RNA isolatie van Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rijke Tissue

1Pharmaceutics & Pharmaceutical Chemistry, The Ohio State University
Published 8/02/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Azevedo-Pouly, A. C., Elgamal, O. A., Schmittgen, T. D. RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue. J. Vis. Exp. (90), e51779, doi:10.3791/51779 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Isolatie van RNA met hoge integriteit is vereist voor routine moleculaire biologische experimenten zoals Northern blotting 9, qRT-PCR 1 of genexpressieprofielen 5. De meeste hedendaagse werkwijzen RNA-isolatie zijn gebaseerd op modificaties van de guanidine thiocyanaat protocollen 2, 3. Guanidine thiocyanaat is een sterk eiwit denaturerend en effectief verstoren de activiteit van ribonuclease onder de meeste omstandigheden. De populaire methode van Chomczynski en Sacchi 3 gecombineerd fenol de guanidine thiocyanaat lysis oplossing ontsluiting tijd ongeveer 4 uur. Vele commercieel verkrijgbare RNA-extractie reagentia zijn gebaseerd op het Chomczynski en Sacchi methode 3.

Ribonuclease rijke weefsels zoals mens of muis pancreas ook een extra uitdaging voor het isoleren van RNA. Muis alvleesklier kan tot 75 mg ribonuclease 6 bevatten die zal worden uitgebracht During verstoring van de pancreas weefsel resulteert in weefsel autolyse. Modificaties van de guanidine thiocyanaat protocollen zijn met succes gebruikt om RNA te isoleren uit pancreas met hoge integriteit 2, 4, 7, 10. Infusie van RNA stabilisatie reagens in muis pancreas vergemakkelijkt isolatie van RNA met hoge integriteit 4, 7, 10, infusie evenwel van oplossingen in de alvleesklier vereist grote vaardigheid, gespecialiseerde instrumenten zoals een dissectie microscoop en verstoren weefselarchitectuur tijdens de procedure kan tot cellysis nodig. Perfunderen weefsel met RNA stabilisatie reagens kunnen interfereren met andere toepassingen, waaronder eiwitisolatie en histologische kleuring. Bovendien is deze techniek niet geschikt voor het isoleren van RNA van humane pancreas. Andere protocollen vereisen de voorbereiding van specifieke oplossingen door de onderzoeker 2.

Wij rapporteren een protocol om RNA te isoleren met een hoge integriteit van de muis pancreas. The protocol gebruikt elementen van eerder gepubliceerde werkwijzen en is grotendeels gebaseerd op de standaard fenol / guanidine-thiocyanaat gebaseerde lysis reagens protocollen. Het is niet de voorbereiding van gespecialiseerde oplossingen vereisen evenmin infusie van reagentia nodig in de alvleesklier. Kritische stappen voor een succesvolle RNA-isolatie zijn voorzien van een high fenol /-guanidine gebaseerd lysisreagens om weefsel ratio, het verwijderen van onverteerd weefsel voorafgaand aan de scheiding en het opnemen van een ribonucleaseremmer fase naar de resulterende RNA oplossing. Door deze en andere modificaties, wij doorgaans isoleren RNA met RIN groter dan 7 wordt gebruikt voor normale genexpressie analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding

De volgende praktijken houden aan de door de Animal Care en gebruik Comite van de Instelling (IACUC) vastgesteld beleid.

  1. Het wordt aanbevolen om niet meer dan 6 muis pancreases isoleren in een bepaalde dag. Zijn alle chirurgische instrumenten schoon en autoclaaf, een set per dier.
  2. Label alle microcentrifugebuizen. Vier 2 ml buisjes per dier.
  3. Plaats 8 ml lysis reagens in 50 ml centrifuge buizen op ijs. Opmerking: Als het zuiveringssamenstel heeft een guanidine thiocyanaat fenol reagens dat geschikt is voor alvleesklier isolering lysis reagens gebruikt vanwege de grote hoeveelheden die nodig zijn per isolatie.
  4. Verdeel ongeveer 10 ml van de volgende oplossingen in 15 ml centrifugebuizen voor schoonmaak blades de homogenisator is. Ethanol, 70% (2 tubes), HPLC-kwaliteit water (1 tube) en HPLC-kwaliteit water met ongeveer 200 pl RNase Away of gelijkwaardig ribonuclease inactivator.
  5. 2. Chirurgie, alvleesklier Dissection en homogenisering

