした。近年、新たなフロアプレート(FP)は、プロトコルベースのその後DAニューロン電位を有するFP前駆体が第一の分化の初期段階の間にソニックヘッジホッグおよびカノニカルWntシグナル伝達経路の活性化によって生成された、13-16を開発したこれらのFP細胞をさらにDAニューロンに指定されました。このプロトコルは、より効率的であるが、いくつかの問題が依然として存在する。例えば、全分化プロセスが(少なくとも35日)時間がかかり、15依存性フィーダー細胞であるか、またはEB を16依存性またはA9同一性は14を示していなかったである。

ここでは、in vivoでの胚のDAニューロンの発生やその他の研究者の発表された結果からの知識に基づいて、私たちはEFFのための培養条件を最適化したヒトES細胞とhiPSCs両方からDAニューロンのicient世代。まず、小分子CHIR99021および低分子SAGとプルモルファミンとシグナリングソニックヘッジホッグとカノニカルWntシグナルの活性化により、FP前駆細胞を生成した。これらのFP細胞はFOXA2、Lmx1aの、コリン、OTX2およびネスチンを発現する。次に、 などが BDNF、GDNF、を含む成長因子とDAニューロンにこれらのFPセルを指定しました。カルビンジン17に対して負間、彼らがGIRK2に対して陽性であるように生成されたDAニューロンは、A9細胞型である。このプロトコルは、独立した高効率で再現性のフィーダー細胞またはEBです。このプロトコルを使用すると、人は、またはインビトロ PDのモデル化またはPDのための潜在的治療薬をテストするためのPD患者のhiPSCsからヒトES細胞や細胞移植研究のための正常人のhiPSCsから約4週間でDAニューロンを導出することができる。

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Protocol

培養培地の調製

  1. 以下を組み合わせることにより、マウス胚線維芽細胞(MEF)培地の調製:445ミリリットルDMEM 50mlのウシ胎児血清(FBS)、および5mlの100×ペニシリン/アンピシリンストック溶液。せいぜい14日間4℃で濾過滅菌メディアを保管してください。
  2. 以下を組み合わせることにより血清含有HPSC培地を調製する:385ミリリットルDMEM / F12 100mlのノックアウト血清代替物(KSR)を5ml 100×非必須アミノ酸ストック溶液を5ml 100×ペニシリン/アンピシリンストック溶液5mlの100倍ストック溶液をメルカプトエタノール、および10ng / mlのbFGF。せいぜい10日間4℃で濾過滅菌メディアを保管してください。
  3. 400ミリリットルmTeSR1基礎培地、100ミリリットル5倍サプリメント、および5ml 100×ペニシリン/アンピシリンストック溶液:次のように組み合わせることにより、mTeSR1無血清培地を準備します。せいぜい10日間4℃での媒体に保管してください。
  4. 10倍のコラゲナーゼIVストック溶液を準備します。0.5グラムコラゲナーゼIVパワーを秤量し、滅菌50ミリリットルDMEM / F12、フィルターでそれを溶かす。アリコートを作成し、数ヶ月のために-20℃でそれらをストック。
  5. 0.1%ゼラチン溶液を調製:(牛の皮膚から、タイプB)0.5gのゼラチン電力を計量し、脱イオン水で溶解する。週間室温でオートクレーブ滅菌溶液を保管してください。
  6. 下記を組み合わせてKSRの分化培地を調製する:410ミリリットルDMEM、75ミリリットルKSRを、5mlのストック溶液をメルカプトエタノール100X非必須アミノ酸ストック溶液を5ml 100×ペニシリン/アンピシリンストック溶液を5mlの100倍。せいぜい10日間4℃で濾過滅菌メディアを保管してください。
    注:KSRは分化効率に影響を与える可能性がロット、によって異なります。それは差別化のための最高のものを見つけるために、KSRの数バッチをテストすることをお勧めします。
  7. 次のように組み合わせることにより、N2分化培地を準備します。98ミリリットルのDMEM、1ミリリットル100×N2サプリメント、1mlの100Xペニシリン/アンピシリンストック溶液。 4で濾過滅菌培地にしてく​​ださいせいぜい10日間°C。
  8. 10ミリリットル50倍B27サプリメント、5ミリリットルの原液をグルタマックス100X、および5ml 100×ペニシリン/アンピシリンストック溶液、480ミリリットル神経基礎培地:次のように組み合わせることにより、B27分化培地を準備します。せいぜい10日間4℃で濾過滅菌メディアを保管してください。

