Capsulaire sérotypage

Immunology and Infection
 

Summary

Test d'agglutination au latex est une méthode simple, rapide et peu coûteuse pour le sérotypage Streptococcus pneumoniae, et a été largement appliqué en microbiologie de diagnostic. Ce manuscrit décrit la production en interne de réactifs d'agglutination au latex, les procédures de contrôle de la qualité et de l'application de cette technique à sérotypage pneumocoque.

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Porter, B. D., Ortika, B. D., Satzke, C. Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination. J. Vis. Exp. (91), e51747, doi:10.3791/51747 (2014).

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Abstract

Introduction

Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) est une cause majeure de morbidité et de mortalité chez les enfants de moins de cinq ans, en particulier dans les milieux pauvres en ressources de 1,2 à l'échelle mondiale. Plages de la maladie à pneumocoques à des infections localisées à la vie en danger des conditions telles que la pneumonie, la septicémie et la méningite 1,2.

Plus de 90 sérotypes de pneumocoques ont été identifiés sur la base de différences dans leur polysaccharide capsulaire 3. Les vaccins actuels ciblent le polysaccharide capsulaire et offrent une protection contre les principaux sérotypes responsables de la maladie invasive 4. Le sérotypage des isolats de pneumocoques est importante pour évaluer l'impact de la vaccination sur le transport et la maladie ainsi que de fournir des données épidémiologiques plus large de 5,6. La méthode actuelle de «gold standard» pour le sérotypage pneumocoque est le test Quellung, mais cela prend du temps et exige une certaine habileté à perform 7. Agglutination au latex est une méthode de sérotypage solution recommandée par l'Organisation mondiale de la santé 7. Agglutination au latex est rapide et simple à réaliser, et est utilisé dans de nombreux laboratoires dans le monde entier 8-11. Surtout, l'agglutination au latex a montré une précision comparable à l'épreuve Quellung pour le sérotypage pneumocoque 10,12-14. Dans l'ensemble, cette méthode est idéale pour les paramètres de pauvres en ressources ainsi que des laboratoires à haut débit.

Des réactifs d'agglutination au latex («Réactifs» de latex) sont créés par la fixation d'anticorps à des particules de latex 15. Dans une réaction positive, les particules marquées s'agglutinent en présence de l'antigène spécifique. Réactifs au latex commerciaux sont disponibles pour une gamme restreinte de sérotypes. des réactifs de latex peuvent également être préparés en interne à l'aide d'antisérums 10 disponibles dans le commerce. Mélanges d'antisérums («pools») ainsi que des sérums spécifiques à s pneumocoqueerogroups (par exemple, un groupe 19), les sérotypes différents (par exemple, serotype 5), et à des antigènes spécifiques (les "facteurs", par exemple., 19c facteur reconnaissant de sérotype 19A) destiné à définir en outre les sérotypes à l'intérieur de groupes sont disponibles 16.

Ce manuscrit présente les principales étapes de la production de réactifs au latex à l'aide de la fixation passive de disponible dans le commerce sérums anti-particules de latex. Les aspects de contrôle de qualité (QC) de cette méthode sont décrits, et un protocole pour l'utilisation de réactifs de latex pour le sérotypage pneumocoque est inclus.