    1. Plaats 1-2 ml van isofluraan in een pot met een gaasje of papieren handdoeken. Muizen worden op een platform dat hen verhindert het bereiken van de bron van de isofluraan geplaatst. Voeg verse isofluraan aan de pot voorafgaand aan verlamming van elke muis.
    2. Plaats voorzichtig de muis in de pot met de isofluraan. Cap de pot en toezicht houden op de gevolgen van de anesthesie door voorzichtig draaien van de pot heen en weer. Het dier wordt verdoofd zodra het in staat in zijn 'eigen te staan.
    3. Ter bevestiging van de anesthesie, verwijder het dier uit de pot en een stevige teen knijpen toepassing. Als de muis niet reageert op de teen knijpen, ga dan naar stap 2.5.
    4. Als de muis reageert op de teen knijpen, herhaal de stappen 2,2-2,3.
    5. Plaats de verdoofde dier op de bank top in buikligging. Ontwrichten baarmoederhals van de muis door strak plaatsen van de linkerhand op de baarmoederhals van de muis. Onsing de rechterhand grijpen de staart van de muis en snel omhoog trekken op ongeveer een hoek van 45 ° naar de baarmoederhals ontwrichten.
    6. Beveilig het karkas aan een oppervlak (een niveau stukje piepschuim bedekt met keukenpapier) door het doorboren van elk van het dier vier poten in het platte vlak met behulp van 25 gauge injectienaalden.
    7. Met behulp van steriele chirurgische instrumenten, snijd de buik van de muis open en snel te verwijderen van de alvleesklier van de muis. Gebruik de tang om de alvleesklier te houden en knip het uit de milt en de dunne darm met behulp van de lente schaar. Wees voorzichtig de alvleesklier niet te rekken tijdens het verwijderen van de muis. Verstoring van het weefsel kon ribonuclease vrijgeven. Opmerking: De tijd die nodig is om de pancreas van de muis verwijderd kritisch. De vakman moet kunnen de alvleesklier ontleden in ongeveer 1 min. of minder.
    8. Plaats het gehele alvleesklier in een 50 ml buis met 8 ml ijskoude lysis reagens. Doe het buisje dicht en even schudden om de ti onderdompelenssue in het reagens en doorgaan naar de volgende stap zonder vertraging. De verhouding van lysis reagens om weefsel kritisch. Zie paragraaf resultaten voor een vergelijking van de RNA integriteit geïsoleerd met verschillende volumina lysis reagens.
    9. Gehomogeniseerd, 5 sec. Het is belangrijk om de homogenisator messen op de bodem van de centrifugebuis zodat het weefsel wordt getrokken in de messen voor efficiënte homogenisatie.

    3. Verwijdering van Onverteerd Tissue

    Opmerking: Na homogenisatie zullen kleine stukjes weefsel in de lysis reagens blijven. Het is belangrijker om snel lyseren het weefsel verlaten wat weefsel in plaats van onverteerd dan homogeniseren en risico afbraak van RNA.

    1. Overdracht 2 ml lysis reagens dat de gelyseerde alvleesklier een 2 ml microcentrifugebuis. Verzamel twee microcentrifugebuizen van homogenaat per isolement. Gooi de resterende homogenaat of bewaar bij -80 ° C voor toekomstige studies.
    2. Centrifuge bij 4 ° C, 12.000 x g gedurende 5 min om de onverteerd weefsel pellet Dit is een cruciale stap als overdracht van onverteerd weefsel in latere oplossingen van RNA zal het monster waarschijnlijk besmet met ribonuclease (stap 5.13).
    3. Breng 1 ml van het supernatans in een 2 ml microcentrifugebuis. Ga verder met de isolatie onmiddellijk slaan repliceren buis bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. Plaats alle buisjes met homogenaat op nat ijs terwijl het doorgaat met de volgende stap.
    4. Gooi de resterende lysisreagens in een geschikte chemische afvalbak.