MEFフィーダー細胞上でのhESCとhiPSCs 2。文化

たH9 hESCをWiCell研究所から入手し、hiPSCsは山中のレトロウイルス媒介形質導入を通じてReijoペラ研究室で確立されたOCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYC 18因子

  1. 少なくとも1日細胞継代の前に、6ウェルプレートの1ウェル1 mlの0.1%ゼラチンを添加することによって、いくつかのゼラチン板を準備し、少なくとも30分間37℃でプレートをインキュベートする。
  2. インキュベーション後、プレートから吸引ゼラチン、および種子照射後1.6×10 5細胞の密度でプレートにMEF細胞を不活性化/ウェルMEF培地中の細胞をカウントする血球計数器を用いて。
    注:必要に応じて細胞継代の前に、早くも3日間としてMEFフィーダーを用意。
  3. 継代細胞MEFフィーダープレーティングの翌日:hPSCsから吸引媒体は、1ミリリットル/ウェルの細胞に1 mg / mlのコラゲナーゼIVを追加し、1時間、37℃で細胞をインキュベートする。
  4. このインキュベーションの間、PBSで一回MEFフィーダーを洗い、その後、十分に1.5ミリリットル/の温水(37℃)血清含有HPSC培地を追加します。
  5. 分化したコロニーが付着したままで未分化コロニーのほとんどは、プレートから離脱するように、1時間後、培養プレートを数回タップします。慎重に浮遊コロニーを収集し、15mlチューブにそれらを転送します。
  6. 優しく温かい(37℃)DMEM / F12で一回プレートを洗浄し、同じ15ミリリットルチューブにDMEM / F12キーを転送します。
  7. 3分間179×gでチューブを遠心。
  8. 管から培地を吸引し、ペレットを乱さないように注意しながら。戦争を追加M HPSC培地、ピペットで上下のセルを数回小さなクラスターにそれらを破壊し、それらをよく混合する。
  9. 1から新しいMEFフィーダー上に細胞を移す:3-1:6比率を。
  10. すべての5-6日間、毎日通路の細胞を培地に変更します。

分化のための細胞の調製

  1. 細胞の調製の前に少なくとも一日には、いくつかのマトリゲルプレート(6ウェルプレートの一般的に3つのウェル)を準備します。 1時40分の冷(4℃)DMEM / F12でマトリゲルを希釈し、6ウェルプレートのウェルあたり1mlマトリゲルを加える。 4℃で一晩マトリゲル培養する。注:一つは、限り、一週間などのためにパラフィルムでマトリプレートを密封し、4℃でそれらをストックすることができます。
  2. 4日経過した後に細胞(手順2を参照)を使用します。プレートからのすべてに分化コロニーを削除します。培養プレートから培地を吸引し、十分に混合ACCUTASEにつき1を追加し、5分間、37℃で細胞をインキュベートする。
  3. インキュベーションの間、いくつかのゲルを調製6ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットルのゼラチンを加えることによりプレートATIN。これらのプレートを配置し、マトリゲルプレートをインキュベーター中で一日の前に用意しました。
  4. 5分間のインキュベーション後、またはとき細胞は単一の細胞にそれらを作るために数回上下半浮動、ピペット細胞となっている。
  5. 15ミリリットルチューブに単一細胞を収集し、3分間258×gで遠心する。
  6. HPSC培養培地を含む血清を適当量の細胞を再懸濁し、および2μMの最終濃度までThiazovivinを追加する。
  7. トランスファ1でゼラチン被覆プレート上に細胞:1の比、及びMEFフィーダーを除去し、37℃で30分間細胞をインキュベートする。
  8. 15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移し、HPSC媒体を含む適切な血清を追加し、血球計数器で細胞を数える。
  9. 3分間258×gで細胞を遠心。
  10. 遠心分離機中、210μMの濃度を作るためにmTeSR1媒体を適切なThiazovivinを追加します。
  11. 遠心分離機、Aの後メディアをspirate及び/ mlの培地1.8×10 5個の細胞が存在するようにThiazovivinで適切なmTeSR1媒体を追加します。
  12. 、インキュベーターからマトリプレートを取り出しマトリゲルを吸引し、6ウェルプレートの1ウェルに混合セルの2ミリリットルを追加します。
    注:細胞密度は、表面積の3.6×10 4細胞/ cm 2であるべきである。
  13. バックインキュベーターにプレートを戻し、細胞を24時間、アタッチしましょう​​。
  14. 24時間細胞をプレーティングした後、古い培地を吸引し、ウェル当たり2ミリリットル新しいmTeSR1培地を追加し、分化を開始する前に、細胞はさらに24時間成長させ。