Protocol

1 Préparation des réactifs internes latex

  1. Préparation de la glycine solution saline tamponnée (GBS)
    1. Ajouter 1,5 g de glycine, 11,7 g de chlorure de sodium et 100 ml d'eau distillée à un bêcher de 200 ml en verre.
    2. Mélanger jusqu'à dissolution à l'aide d'un agitateur magnétique.
    3. Transférer le mélange à une éprouvette de 500 ml et ajouter de l'eau distillée pour faire un total de 200 ml.
    4. Transférer la solution à la bêcher de 200 ml, vérifier le pH et ajuster à 8,2 avec de l'hydroxyde de sodium 5 M. NOTE: L'hydroxyde de sodium est corrosif, porter un équipement de protection personnelle.
    5. Stériliser par filtration la solution en utilisant des filtres de 0,22 um et plusieurs seringues de 60 ml dans un ml preautoclaved vis bouteille à capsule en verre de 250.
    6. Stocker à température ambiante.
  2. Préparation de GBS avec 0,2% d'albumine de sérum bovin
    1. Ajouter 0,2 g d'albumine de sérum bovin (BSA) en poudre et 100 ml de GBS à un bêcher de 200 ml en verre pour dissoudre et mélanger avec un agitateur magnétique.
    2. Filtrestériliser la solution de 0,22 uM filtres en utilisant plusieurs 60 ml seringues dans un ml preautoclaved vis bouteille en verre plafonné à 250.
    3. Conserver à 4 ° C.
  3. la préparation du réactif au latex
    1. Étiqueter de 2 ml rondes tube de centrifugeuse bas.
      REMARQUE: tubes ronds de fond sont utilisés pour réduire la sédimentation des particules qui peuvent affecter la fixation anticorps.
    2. Avec une pipette P1000 avec des pointes stériles, ajouter 975 ul de l'ABG dans le tube de centrifugeuse, puis ajouter 25 ul de sérum antipneumococcique approprié pour le réactif de latex en cours de préparation (c.-à-piscine, groupe, type ou facteur). Inversez cinq fois pour mélanger.
    3. Diluer les particules de latex de polystyrène 01:10 en ajoutant 120 ul de particules de latex à 1080 ul de solution saline physiologique stérile.
      NOTE: Ceci peut être effectué en de plus grands volumes, mais il convient de frais chaque fois que les réactifs sont produits en latex.
    4. Ajouter 1000 pi de la suspension de latex 01:10 (préparé à l'étape 1.3.3) à l'une,000 pl 1:40 antisérum suspension (préparé à l'étape 1.3.2). Inversez cinq fois pour mélanger.
    5. Incuber à 37 ° C sur une roue en rotation lente (par exemple, quatre tours par minute pour une roue de 38,5 cm de diamètre) pendant 2 heures.
    6. Centrifugeuse pendant 15 min à 1100 x g. Jeter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot dans 2 ml de solution saline stérile.
    7. Centrifugeuse pendant 15 min à 1100 x g. Jeter le surnageant et ajouter 1 ml de GBS et remettre délicatement le culot.
    8. Introduire à la pipette la suspension de latex dans un étiquetés 5 ml Visser tube bouché. Ajouter un autre 1 ml de GBS.
    9. Ajouter 2 ml de GBS contenant 0,2% de BSA (p / v) (pH 8,2) (préparé à l'étape 1.2). Ajouter 40 ul de 10% (p / v) de solution d'azide de sodium comme conservateur.
      NOTE: L'azoture de sodium est dangereux en cas d'inhalation, et est un irritant pour la peau et les yeux. Il est souhaitable d'acheter une solution préparée de 10% plutôt que de la forme de poudre, de façon à diminuer le risque d'exposition par inhalation. Équipement de protection individuelle (y compris les gants unelunettes anti-éclaboussures d) doivent être portés lors de la manipulation de ce réactif. Reportez-vous à la fiche de données de sécurité pour plus de détails.
    10. Réactifs magasin de latex à 4 ° C.
  4. Préparation du contrôle négatif réactif latex
    1. Étiqueter de 2 ml rondes tube de centrifugeuse bas.
      REMARQUE: tubes ronds de fond sont utilisés pour réduire la sédimentation des particules qui peuvent affecter la fixation anticorps.
    2. Avec une pipette P1000 avec des pointes stériles, ajouter 975 ul de l'ABG dans le tube de centrifugeuse, puis ajouter 25 ul d'antisérum de lapin normal. Inversez cinq fois pour mélanger.
    3. Procédez comme dans les étapes 1.3.3 à 1.3.10 ci-dessus

2. contrôle qualité (CQ) de latex réactifs

  1. Amener réactif latex à la température ambiante. Immédiatement avant l'utilisation, mélanger doucement le réactif au latex en retournant le tube plusieurs fois.
  2. Vérifiez réactif pour autoagglutination par pipetage 15 pi sur une lame de microscope en verre et procéder comme dans les étapes 4.7 et 4.8 ci-dessous. Il ne devrait pas être ungglutination des particules de latex. Le réactif doit apparaître blanche et lisse.
  3. Testez le réactif contre un panneau de faible passage isolats de pneumocoques. Utilisez cultures fraîchement cultivés préparés comme à l'étape 3 Le panneau d'isolats devrait inclure des isolats du sérotype «cible» (le sérotype spécifique du réactif testé) et sérotypes «non-cibles» (les isolats d'autres sérotypes qui ne devrait pas normalement franchir réagir avec le réactif). Inclure au moins un isolat de chaque cible et non-cible sérotype pour chaque réactif de latex en cours de QC. S'il n'y a qu'une seule cible ou non cible sérotype, l'essai de deux isolats différents du sérotype particulier.
    REMARQUE: Le panneau de test doit comporter plusieurs isolats de chaque sérotype, dont certaines sont rares dans les maladies invasives et / ou des collections de cultures de type. Il est préférable d'inclure des isolats de transport, comme ils sont souvent plus exigeants pour le sérotype (données non présentées), ce qui en outre la capacité de tester of réactifs et veiller à ce que les réactifs sont susceptibles capable de sérotypage fois envahissante et transport isolats.
  4. Procéder à des tests de réactifs de latex avec la cible et non-cible pneumocoque isolats selon la méthode décrite dans les étapes 3 et 4 ci-dessous.
  5. réactifs de contrôle de la qualité au moment de la production, puis au moins annuellement par la suite.
    REMARQUE: Si un réactif ne passe pas QC, le lot doit être rejetée et une nouvelle préparation faite. En cas de répétition de l'échec QC, nous vous recommandons les réactifs être produites en utilisant les autres méthodes décrites dans Ortika et al., 2013 8 et dans la discussion ci-dessous.

3 Préparation de cultures à pneumocoques pour sérotypage

  1. En utilisant une boucle stérile sélectionner une seule colonie du pneumocoque et isoler cette strie entrée sur une gélose au sang non sélective solide de sorte que l'inoculum primaire couvre environ un tiers de la surface de la plaque. Série de colonies isolées.
    NOTE: Les plaques préparées à partir de cheval défibriné ou de sang de mouton sont adaptés; mais des plaques de sang préparés avec du sang humain ou de sang citraté sont pas.
  2. Incuber plaque O / N à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO 2.
  3. Observer la croissance sur la plaque de pureté et d'évaluer qu'il ya une croissance suffisante pour sérotypage.
    REMARQUE: Une culture pure de l'isolat pneumocoque est nécessaire pour le sérotypage. Dans notre expérience, confluentes, ou près de la confluence de croissance qui représentent environ un tiers de la surface de la plaque est généralement suffisante pour achever le sérotypage. Comme les cultures de pneumocoques peuvent être sujettes à une autolyse, cultures préparées pour le sérotypage doivent être testés dans les 24 heures de la sous-culture. Ne prenez pas la plaque de culture de l'incubateur plus de 15 à 20 minutes avant le sérotypage commence.

4 Effectuer sérotypage d'agglutination au latex

  1. Retirez tous les réactifs au latex du réfrigérateur et leur permettre de se réchauffer à température ambiante pendant environron 30 min. Immédiatement avant utilisation, retourner doucement les tubes de mélanger les réactifs.
  2. Étiqueter une lame de microscope.
  3. Placez 15 pi de réactif de contrôle négatif de latex sur la lame de microscope.
  4. Utilisation d'une boucle jetable stérile de 1 ul de prendre un balayage de la culture pneumococcique sorte que la boucle est approximativement à moitié plein.
  5. Étaler doucement l'inoculum sur la surface de la lame à proximité de la goutte de réactif de contrôle négatif de latex. L'inoculum doit être visible sur la lame de verre.
  6. Rapidement et bien mélanger l'inoculum dans le réactif contrôle de latex négatif en utilisant la boucle. Assurez-vous que la baisse ne se propage pas plus loin que sa taille initiale.
  7. Ramassez la diapositive, tenant par les deux extrémités. Basculer la lame d'avant en arrière pendant 1 min. Prenez soin de garder le liquide se déplaçant lentement, et veiller à ce que la taille de la goutte n'augmente pas.
    REMARQUE: Vous pouvez également utiliser une bascule de la plaque.
  8. Observer l'agglutination macroscopique (c'est à dire, parœil nu) et de la compensation de la suspension sur un fond noir.
  9. Si le réactif de contrôle négatif de latex montre pas d'agglutination ou de compensation continuent de tester la culture, le remplacement des réactifs essai de latex pour le contrôle négatif réactif latex dans les étapes 4.1 à 4.8 ci-dessus. Une boucle fraîche doit être utilisée à chaque fois. Procéder à l'essai des réactifs au latex à partir avec les piscines.
  10. Testez chacun des «pool» des réactifs de latex dans la succession jusqu'à ce qu'un test positif est obtenu.
    REMARQUE:. L'ordre des tests des piscines peuvent être effectuées dans des «tours» pour tenir compte de l'incidence locale des sérotypes particuliers (par exemple, en testant les trois piscines les plus probables à la première diapositive Si une réaction positive n'est pas obtenue, puis de tester le côté le plus susceptibles de trois pools restants sur le second coulisseau, et ainsi de suite jusqu'à ce qu'une réaction positive est obtenue). Cela garantit que les sérotypes les plus courants sont testés en premier lieu, réduisant au minimum le temps et les réactifs nécessaires.
  11. En utilisant la clé du fabricant de antisérums déterminer qui antisérums individu sont représentés dans la piscine positif.
  12. Testez chacun des groupes ou des types contenus dans le pool positif individuellement afin de déterminer le «groupe» ou «type» comme dans les étapes 4.1 à 4.8 ci-dessus.
  13. Déterminer le résultat par référence à la clé du fabricant de antisérums. Si un «type» est déterminée (par exemple, le sérotype 5), alors aucun autre essai n'est nécessaire et ce résultat est enregistré.
  14. Si un «groupe» est déterminée (par exemple, un groupe 19), puis reportez-vous à la clé des fabricants afin de déterminer les facteurs à tester. Poursuivre les essais avec les «facteur» différents réactifs de latex et de déterminer le sérotype final (par exemple, le sérotype 19B).

Representative Results

Une réaction de latex positif se produit lorsque l'anticorps spécifique du type attaché à la particule de latex se lie à la capsule du pneumocoque, et l'agglutination des particules d'anticorps marqué s'ensuit 15. Figure 1A montre une réaction positive, qui est caractérisé par une agglutination visible et de la compensation de l'arrière-plan suspension. Une réaction négative est caractérisée par la suspension de réactif d'agglutination au latex lisse et blanc restant (figure 1B). Les réactifs sont optimisés de telle sorte qu'une réaction positive doit être observée avant la fin de l'intervalle de temps d'une minute (habituellement détectable dans environ 20 secondes). Nous ne recommandons pas à lire les réactions après l'intervalle de temps de 1 min. Très rarement, des réactions afficher faible agglutination autour du bord de la goutte qui n'est pas accompagné par compensation de la suspension de fond, ou semble «filandreuse» sans fond de compensation (données non présentées). Ce sont plus comme ly réactions négatives. Dans de tels cas, nous recommandons de nouveaux essais et / ou d'autres investigations utilisant une autre méthode de sérotypage (par exemple, la réaction Quellung 17).

Figure 1
Figure 1: réactions d'agglutination au latex positifs et négatifs. Préparations des pneumocoques isolat mélangés avec le réactif d'agglutination au latex montrant une réaction positive (A) ou une réaction négative (B). Agglutination accompagné de compensation de l'arrière-plan se voit dans la réaction positive (A) .Il agglutination visible, avec le réactif de contrôle négatif de latex ou dans une réaction de test négatif (B). Photographies 8 utilisés avec la permission."Target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Agglutination au latex est une méthode simple, rapide et peu coûteuse pour le sérotypage pneumocoque. Pneumocoque réactifs d'agglutination au latex commerciaux sont disponibles, mais ils ne font actuellement pas tous les sérotypes pneumococciques connue 10,12. Toutefois, les réactifs d'agglutination au latex peuvent être facilement produits en interne en utilisant des antisérums acheté soulevé contre les antigènes capsulaires pneumococciques spécifiques. Dans le procédé décrit ici, les anticorps sont fixés passivement à des particules de latex pour faire un ensemble de réactifs d'agglutination au latex.

Une réaction de latex positif se produit lorsque les anticorps spécifiques liés à des particules de latex se fixent sur ​​les antigènes de la capsule polysaccharidique pneumococcique de l'isoler 18,19. Les particules de latex attachés aux anticorps permettent la réaction antigène-anticorps spécifique pour être visualisé à l'œil nu.

Agglutination au latex est une méthode appropriée pour les laboratoires à haut débit unD aussi pour les pays à ressources limitées. Les principaux avantages de la méthode d'agglutination au latex sont que aucun équipement spécialisé est nécessaire pour effectuer le test, les réactifs ont une durée de vie d'au moins 2 ans s'il est entreposé à 4 ° C 8, et qu'il est peu coûteux, simple et rapide à effectuer. Le sérotypage un isolat pneumococcique par agglutination au latex prend environ 10 min, et jusqu'à quatre réactifs de latex peuvent être testés en parallèle sur l'une diapositive. En outre, si la prévalence des sérotypes est connu pour le réglage épidémiologique, les tests peuvent être effectués dans les cycles commençant par les piscines contenant les sérotypes les plus courants est similaire à l'essai Quellung 17. Cette approche réduit le nombre de tests nécessaires pour déterminer le sérotype. Le procédé est également très reproductible entre différents opérateurs (données non présentées). Un inconvénient de l'agglutination au latex sérotypage est que la production des réactifs est consommatrice de temps, en prenant environ 4 h; bien reage multiplesnts peut facilement être produit en parallèle. En outre, certains antigènes sont communs entre les différents sérotypes de pneumocoques, entraînant des réactions croisées avec certains antisérums (par exemple, le sérotype 29, 42 et Groupe 35). Cependant, ces réactions croisées sont bien caractérisés en utilisant des antisérums commercial (qui est généralement préabsorbé pour éliminer les anticorps à réaction croisée plus problématiques) et tables de réaction supplémentaires sont fournies par le fabricant afin de distinguer ce qui sérotype est présent. réactifs de latex peuvent également traverser réagissent si les anticorps ne sont pas correctement alignées sur les particules de latex; ceux-ci sont détectés comme des échecs QC. Dans notre expérience, rigoureux QC est essentielle à la réussite de cette méthode, même si antisérums disponibles dans le commerce sont utilisés pour la production. QC prend environ 15 minutes par le réactif et repose sur un ensemble de QC isolats approprié comme décrit ci-dessus.

La méthode décrite ici donne des réactifs qui donnent une réaction bien positif wimince de la période d'essai. Dans notre expérience, les faux positifs sont rares dans la pratique (données non présentées). Réactions négatives faux occasionnels sont respectées; habituellement se rapportent à des problèmes connus avec un sérum particulier (par exemple, le sérogroupe 6 isolats peuvent pas réagir avec piscine B antisérum), ou la régulation négative de l'expression de la capsule par l'isolat. Utilisation de la algrorithm sérotypage fournies par le fabricant est également important, comme dans la plupart des cas une réaction faussement positive ou négative conduira à un résultat «borgne». Dans ces cas, et lorsque les réactions sont difficiles à interpréter, nous vous recommandons de répéter les essais et / ou des essais par une méthode alternative telle que la réaction Quellung.

Certains dépannage est parfois nécessaire de faire réactifs au latex satisfaisants. Dans le procédé décrit ici, l'anticorps est fixé à des particules de latex par adsorption passive 15,19, donc une variable critique est la concentration d'anticorps utilisée, qui détermine la façon dontla surface des particules de latex est recouverte et l'alignement ultérieur des sites actifs d'anticorps 15,20. Par conséquent, si l'anticorps en excès ou insuffisante est attaché aux particules de latex, les réactions anticorps-antigène ne seront pas optimales, et les réactifs non satisfaisantes peuvent être produites 15,20,21. Comme les titres d'anticorps varient entre différents lots d'antisérums, un ensemble standard de dilutions peut pas produire des réactifs qui se comportent bien 8. Un point de départ utile est d'utiliser une dilution 1:40 de sérum, et si ce n'est pas réussie, diluer le sérum plus loin. Dans notre expérience, cela résout généralement le problème 8. Dans un petit nombre de cas réactifs peuvent montrer faible agglutination qui n'est pas accompagné par un effacement de la suspension lorsqu'il est testé avec cible isole. Dans ces cas, la dilution de l'antisérum n'améliore pas la qualité du réactif, mais réactifs satisfaisants peuvent généralement être produites en omettant la centrifugation et des étapes de lavage 8,22

Recouvertes d'anticorps particules de latex sont utilisés couramment en microbiologie de diagnostic pour la détection, l'identification ou le sérotypage de nombreux microbes différents 15,20. En tant que tel, la méthode décrite ici peut être adapté à la préparation des réactifs de latex à d'autres fins, à condition antisérums est disponible et les procédures adéquates sont adoptées QC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microparticles based on polystyrene, 800 nm Sigma 65984-10 ml-F Or other volumes as required
Normal rabbit serum Antibodies Australia  NRS-1ml Or other volumes as required, bring to RT before use
Pneumococcus (Neufeld) antisera SSI Diagnostica Various Bring to RT before use
http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
Sterile Bovine Albumin  Sigma A-4503 Bring to rRT before use
Sodium azide 10% (v/v) solution  VWR International ROAC3902/100ml Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml Eppendorf 0030 120.094 Round bottom
Sodium chloride Merck 10241.AP
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl Copan CD175SO1
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm Thermo Fisher Scientific LBS 2950RC
5 M NaOH BDH 10252 Caution: highly corrosive
Glycine Merck 10119.05
Horse Blood Agar (HBA) plates Thermo Fisher Scientific PP2001 Bring to RT before use
http://www.thermofisher.com.au
Rotating wheel Wyble Engineering Development Corporation
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml Technoplas S5016SU
60 ml syringes without needles Terumo SS-60L
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RS
Brochure on Neufeld antisera Statens Serum Institut Key to determining serotypes
http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
Key to pneumococcal factor serum Statens Serum Institut 18058 For determining serotype within Groups
http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
*alternative sources are available for most materials

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References

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