    4. Reiniging van de Homogenizer Blades

    1. Alvorens over te gaan naar de volgende isolatie, het reinigen van de homogenisator messen door ze in 10 ml 70% ethanol. Activeer de homogenisator voor ongeveer 20 sec tot enige stukjes weefsel dat in de bladen mag worden gevangen te verwijderen.
    2. Gebruik een 200 ul pipet tip om alle stukken die nog in de homogenisatie-bladen te verwijderen. Herhaal stap 4.1 in water, algemeen Rnase inactivator en 70% ethanol. Droog de homogenisator as met een schone Kim vegen.
    3. Herhaal stap 2.1 voor de pancreas isolatie van de overblijvende dieren, waarbij RNA geïsoleerd uit elk dier afzonderlijk plaats bundeling van RNA.

    5. RNA Isolation

    De volgende sectie is gelijk aan de zuivering kit protocol. Het voordeel van de zuivering kit is dat het totale RNA waaronder kleine RNA isoleert.

    1. Als het gebruiken van bevroren homogenaat oplossing, ontdooien op nat ijs en laat het staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    2. Voeg 200 ul van chloroform, de dop op de buis en schud krachtig met de hand gedurende 15 sec. Laat de buis staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten.
    3. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 12.000 xg, 4 ° C.
    4. Breng de bovenste waterlaag in een microcentrifugebuis. Voeg 1,5 volumes isopropanol en meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen.
    5. Transfer tot 700 ul van het monster in een spin kolom die is geplaatst in een 2 ml verzamelbuis. Sluit het deksel en centrifugeer bij 8000 xg gedurende 15 seconden bij KT.
    6. Gooi de doorstroom.
    7. Herhaal stap 5,5-5,6, met de rest van het monster.
    8. Voeg 700 ul buffer RWT aan de spin kolom. Centrifugeer gedurende 15 sec bij 8.000 x g. Gooi de doorstroom.
    9. Pipetteer 500 ul buffer RPE in de spin kolom. Centrifugeer gedurende 15 sec bij 8.000 xg om de kolom te wassen. Gooi de doorstroom.
    10. Voeg 500 ul buffer RPE de spin kolom. Centrifugeer gedurende 2 min bij 8000 xg om de kolom te drogen.
    11. Breng de spin kolom een ​​1,5 ml microcentrifugebuis. Pipet 80 ul-ribonuclease gratis water direct op de spin kolom membraan. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 8000 xg om het RNA te elueren.
    12. Voeg 1 ul Rnase-remmer aan het RNA-oplossing. Bewaren bij -80 ° C of overgaan tot 5.13.
    13. Om de integriteit van het RNA valideren eerst berekenen RNA concentration en 260/280 verhouding met behulp van een spectrofotometer.
    14. Verdun een deel van de RNA oplossing tot ongeveer 500 ng / pl met moleculaire biologie kwaliteit water.
    15. Bepaal de RNA integriteit (dwz, RIN) met behulp van capillaire elektroforese analyse. Ongeveer 5 ui RNA oplossing is voldoende voor de analyse.
    16. Aliquot de RNA-oplossing (zie figuur 2) en bewaar bij -80 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De totale RNA opbrengst van 1 ml lysis homogenaat 20-40 ug. OD 260/280 ratio's zijn meestal rond de 2.0 en de RIN zijn consistent hoger dan 7,0. Als de RIN is ≤ 6, wordt de isolatie moeten worden herhaald. Soms wordt een RIN die hoger is dan 8,0 bereikt.