細胞分化

  1. マトリプレートに細胞を再播種した後に、分化の48時間を起動します。
  2. プレートから吸引し培地は、PBSで細胞を1回洗浄し、ウェル当たり、以下の分化培地2mlを追加します。10μMのSB431542および100nM LDN-193を補充したKSR分化培地分化のD0として189をマーク、この日。
  3. D0からD20まで毎日培地に変更します。
    注:一つは、当時の2日間を超えない使用のための培地を調製することができます。
  4. 10μMのSB431542、100 nMのLDN-193189、0.25μMのSAG、2100μMのプルモルファミン、および50ng / mlのFGF8bを補充したKSR分化培地:D1とD2のために以下の培地を使用してください。
  5. 10μMのSB431542、100 nMのLDN-193189、0.25μMのSAG、2100μMのプルモルファミン、50ng / mlのFGF8b、および3μMのCHIR99021を補充したKSR分化培地:D3とD4のための以下の培地を使用してください。
  6. 100 nMのLDN-193189、0.25μMのSAG、2100μMのプルモルファミン、50ng / mlのFGF8b、および3μMCHIR99021を補った75%のKSR分化培地プラス25%、N2分化培地:D5及びD6のために以下の培地を使用してください。
  7. 100 nMのLDN-193189および3μMCHIR99021を補った50%KSR分化培地プラス50%、N2分化培地:D7とD8のために以下の培地を使用してください。
  8. D9とD10のための以下の培地を使用してください:25%KSR分化培地+ 100 nMのLDN-193189および3μMCHIR99021を補った75%のN2分化培地。
  9. 3μMのCHIR99021、10ng / mlのBDNF、10ng / mlのGDNF、1 / mlのTGF3、0.2 mMのアスコルビン酸及び0.1mMのcAMPを補足したB27分化培地:D11とD12のために以下の培地を使用してください。
  10. 10ng / mlのBDNF、10ng / mlのGDNF、1 / mlのTGF3、0.2 mMのアスコルビン酸及び0.1mMのcAMPを補足したB27の分化培地:分化の残りのために以下の培地を使用してください。
  11. 分化の約D16には、いくつかのポリ-L-オルニチン/ラミニン/フィブロネクチンプレートを準備します。希は15μg/ mlの冷(4℃)PBSでポリ-L-オルニチン原液を、6ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットルを追加し、37℃で一晩プレートをインキュベートする。
  12. 、ポリ-L-オルニチンソリューションを吸引滅菌水でプレートを3回洗浄した後、空気のプレートを乾燥。
  13. ラミニンストックゾルを希釈1μg/ mlの冷(4℃)PBSでutionは、6ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットルを追加し、37℃で一晩プレートをインキュベートする。
  14. 、ラミニン液を吸引滅菌水で3回プレートを洗浄した後、空気のプレートを乾燥。
  15. 、2 / mlの冷(4℃)PBSでフィブロネクチン原液を希釈し、6ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットルを追加し、37℃で一晩培養する。
  16. パラフィルムでシールプレート限り2週間、4℃で配置します。
  17. 分化の20日後、ポリ-L-オルニチン/ラミニン/フィブロネクチンプレートに細胞をreplate。吸引し分化培地は、6ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットル温かい(37℃)ACCUTASEを追加し、5分間37℃で細胞をインキュベートする。
  18. インキュベーションの間、インキュベーター内で、ポリ-L-オルニチン/ラミニン/フィブロネクチンプレートを配置。
  19. 5分間のインキュベーションの後、または細胞がなったときに、上下に数回静かにピペット細胞をセミフローティング単一細胞にそれらを作る。
  20. 15ミリリットルコニカルチューブに単一細胞を収集し、拡張に依存して変化する細胞計数のための神経基礎培地の適切な量を追加、(分化の11日後、細胞が15〜20倍に拡大する場合があります)。血球計数器を用いて細胞を数える。
  21. 3分間258×gで細胞を遠心。 B27分化培地で上清を吸引除去し、再懸濁細胞を細胞濃度/ mlの培地中1×10 6細胞となるように。
  22. 吸引プレートからのフィブロネクチン、PBSで2回洗浄し、6ウェルプレートの1ウェルに2ミリリットルの細胞を加える。
    注:再プレーティングのための細胞密度は、表面積の2×10 5細胞/ cm 2であるべきである。
  23. いずれかのアタッチされていない死細胞を除去するために24時間後に培地に変更します。
  24. 所定の実験のための所望の時点まで、一日おきに培地を交換。