De twee meest gebruikte methoden van euthanasie muizen vóór verwijdering van de alvleesklier CO 2 stikken of inhalatie van isofluraan. Beide worden gevolgd door cervicale dislocatie. Omdat het mogelijk is dat het chemische middel en / of proceduretijd RNA integriteit RIN van muis alvleesklier RNA geïsoleerd met beide technieken vergeleken kunnen beïnvloeden. Muizen werden verdoofd met behulp van CO 2 stikken of isofluraan inhalatie; beide technieken werden gevolgd door cervicale dislocatie. De tijd voorafgaand aan cervicale dislocatie verdoven dieren ongeveer 1 tot 2 minuten langer CO 2 stikken opzichte isoflUrane. RNA geïsoleerd na inhalatie van isofluraan produceerde een RIN van 7,5 ± 0,31 vergeleken met een RIN van 2,2 ± 0,3 (p <10 -4, gemiddelde ± SD, drievoud isolaties) voor CO 2 stikken. Werkwijze euthanasie heeft een dramatisch effect op RNA integriteit en de techniek van isofluraan inhalatie voorkeur 2 stikken CO.

De integriteit van RNA geïsoleerd uit muis alvleesklier die werden gehomogeniseerd in 2, 4 en 8 ml lysis reagens werden vergeleken. Onze hypothese was dat verhoging van lysis reagens zal leiden tot een grotere ribonuclease inactivering. Anders dan het volume van lysis reagens, alle waren identiek aan die in het protocol opgenomen. Er is een directe correlatie tussen de hoeveelheid lysis reagens dat in de homogenisering en RNA integriteit (figuur 1). De RIN RNA geïsoleerd met behulp van 2, 4 en 8 ml lysis reagens 4,2, 6,5 en 7,4 respectievelijk (gemiddelde, drievoud isolations). Derhalve 8 ml lysis reagens worden gebruikt in dit protocol.

Voor sommige experimenten, kan het nodig zijn om zowel RNA als eiwit van dezelfde alvleesklier verzamelen. Bijvoorbeeld kan RNA worden gebruikt voor qRT-PCR en eiwit kan worden gevisualiseerd met behulp van immunohistochemie. Als dit het geval is, is het raadzaam om de alvleesklier te halveren van kop tot staart. Dit is belangrijk aangezien de alvleesklier verschilt anatomisch van kop tot staart. Aantonen eventuele verschillen in RNA integriteit bestaat tussen RNA geïsoleerd uit ofwel de helft van de alvleesklier, werd het volgende experiment uitgevoerd. RNA werd geïsoleerd uit de eerste helft van de alvleesklier. De RIN bepaald uit dit RNA werd vergeleken met die van RNA geïsoleerd uit de tweede helft van de pancreas na gezeten bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 30 seconden tijdens het opwerken van de eerste helft. De RIN voor de eerste helft van de alvleesklier was 7,4 ± 0,20 vergeleken met een RIN van 6,9 ± 0,55 voor de volgende helft. Tijdens het snijden de alvleesklier bijdeze wijze lijkt niet ribonuclease en digestie van RNA vrij, als de alvleesklier wordt doorgesneden, wordt aanbevolen de eerste helft gebruikt voor RNA-analyse en de tweede helft van eiwit.

Lysisreagens verstoort eiwitstructuur en dus vermindert ribonuclease activiteit. Vanwege de grote hoeveelheid ribonuclease die in de alvleesklier, is het mogelijk dat een actief ribonuclease blijft de lysis homogenaat en dit ribonuclease zal de temperatuur ervan op de waterfase. Elke ribonuclease dat in de laatste RNA oplossing blijft zal belemmeren integriteit. Daarom maken we een ribonuclease inhibitor toegevoegd aan de waterige oplossing van RNA. Het RNA integriteit werd vergeleken van een RNA-oplossing die ribonucleaseremmer bevatte een die dat niet deden. Bij een vries dooi, RIN voor het oplossen van RNA met remmer was 7,3 ± 0,15 in vergelijking met 2,9 ± 0,65 (figuur 2, p <0,001, gemiddelde ± SD, drievoud isolatie) voor deoplossing die niet remmer bevatte. Een ander probleem is de mogelijkheid dat herhaalde vries ontdooien zal de ribonuclease denatureren remmer waardoor het ineffectief. Om deze mogelijkheid te onderzoeken, werd een oplossing van RNA met ribonuclease inhibitor herhaaldelijk ingevroren en ontdooid. De RNA oplossingen werden ingevroren en ontdooid tot 5 keer nog steeds geproduceerd een RIN van 7 of hoger, terwijl die oplossingen die werden ingevroren en ontdooid 6 maal of hoger produceerde een RIN dan 7 (figuur 2). Het wordt aanbevolen om de RNA-oplossing vóór het invriezen aliquot en beperk het aantal vries dooi cycli.

Om de bruikbaarheid van deze werkwijze tonen, voerden we qRT-PCR op het geïsoleerde RNA. De gemiddelde RIN van drievoud RNA isolaties was 7,4 ± 0,20 (gemiddelde ± SD). Willekeurig geprimed cDNA werd gesynthetiseerd uit het RNA en de expressie van drie housekeeping genen werd gemeten door qPCR toepassing van standaardtechnieken. De in figuur 3 gegevens valideertons vermogen om met succes gebruik de muis alvleesklier RNA in een standaard moleculair biologische technieken.

Figuur 1
Figuur 1. Hoge lysis reagens weefsel verbetert met RNA integriteit. De integriteit van RNA geïsoleerd uit muis alvleesklier die werd gehomogeniseerd in 2 (A, D), 4 (B, E) of 8 (C, F) ml lysis reagens vergeleken. Anders dan het volume van lysis reagens, alle waren identiek aan die in de hierin beschreven protocol. Een directe correlatie bestaat tussen de hoeveelheid lysis reagens dat in de homogenisering en RNA integriteit. (G) Gemiddelde ± SD, triplo isolaties. p <0.05, ** p <0,001. Klik hier om te bekijken een grotere versievan dit cijfer.

Figuur 2
Figuur 2. RNA uiteindelijk afbreekt na herhaalde vries ontdooien. RNA geïsoleerd uit muis alvleesklier herhaaldelijk ingevroren en ontdooid in de aanwezigheid of afwezigheid van ribonuclease inhibitor (RNase I). Gemiddelde ± SEM, ** p <0,001.

Figuur 3
Figuur 3. QRT-PCR muis alvleesklier RNA. RNA werd geïsoleerd uit drie muis alvleesklier met de geoptimaliseerde protocol. De expressie van 18S rRNA, β-2 microglobuline en snoRNA251 werd bepaald met qRT-PCR (gemiddelde ± SD).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het isoleren van RNA uit weefsels die zijn Ribonuclease rijk vormt een grote uitdaging voor de moleculaire biologie experimenten. Verschillende reagentia en kits zijn commercieel beschikbaar die zijn voornamelijk gebaseerd op het fenol guanidine thiocyanaat methode RNA-extractie. Guanidinethiocyanaat denatureert eiwitten en vermindert de activiteit van ribonuclease. Echter, de enorme omvang van ribonuclease in pancreas vereist extra aanpassingen aan standaardprotocollen van RNA isolatie. Een protocol wordt hiervoor gemeld dat is gebaseerd op de standaard guanidine thiocyanaat methode Nog bevat verschillende kritische wijzigingen alsmede tips voor een succesvolle isolatie van RNA uit ribonuclease rijke weefsels zoals de alvleesklier.

Standaard richtlijnen voor het isoleren van RNA worden opgemerkt. Deze technieken zijn cruciaal voor een succesvolle isolatie van RNA, zelfs van exemplaren die minder ribonuclease-rijk dan alvleesklier. Enkele voorbeelden zijn het gebruik van moleculaire biologie leerjaar water,-ribonuclease gratis verbruiksgoederen en wegwerp plastic ware in plaats van glas. Het wordt aanbevolen om handschoenen tussen elke afzonderlijk wijzigen. Voor iemand die onervaren is met het isoleren van RNA, wordt aanbevolen dat zij ervaring met het isoleren van RNA uit ribonuclease-arme monsters, zoals de lever of van celculturen voorafgaand aan het aanbreken van het werk dat vereist dat het isoleren van RNA uit de alvleesklier te krijgen. Uitstekende protocollen bestaan ​​die een verscheidenheid van punten te bieden voor het succesvol werken met RNA 8.