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Representative Results

分化プロトコルの概要を図1に示されている。ここに提示分化プロトコルの効率は、出発細胞の状態に依存する。このため、第1の分化のために単一細胞にhPSCsを解離する前にすべての差別化コロニーを除去し、そして第二に、一つはゼラチンでコーティングしたプレート上で細胞を培養することによって、ほとんどの、すべてではない、MEFフィーダー細胞を減少させる、ことを確認するために重要なことです30分、第三のために、マトリゲルプレート上に適切な密度で1枚HPSC単一細胞。 図2に示すように、HPSC単一細胞をプレートで約70%の集密度を形成、分化の前に48時間の間、クラスタとして展開されます再プレート。そして、分化後、これらの細胞は、3〜4日間限り短くフル合流点に到達し、D16-D17あたりから始めて、これらのコンフルエントの細胞は、プレートの一部のスペースを作るために開始し、いくつかの軸索/神経突起が既にできたこれらの空間および細胞層の下で観察される。 D20で再プレートした後、分化した細胞が付着し、小さな塊として成長した。その後、次の5日間、ずっと集中的、形態学的に無傷の軸索/神経突起が塊から出て来て、別の塊から軸索/神経突起は、いくつかの接続を形成する。長期培養中、1塊のニューロンは、より多くの拡張機能を生成する、より成熟した取得し、近隣の塊のニューロンとの複数の接続を持っている。

分化の11日後、hPSCsを効率的にFP前駆体に変換することができ、 図3に示すように、ほとんど全ての細胞は、FP前駆細胞マーカー、ネスチン及びFOXA2を発現し、細胞の90%以上が他の3つのマーカーコリン、OTX2を発現、そしてLmx1aの。彼らはTUJ1とTH( 図4A)を発現するように次に分化のより多くの日の後、FP前駆細胞は、DAニューロンに指定されている。彼らはEXPRESこれらのDAニューロンは、A9のアイデンティティであるS GIRK2の間には、カルビンジン( 図4B)に対して陰性である。免疫染色実験はまた、分化がもっぱらのDAニューロン系列に向かって指定されていることを示す、全くGFAP +アストロサイトと非常に少数のGABA作動性ニューロン( 図4C)がないことを示している。

図1
日ごとに使用される成長因子/低分子および培地で分化プロトコルの概要を図1、。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2形態学らに記載されるようにしたH9 hESCは、適切な細胞密度で単一細胞として播種した。分化中に変化し、その48時間後に、これらの細胞はコロニー(D0)としてプレートに約70%コンフルエンスに達する。分化の最初の数日の間、細胞は、分化(D1)の24時間後に90%のコンフルエンスに達し、急速に展開して、48以上の時(D3)の後にコンフルエンスになる。しかしながら、これらの細胞の大部分は依然として細胞質比(D3)高い核を有する典型的なhESCの形態を示す。分化が進むにつれて、細胞はより多くの内容を拡張し、徐々hESCの形態を失う。分化のD11の終わりに、複数の細胞層は、他の(D11)よりもいくつかの領域における細胞の暗い色によって証明されるように、プレートの多くの部分である。 D20にD17約から始まって、いくつかの細胞をプレートにいくつかのスペースを残して死亡し、いくつかのニューロン突起はすでにこれらのスペースに観察することができたND時には細胞層(D20)の下で。細胞が成長するためのより多くのスペースを作るためにD20の最後に再プレート細胞や分化後、細胞などの小さなクラスターを集約、より多くの軸索/神経突起は、これらのクラスタから出て、別のクラスタからの軸索/神経突起は、できるだけ短いいくつかの接続を形成4-5日(D25)。スケールバー、200μmである。

図3
分化の初期段階でのFPマーカーについての図3の免疫染色。たH9 hESCには、ここに記載したプロトコルを使用して11日間分化させた。次いで、細胞をロバ血清でブロックトリトンX-100で透過処理し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、次いでFP前駆細胞マーカーについて染色した。ここに示されているように、ほとんどすべての細胞がFOXA2およびネスチンを発現し、細胞の90%以上がLmx1aの、コリンを発現し、FP細胞へのhESCから非常に高効率の変換を示すOTX2、。スケールバー、200μmである。

図4
分化の後期段階でのDAニューロンマーカーの図4の免疫染色(A)のH9ヒトES細胞を25日間分化、細胞を汎神経マーカーTUJ1と一般的に使用されるDAニューロンマーカーTHの免疫染色に供した。 TH陽性細胞よりもTUJ1陽性細胞が存在するが、ここで示されるように、すべてのTH発現細胞は、TUJ1発現細胞内の残基、およびTH発現細胞は、全てのセルの少なくとも半分を表す。 (B)。たH9ヒトES細胞は、さらに、細胞が免疫染色に供した後、さらに25日間(合計50日間)と分化させた。結果は、TH発現細胞番目の高いパーセンテージがあることを示したそれはD25で。それらのほとんどがPDで失われた細胞型で生成されたDAニューロンのA9サブタイプの同一性を示す、カルビンジンについて陰性であるが、ほとんどすべてのこれらのTH発現細胞はまた、GIRK2を発現する。分化のD25で細胞の免疫染色(C)が存在するGFAPを発現しない細胞ではなく、非常に少数の細胞がGABAを発現することを示した。スケールバー、200μmである。

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Discussion

(ヒトES細胞とhiPSCsの両方を含む)ヒト多能性幹細胞は、大部分を生成するためにインビトロで分化することができないすべての場合、以前の研究19で実証されているDAニューロンを含む私たちの身体の細胞型。ここでは、胚性ドーパミン作動性ニューロンの発生20からの知識や他の研究室14,15から公開されたプロトコルに基づいて、私たちはヒトES細胞とhiPSCsからDAニューロンの生成のための培養条件を最適化した。このプロトコルは、効率的で再現性があり、私たちは、H1およびH9 hESCのラインにし、PD患者と非罹患対照の両方からhiPSCラインにここで説明する、このプロトコルを正常に適用されている。

私たちのプロトコルでは、高分化効率を得るには、3つの重要なステップがあります:まず、監督分化前の細胞には分化さHPSCコロニーがあってはならない。 3つの胚葉全てに自発的な分化は、多くの場合、時間に見られるようにPSC培養物は、それが単一の細胞にこれらのhPSCsを解離する前に、これらの分化したコロニーを除去することが重要である。以前の報告は、MEF細胞が秘密の要因自己再生を促進し、分化21を阻害することができるということが示されているように第二に、MEFフィーダーは、解離hPSCsから枯渇されるべきである。この目的のために、30分間、ゼラチンコートプレート上HPSCとMEF細胞混合物をインキュベートすると、ほとんどすべてのMEF細胞を除去するのに十分であるべきである。第三に、単一のhPSCsは、分化のための適切な細胞密度でプレーする必要があります。上のセルが、7日未満だけ短く、プレートの中央に剥離および細胞の死をもたらす細胞密度を低下させながら細胞密度は、分化の周りのD11で、ほとんどの細胞の死につながる増やすエッジが十分に分化する(データは示さず)。一つは、すべてのこれらの3つの基準を観測する場合、それは効率的に私達の段階的なプロトコルでhPSCsからDAニューロンを得ることが容易である。

ここで紹介するプロトコルは、主にいくつかの変更を加えてL.ステューダーと同僚14による以前の報告に基づいています。細胞はわずか約70%コンフルエンスに達したとき、細胞が完全な合流点(単セルは、めっき後の培養の3日以上)に達したときに、それらの報告書に、分化を開始した間にまず、ここでは分化は、単一の細胞プレーティングの48時間後に開始されました。 20日目には分化プロセスの間に深刻な細胞死に至るまでの経験では、細胞継代なしコンフルエント細胞から分化を開始する。第二に、SAG、HH経路22 chlorobenzothiophene含有小分子アゴニストとの研究では、高価なShhタンパク質を交換してください。そのため、以前に公表されたプロトコルと比較して、これはここで説明する独立したフィーダー細胞と神経ロゼットであり、主にFP仕様の小分子に基づく。それは、このように安価でより少ない時間と労力がかかる。もちろん、リチウムこのプロトコルのmitationは、分化の最初の日のためにKSRの使用である。 KSRは、分化効率に影響を与える可能性がある、ロット間で変動する。したがって、1は、分化の11日後に、FP前駆体を誘導する最適なものを得るために、KSRの異なるバッチをテストする必要があります。

要約すると、ここにdescried分化プロトコルは促進すべきである:ヒトES細胞またはPDのための細胞置換療法のための正常人のhiPSCsからDAニューロンの(1)の生成; (2)in vitroでのモデリングと、PDのための潜在的な治療薬をテストするためのPD患者iPS細胞からのDAニューロンの生成; (3)遺伝子の研究/ヒトのDAニューロンの発生を制御するシグナル伝達経路。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 10569-010
FBS Life Technologies 26140
penicillin/ampicillin Life Technologies 15140-122
DMEM/F12 Life Technologies 10565-018
KSR Life Technologies 10828-028
Non-essential amino acid Life Technologies 11140-050
b-mercaptoethanol Millipore ES-007-E
bFGF R&D Systems 233-FB-025
mTesR1 STEMCELL Technologies 5850
Collagenase IV Life Technologies 17104-019
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
N2 supplement Life Technologies 17502-048
B27 supplement Life Technologies 17504-044
Neurobasal Life Technologies 21103-049
Glutamax Life Technologies 35050-061
PBS Life Technologies 10010-023
Growth factor reduced matrigel BD Biosciences 354230
Accutase MP Biomedicals 1000449
Thiazovivin Santa Cruz Biotechnology sc-361380
SB431542 Tocris Bioscience 1614
LDN-193189 Stemgent 04-0074
SAG EMD Millipore 566660-1MG
Purmorphamine Santa Cruz Biotechnology sc-202785
FGF8b R&D Systems 423-F8-025
CHIR99021 Cellagen Technology C2447-2s
BDNF R&D Systems 248-BD-025
GDNF R&D Systems 212-GD-010
TGF-beta3 R&D Systems 243-B3-002
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4034
cAMP Sigma-Aldrich D0627
Mouse anti human NESTIN antibody Santa Cruz Biotechnology sc-23927 1/1,000 dilution
Rabbit anti human OTX2 antibody Millipore AB9566 1/2,000 dilutiion
Goat anti human FOXA2 antibody R&D Systems AF2400 1/200 dilution
rabbit anti human LMX1a antibody Millipore AB10533 1/1,000 dilution
Rabbit anti human TH antibody Pel Freez P40101 1/500 dilution
Chicken anti human TH antibody Millipore AB9702 1/500 dilution
Mouse anti human TUJ1 antibody Covance MMS-435P 1/,2000 dilution
Rabbit anti human GIRK2 antibody Abcam ab30738 1/300 dilution
Rabbit anti human Calbindin antibody Abcam ab25085 1/400 dilution
Centrifuge Eppendorf 5804

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References

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