Een aantal belangrijke factoren voor het isoleren van RNA met een hoge integriteit van de muis pancreas worden hier gerapporteerd. Deze omvatten de hoeveelheid lysis reagens tijdens de homogenisering en het opnemen van een ribonuclease inhibitor aan het RNA-oplossing. De methode van het opnemen van de ribonucleaseremmer goed werkt, zal echter herhaalde vries dooi cycli uiteindelijk verminderen de RIN, waarschijnlijk te wijten aan het denatureren de ribonucleaseremmer. Opgemerkt zij dat alle RNA oplossingen used in deze studie ging door een vries dooi voorafgaand aan RIN vastberadenheid. Een andere methode om afbraak bij diepvriesbestendig is aan het RNA oplossing bewaren bij -20 ° C in neergeslagen vorm 2. Dit biedt een aantal ongemakken namelijk het verwijderen van de ethanol en opnieuw oplossen van de pellet vóór gebruik van het RNA. Vergeleken met de fenol / guanidine thiocyanaat reagens protocollen 2, voordelen van de hier gerapporteerde protocol is de eenvoud van het werken met lysis reagens en de zuivering kit die niet bereiding van gespecialiseerde oplossingen en buffers vereisen. Ook moet worden opgemerkt dat dit protocol is met succes gebruikt om kleine RNAs uit muizen alvleesklier te isoleren.

Extra tips omvatten de snelheid van pancreas dissectie en de wijze van anesthesie voor euthanasie (isofluraan inhalatie voorkeur 2 stikken CO). Verschillende pogingen bij het beoefenen van de alvleesklier chirurgie worden geadviseerd alvorens anticiperen high quality RNA. Aanpassing van dit protocol om ribonuclease-rijke weefsels zoals de milt of de longen moet gemakkelijk haalbaar zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Wij danken Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul Grippo en Satyanarayana Rachagani voor hun nuttige opmerkingen, suggesties en het delen van hun protocollen. Dit werk werd ondersteund door subsidie ​​U01CA111294 en an Idea Development Award van de Ohio State University Intramurale Research Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Power Gen 500  Fisher Scientific 14-261-03  Homogenizer
5424R Eppendorf Refrigerated microcentifuge
Trizol reagent Invitrogen 15596018 Lysis reagent
Student Vannas spring scissors Fisher 91500-09  Use to cut pancreas from attached tissues
Surgical scissors, 6 inch Fisher 08-951-20 Use to cut scin of mouse
Blunt end forceps Fisher 1381239 Use to hold pancreas while dissecting
Isoflurane USP Abbott Labs 4/8/5210 Anesthetic
Rnase out (40 U/µl) Invitrogen 10777-019 Rnase inhbitor
Rnase Away Ambion 10328-011 General Rnase inactivator
HPLC grade water Fisher W5-4 For washing homogenizer blades
Molecular biology grade water Hyclone SH30538.03 Elution of RNA
miRNeasy Mini kit Qiagen 217004 Purification Kit
2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free USA Scientific Plastics 1620-2700
15 ml centrifuge tubes Falcon 352099
70% ethanol Fisher
100% ethanol Fisher
200 µl pipet tips Rainin GPL200F For cleaning homogenizer blades
Chloroform Fisher BP1145-1
Nanodrop Thermo ND-1000 Spectrophotometer
Bioanalyzer Agilent Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity
RNAlater Ambion RNA Stabilization Reagent 
RNeasy spin columns  Qiagen Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit
Mice Chales River Strain C57BL/6 Their age ranged from 4 to 12 months.  
Mice  Jackson Lab strain 129 Their age ranged from 4 to 12 months.  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
  2. Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).
  3. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
  4. Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas. Biotechniques. 52, 332-334 (2012).
  5. Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science. 283, 83-87 (1999).
  6. Lenstra, J. A., Beintema, J. J. The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases. European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).
  7. Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40, 617-621 (2006).
  8. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. RNA A Laboratory Manual. Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).
  9. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).
  10. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments JoVE. (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats