培養

Biology

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Summary

線虫は通常、固形寒天プレート上で増殖させ、または液体培養で大腸菌を接種されている大腸菌 。毒物および栄養研究交絡からの細菌の副生成物を防ぐために、我々はダウンストリームのアプリケーションの範囲のためのワームを大量に成長し、同期させるために、無菌液体培地、CeHRを利用した。

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Samuel, T. K., Sinclair, J. W., Pinter, K. L., Hamza, I. Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment. J. Vis. Exp. (90), e51796, doi:10.3791/51796 (2014).

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Abstract

このプロトコルでは、必要な材料を提示し、修正Cを製造するための手順。電子のlegans馴化培地および再生(mCeHR)。また、Cを露出し、順化のためのステップE.上に成長した液体培地を無菌にする大腸菌が記載されている。無菌Cを利用し、最終的に、下流の実験虫は、この手順の利点を示す。 Cを分析し、決定する能力の栄養要件は、ヘム濃度を変化させて無菌液体培地中の窒素野生型線虫を成長させることによって示された。この手順では、ワームの増殖および発達のための最適濃度を決定するために、または、薬剤治療の毒性効果を決定するために、他の栄養素を複製することができる。野生型線虫の成長に様々なヘム濃度の効果は、定性的な顕微鏡観察を経てTを定量することによって決定した各ヘム濃度に生えワームの彼は数。また、多様な栄養素の濃度の効果は、関心対象の栄養素の変化に応答する蛍光センサーを発現するワームを利用することによってアッセイすることができる。さらに、ワーム多数の容易に微粒子衝撃を用いて、トランスジェニックC.エレガンスの生成のために作製した。

Introduction

土壌線虫、 線虫(Caenorhabditis elegans)は 、遺伝学からの毒物学の多くの研究に使用される強力なモデル生物である。その1mmの大きさは、4日間の迅速な世代時間、培養の容易さ、および大子孫数の結果として、これらの線虫は、遺伝的および薬理学画面1、2の数で利用されている。研究者は、脊椎動物系において保存分子や経路を同定するために、このワームを利用しています。これらの経路は、細胞死シグナル、加齢や代謝経路、および神経系3-6が含まれいます。また、Cの透明性エレガンス直接遺伝子発現パターンおよびタンパク質局在を分析するために可視化することができる蛍光タンパク質レポーターを用いて、トランスジェニック系統の生成を可能にする。

多くの研究では、この線虫線虫成長培地(NGM)プレートを用いて、固体寒天ベースの表面上またはlで培養されるiquid培養は、食料源7,8として大腸菌を播種。これらの細菌の食料源は副産物結果の解釈に影響を与える細菌からの干渉との生化学的および毒物学的研究を混乱することができます。これらの複合効果を回避するために、C.エレガンスは、食物源として細菌を欠いている無菌液体培地で培養することができる。このメディアを使用して、我々は成功し、多くの標準的なCには、高度に同期化されたワームの何百万人を培養しCの差別的に調節された遺伝子のマイクロアレイ解析などの虫プロトコル虫は異なるヘム濃度に暴露し、遺伝子衝撃を使用してトランスジェニックワームの生産。このメディアは、化学的に定義されており、博士エリッククレッグ9によって配合オリジナルレシピから変更されている。 10は 、ここであろう(HRG複数)のようなヘム応答性遺伝子と呼ばれるこのmCeHRメディアを使用して、我々は正常ヘム恒常性に関与する遺伝子を同定したE.を接種NGM寒天プレートを用いる標準的な増殖条件下で可能ではなかった大腸菌

このプロトコルでは、Cを導入し、維持するための手順を説明しますE.上に成長した無菌mCeHRに大腸菌およびトランスジェニックC.を製造するためのワームを大量に取得するには、この方法を利用して微粒子衝撃を使って虫ラインCの栄養所要量を決定するための無菌の媒体を使用することの有用性を示す、我々もまた、本研究でエレガンス例としてヘムを用いて。これらの研究は、mCeHR媒体を使用してC.多数の急速な成長を可能にすることを示してワームの研究者によって利用され、多くのダウンストリームアプリケーションのためのエレガンス

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Protocol

1。ワーム株

  1. CをE.を接種線虫遺伝学センター(CGC)(http://www.cbs.umn.edu/cgc)から野生ブリストル N2株エレガンスとNGMプレート上でそれらを維持する大腸菌菌株OP50 7。注意:トランスジェニックワームは、以前に11を説明したようにIQ6011(PHRG-1 :: GFP)を利用が生成された株。 IQ6011は、対応する著者から要求することができます。

変更されたCの 2。準備居住再生中(mCeHR)

12下記のようmCeHR液体培地を用意します。この無菌液体培地は、ワームが追加の食料源なしで成長することができます。このような層流フードとして、厳密に無菌状態を使用して無菌液体培地および無菌ワームの全ての操作を行う。

  1. 食料品店から超低温殺菌無脂肪牛乳を入手します。冷蔵プロを使うダクトとしない常温製品。 mCeHR媒体、連勝で寒天プレートブレインハートインフュージョン(BHI)に牛乳を使用し、無菌性を確認するために30℃〜37℃で3日間インキュベートする前に。 -80℃で50ミリリットル滅菌チューブおよび格納するために牛乳を転送
  2. 下記の各成分を調製し、順序およびmCeHRの1 Lを調製するために所定量( 表1A)に結合する:2mMのコリン二酸、クエン酸10mlの、ビタミン及び成長因子の混合物を10ml( 表1Bのレシピを参照されたい)、 2.4 mMのミオイノシトール、2mMの塩化ヘミン10mlの脱イオン水250mlを10ml。 0.22μmのフィルターユニットを介して吸引し、フィルタを適用します。
  3. 核酸混合物を20ml( 表1Cにおいてレシピ)、ミネラル混合物を100ml( 表1Dでレシピ)、170 mg / mlのラクトアルブミン加水分解物20mlを、必須アミノ酸、20mlの非必須アミノ酸、10 mlを加え酸、450mMのKH 2 PO 4、20mlの1.45 M D-グルコース、1 M HEPES 10mlのナトリウム塩を250mlの脱イオン水50ml。
  4. コンポーネントを殺菌フィルタに吸引を適用します。フィルタを削除し、5 mg / mlのコレステロールの1ミリリットルを加える。培地のpHは約6〜6.5であることを確認してください。注:この溶液を最大1年間-80℃で保存することができる。
  5. 使用前にmCeHR培地に20%(v / v)の超低温殺菌された有機スキムミルクを加える。牛乳を開いて小分けするとき(層流フード内など)綿密に無菌技術を使用してください。 4℃で、メディアを格納

3℃に準備無菌mCeHR液体培地中で培養するための

  1. 多くの妊娠ワームやOP50 Eの最少量があるまで、10 60ミリメートルNGMプレート上でワームを育てるプレート上の大腸菌
  2. M9バッファー( 表1Fにあるレシピ)5mlでリンスすることにより、各プレートからワームを削除し、50ミリリットルコニカルチューブに結合します。
  3. sにワームを許可する慎重にEを含む上清を除去し、5から10分間放置し、チューブを残すことによってettle 大腸菌
  4. 繰り返して手順を続行する前に、可能な限り残留細菌をできるだけ多く除去するために3.2と3.3倍を繰り返します。
  5. 実施例1.5 mlの個々のワームがチューブから見ることができる3 mlまたは6ミリリットルのために、3の倍数である体積の0.1 N NaCl中ワームを再懸濁する。
  6. 5 N NaOHおよび5%次亜塩素酸ナトリウムウォーム懸濁液に午前1時02分06秒の割合で(漂白剤)の溶液を添加することによってワームを漂白する。例えば、1mlの5NのNaOH 2mlの5%次亜塩素酸ナトリウム:ウォーム懸濁液を6ml。ワームの懸濁液に添加する前に、NaOH及び漂白剤を混ぜる。
  7. 渦は、溶液を激しく妊娠ワームが溶解するまでしか卵は懸濁液(約5から10分)内に表示されます。 10倍の対物レンズとの位相差顕微鏡を使用してプロセスを監視します。
  8. ワームが完全に溶解した後、すぐにペレット4℃で45秒、800×gで卵上清を除去し、4℃で45秒間、800×gでペレットを遠心分離し、滅菌水10mlで二回、ペレットをすすぐ
  9. 漂白した後、100μg/ mlのテトラサイクリンを補充したmCeHR培地10ミリリットルを含む25cm 2の組織培養フラスコに卵ペレットを転送します。無菌技術を使用してこの手順を実行します。所望であれば、無菌の液体培養における細菌の増殖を防ぐために、250μg/ mlのナリジクス酸を含む追加の抗生物質を、追加する。
  10. 約70 rpmで振とう培養器で20℃で液体培養をインキュベートする。
  11. 発展段階や成長率に注目することは日々のワームを確認してください。
    注意:ワームは、最初はゆっくりと成長し、産卵期になるために7〜10日必要となります。ワームは、液体培地に順応しかし、世代時間は、野生型(N2)ワームは約4日間に減少します。
  12. ワームはDEVEを取得した後コニカルチューブにワームの文化を転送し、スイングバケットローターを使用して、4℃で5分間800×gでワームをペレット、液体培地中の妊娠の段階にloped。
  13. 上清を除去し、穏やかに0.1MのNaClを等量のウォームペレットを再懸濁。例えば、mCeHRの10ミリリットルで培養されたワームのために0.1MのNaClの10ミリリットルを使用しています。ワームは、氷上で5分間沈降することができます。
  14. ステップ3.5から3.8に、上記のような漂白手順を実施し、ワームは無菌液体培地中で第二世代のために成長することができます。必要に応じて、細菌増殖を阻害するために、再度、抗生物質を加える。
  15. 再びワームは、ステップ3.12と3.13で説明したように、ステップ3.5から3.8で説明したように同期化された集団を生成するために、再び漂白して、0.1MのNaCl中のワームをペレット化し、再懸濁し、妊娠になることを許可。今から、抗生物質を含まない液体培地中でのL1幼虫ワームを育てる。

液体から4。同期ワーム文化

  1. ペレットとステップ3.12と3.13で、上記のよう0.1MのNaCl中のワームを懸濁します。ステップ3.5から3.8で説明したように漂白剤。
  2. M9緩衝液10ml中に卵のペレットを再懸濁し、幼虫が回転プラットフォームシェーカー上で20℃でO / Nを孵化することができます。注:卵は、L1幼虫に孵化しますが、L1の段階でワームを同期、さらに発展しません。
  3. 維持·サブカルチャーワームは、5分間800×gでペレットのL1幼虫は、10 mCeHR mlの25cm 2のフラスコへの転送中に幼虫を再懸濁する。ワームは、回転プラットフォーム上で20℃で成長させる。ワーム十分な栄養を確保するために、3000ワーム/ミリリットル/ cm 2の最大密度を維持する。
    注:この段階では、抗生物質の手順は、層流フード内で無菌技術を用いて実施される無菌状態を維持するために必要とされない。ワームは、成長を監視するために、毎日チェックする必要があります。

5。無料無菌ミディアム培養にシュッと解凍ワーム

  1. 無菌非同期ワーム培養または液体窒素中で同期されたL1幼虫を凍結する。 5分間800×gでペレットワームはその後、各バイアル用の0.5ミリリットルを使用して、S緩衝液(6.45 mMのKHPO 4、43.55ミリモルKHPO 4、146.25のNaCl)を懸濁します。各バイアルは30%v / vのグリセロールでS緩衝液を等量の液体を追加し、N 2中で長期保存の前に-80℃にワームを転送する。各バイアル内のミリリットル当たり約1×10 6ワームを凍結する。
  2. ほとんど全ての氷が融解するまで約2分間、37℃でバイアルをインキュベートすることにより、ワームを解凍する。層流フードにおいて、mCeHRを含む滅菌フラスコにワームを転送し、20℃でそれらを配置

6。mCeHR成長と生殖に対するヘミン濃度の効果を決定する

  1. Cの栄養素依存性増殖をアッセイする無菌mCeHRメディアを使用 。エフェクトOを測定するために、ワームの成長と発展にFヘミン濃度、同期された無菌のN2ワームや関心のある他の菌株を使用しています。 4章で前述したように、L1幼虫を同期します。
  2. 翌日、ペレット、同期のL1幼虫をカウントし、無菌の媒体のμLあたり1ワームに希釈する。 0.3MのNH 4 OH中の10mM塩化ヘミンを作成し、濃HClを用いてpHを8に調整してください。
  3. 24ウェルプレートにmCeHRメディアの800を添加する。メディア100μlの各ウェルに100ワームを追加します。 0μM、1.5μMから三重に1,000μMの範囲の濃度で各ウェルに塩化ヘミンを追加します。全てのウェルは、0.3MのNH 4 OHを同じ濃度が含まれていることを確認してください。穏やか100 L1幼虫を各ウェルに添加されることを保証するためにピペッティングする前に、ワームを再懸濁した。
  4. 日々のワームを調査し、各ウェル中の各濃度の増加に注意してください。 9日間のインキュベーション後のワームの数をカウントし、各ヘムに対応するワーム/ mlの数をプロット濃度( 図1)。

ヘムセンサーワームに対するヘミン濃度の7。効果

  1. 4μM、8、10μMおよび20μMのヘミンを含むmCeHRにおける同期化のL1ヘムセンサーワーム(PHRG-1 :: GFP)をインキュベートする。
  2. 蛍光共焦点顕微鏡、48時間後のインキュベーション( 図2)を使用して画像のワーム。

8。トランスジェニックC.を生成するため mCeHRを活用微粒子砲撃を使用して、

注:生成およびmCeHRで栽培UNC-119(ED3)ワームを使って微粒子衝撃を実施するための手順を図3 13に概説されている。

  1. ワームの準備
    1. 砲撃の前に175cm 2のフラスコ1週間でmCeHR培地90ミリリットル中に約1×10 6非同期UNC-119(ED3)ワームを転送します。ワームは20℃、Oで成長することができます〜70回転( 図3-1)で振盪プラットフォームNA。
      注:一週間後、ワームの密度は、多くの大人の妊娠ワームと大幅に大きくする必要があります。約3×10 7のワームは、微粒子衝撃のために必要となります。
    2. 寒JM109 E.大腸菌は、氷の上10cmのNGMプレートを播種した。
    3. 2 50ミリリットルコニカルチューブに無菌ワームを移し、2分間800×gでワームを遠心する。上清を吸引し、M9バッファー( 図3-2)の50ミリリットルで、各チューブ内のワームを懸濁します。
    4. 成虫は、氷の上で10から15分間、重力によってペレット化することができます。
      注:2ミリリットルペレットは今> 90%の成虫が含まれている必要があります。この2ミリリットルペレットは約5×10 6のワームを持っており、1微粒子衝撃のために十分である必要があります。
    5. コー​​トチルドJM109の表面全体がワームの2ミリリットルペレットとNGMプレートを播種した。完全に吸収される液体は、その後、プレートを残してできるように( 図3-3)を進める前に、氷上で30分間。
  2. 金粒子の調製
    1. シリコン処理微量遠心チューブに金粒子30mgを秤量する。 1ミリリットルの70%エタノールを加え、5分間チューブをボルテックスする。
    2. チューブは金粒子をペレット化し10秒間6000×gで遠心分離し、その後、15分間座ってすることができます。慎重に金粒子にチューブの反対側に先端に触れることにより、ピペットチップを用いて上清を除去する。
    3. 1分間の滅菌水1ml、ボルテックスで金粒子を洗浄し、簡単に10秒間6000×gでチューブを遠心する。無菌50%グリセロール0.5mlに金粒子を再懸濁して、二回の洗浄ステップを繰り返します。
      注:金粒子の最終濃度は60 mg / mlであろう、それは、4℃で1〜2ヶ月間保存することができる
  3. DNA-金粒子ミックスを調製する
    1. 10で所望のプラスミドDNAの10μgのを組み合わせμシリコン処理した1.5mlマイクロチューブ内のUNC-119レスキュープラスミドのG。その後、1分間渦を脱イオン水50μl、よく再懸濁した金粒子溶液100μlを加える。
    2. 2.5Mの塩化カルシウムを150μlを加え、1分間再びソリューションをボルテックスする。この溶液に、3から5分間、0.1Mスペルミジンと渦の60を添加する。
    3. パルスは10秒6000×gで解決策を遠心、上清を除去し、70%エタノールを300μlを加える。 1分間よくボルテックス、6000×gでのパルス遠心、100%エタノール170μlの上清と再懸濁を削除します。積極的に5から10分後、遠心分離器をパルスし、上清を除去するためのソリューションをボルテックスする。
  4. 衝撃( 図3-3)
    注:このプロトコルは材料/機器の表で指定された粒子デリバリーシステムを用いて行われる。利用可能な粒子送達器具のための指示に従ってください。
      <李> 15cmのプレートにティッシュペーパーのシートを配置します。ピンセットを使用して、100%エタノール中に個々に7 macrocarriersを浸し、乾燥さ組織上に横たわっていた。
    1. 徹底的に70%エタノールでバイオリスティック室、マクロキャリアーホルダー、ターゲットプレートを清掃してください。清潔で、各衝撃手順の前に停止画面をオートクレーブ。
    2. 座席のツールを使用してホルダーにピンセットやプレスを用いてホルダーにmacrocarrriersをロードします。
    3. 均等に各マクロキャリアーの中心にあるのDNAコーティングされた金粒子の20μLを広め、次いで、溶液を完全に乾燥させます。
    4. エタノールで圧力分配器の2つの部分をきれいにし、エタノール洗浄破裂板と集合。衝撃室に組み立てられた圧力分周器と破裂板をネジ止めします。
    5. マクロキャリアホルダーをオートクレーブ停止画面を組み立て、必要な金属の棚上に装置を配置し、所定の位置にロックします。
    6. 組み立てMACRを挿入ocarrier圧力分配器下の割り当てられたスロット内の遺伝子銃室への装置と圧力分割器を使って合わせます。
    7. ターゲットプレート棚の上にワームとのオープンNGMプレートをテープと室のドアを閉じます。
    8. ワームに衝突、破裂板を破壊するのに必要な圧力を調整します。ディスクが破裂するまで、発射ボタンを押して、水銀の圧力の28インチの真空をオンにします。
    9. 真空を解除し、装置からNGMプレートを取り外します。プレートからワームを洗って20 10cmのNGMプレートに再配布JM109 E.を接種大腸菌図3-4)。
    10. ワームは25℃で10〜14日間成長し、プレートを飢えすることができます。 のunc-119欠陥から救出ワームは、通常の動きを有するであろうし、この時点で同定することができる。これらは独立したトランスジェニック系統(Figurを表すように、さらなる分析のために別々のプレートから少なくとも10「野生型」ワームを選ぶE 3-5)。

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Representative Results

C.を培養Eで発生した二次代謝産物からの干渉なしに、ワームが必要とする栄養素の決定における無菌液体培地エイズ虫大腸菌 。野生型N2ワームは、3世代以内にmCeHRメディアに順応し、NGM細菌プレート上で培養したワームに匹敵する成長を示す。実際、これらのワームは、OP50細菌上に成長したワームのための3.5日に比べて、4日以内に妊娠になる。

mCeHRを使用することの一つの利点は、これらのワーム14の正確な栄養要求を調べた研究で見られた。 図1においては、ワームmCeHRにおいて1mMの最大、ヘムの量の増加を補った増殖させた。これらのワームの観察は、ワームがL4幼虫期に開発したがmCeHR中の9日後に妊娠の段階に進行することができないと、4μM以下のヘム濃度で成長の明らかな遅延を示した。 10μMおよび20の濃度で56、M個のヘムは、ワームは、4日間で妊娠の段階に開発し、子孫を大量に生産する。ワームは、20μMのヘムを含有mCeHRで増殖させたときに子孫の最大数が見られた。ワームは、100μMと500μMのヘムで子孫を開発·生産し続けた。しかし、幼虫の子孫の数が大幅に20μMのヘムの最適ヘム濃度で成長ワームに比べて減少しました。 800μmと以上ヘム濃度は、これらのヘム濃度がワームに毒性であったことが示され、L3幼虫の段階で発育を妨げ、病弱なワームになった。

最適なヘム濃度およびC.上のヘム欠乏およびヘムの毒性の効果を決定することに加えて線虫の成長は、ヘムレポーター株を間接的により小さい濃度範囲内でワームのヘム状態を評価するために利用することができる。 IQ6011ワームは、ヘム応答性の転写レポーターを発現するトランスジェニックワームはP HRG-1 、図2に示すように、ヘムあふれ条件下で反転される。ヘム濃度が減少するにつれてGFP発現が20μMのヘムおよび増大に抑制される。ヘム濃度の増分変化を正確mCeHR媒体における遺伝子発現応答と相関させることができる。

慎重にワームに設けられた栄養濃度を制御することができることに加えて、mCeHR無菌媒体は、同期されたワームの多数の効率的な増殖を可能にする。この機能は、微粒子衝撃( 図3)のために利用することができる。少なくとも一つの統合された行を、この手順を用いて実施し、すべての微粒子ボンバードメント( 表2)から開発されている。


図1。 ヘム成長曲線エレガンスワームは、9日間mCeHR 1,000μM、0μMからヘム濃度の範囲で成長させた。各濃度の虫数をカウントし、プロットした。 1.5でμMのヘム濃度ワームは、L4とさらに発展することができませんでした。 800μMのヘムでワームは、L2-L3の段階で発育を妨げヘム毒性の効果を示した。

図2
図2。ヘムセンサー(PHRG-1 :: GFP)mCeHRの異なるヘム濃度の株の応答。同期ジェニックC. HRG-1を発現する線虫:: GFPは mCeHRの4 ​​を補充した培地、8、10、又は48時間20μMヘム中で増殖させた。画像はツァイスLSM 710 confocaで撮影されましたL顕微鏡。スケールバーは100μmである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図3
3。Cの微粒子衝突の概略 mCeHRで栽培UNC-119ワームを使用。(1)約3×10 7 UNC-119(ED3)ワームは、90ミリリットルmCeHR培地中で増殖させる。 (2)Gravidsを50mlコニカルチューブ中で10〜15分間氷上に静置した。 (3)約5×10 6妊娠ワームの2ミリリットルペレットを播種していないのNGMプレート上に均一に広げた。ワームは、目的のプラスミド12μgのと金粒子と複合体を形成し、UNC-119レスキュープラスミド6μgの殺到された。 (4)T彼は、ワームを大腸菌を播種20 10cmプレート上に分割された砲撃大腸菌 JM109株。 (5)25℃で2週間インキュベートした後、野生型線虫を有するプレートを、導入遺伝子発現の強度および分離率の分析のために選択した。

「ER> テーブル1DIGN:センター"> 表1E
表1A
CeHR、1 L
無菌テクニックと、1L(0.22ミクロン)の真空フィルターユニットを使用して、記載された順序に沿ってストック溶液と水の次のボリュームをフィルタリングします。
コリン二酸、クエン酸 10ミリリットル
ビタミンおよび増殖因子ミックス 10ミリリットル
ミオイノシトール 10ミリリットル
塩化ヘミン 10ミリリットル
脱イオン水 250ミリリットル
核酸混合物 20ミリリットル
ミネラルミックス 100ミリリットル
ラクトアルブミン加水分解物 20ミリリットル
エッセンシャルアミノ酸ミックス 20ミリリットル
非必須アミノ酸ミックス 10ミリリットル
KH 2 PO 4 20ミリリットル
D-グルコース 50ミリリットル
HEPES、ナトリウム塩 10ミリリットル
脱イオン水 250ミリリットル
ボリュームは、この時点で800ミリリットルになります
追加後、真空からフィルターユニットを取り外します。
コレステロール 1ミリリットル
超低温殺菌脱脂乳 200ミリリットル
表1B
ビタミン及び成長因子の混合物を100ml
解決策1:水ADDの60ミリリットルには:
N-アセチル-α-D-グルコサミン 0.15グラム
DL-アラニン 0.15グラム
ニコチンアミド 0.075グラム
D-パンテチン 0.0375グラム
DL-パントテン酸ヘミカルシウム塩 0.075グラム
葉酸 0.075グラム
ピリドキサミン2HClを 0.0375グラム
塩酸ピリドキシン 0.075グラム
フラビンモノヌクレオチド、ナトリウム塩 0.075グラム
チアミン塩酸塩 0.075グラム
解決策2:5ミリリットルの1NのKOHで下記の薬品を準備します。
パラアミノ安息香酸 0.075グラム
D-ビオチン 0.0375グラム
シアノコバラミン(ビタミンB12) 0.0375グラム
フォリン酸、カルシウム塩 0.0375グラム
ニコチン酸 0.075グラム
ピリドキサール-5 - リン酸 0.0375グラム
解決策3:0.0375グラム(±)α-L-リポ酸、1ミリリットルのエタノール中の酸化形態:
溶液1、2、および3を組み合わせて、100mlの最終容量をもたらす。 4℃の暗所に保管または-20℃で一定分量を凍結する
それがすぐに使用されているように、このミックス株式の小さなボリュームを作成します。
表1C
核酸混合物を100ml
水ADDの60ミリリットルへ:
アデノシン5'-一リン酸、ナトリウム塩 1.74グラム
シチジン5 ' - リン酸 1.84グラム
グアノシン2 ' - および3' - 一リン酸 1.82グラム
または
グアノシン5 ' - リン酸 2.04グラム
ウリジン5'-リン酸、二ナトリウム塩 1.84グラム
チミン(最後に追加) 0.63グラム
4℃の暗所で100ミリリットルおよび格納するために解決策を持って来るか、-20℃で一定分量を凍結する
それがすぐに使用されているように、このミックス株式の小さなボリュームを作成します。
ミネラルミックス、1 L
塩化マグネシウム•6H 2 O 4.1グラム
クエン酸ナトリウム 2.9グラム
クエン酸カリウム一水和物 4.9グラム
のCuCl 2•2H 2 O 0.07グラム
のMnCl 2•4H 2 O 0.2グラム
のZnCl 2 0.1グラム
のFe(NH 4)2(SO 4)2·6H 2 O• 0.6グラム
のCaCl 2•2H 2 O(常に最後の追加) 0.2グラム
それがすぐに使用されているように、このミックス株式の小さなボリュームを作成します。
その他の成分
KH 2 PO 4 450 mMの
コリン二酸、クエン酸 2 mMの
ミオイノシトール 2.4 mMの
D-グルコース 1.45 M
塩化ヘミン 0.1NのNaOH pH8.0中2 mMの
HEPES、ナトリウム塩 1Mの原液
コレステロールエタノールに5 mg / mlの
ラクトアルブミン酵素水解物 170 mg / mlの
表1F
M9バッファー、1 L
KH 2 PO 4 3グラム
のNa 2 HPO 4 6グラ​​ム
NaClを 5グラム
H 2 O 1 L
オートクレーブ30分
1Mの硫酸マグネシウム(無菌) 1ミリリットル

表1。mCeHRとmCeHRのコンポーネントのレシピ。

衝撃野生型の救助を持つ行救助/導入遺伝子を持つ行安定株
1 2 2 1
8 5 0
3 4 4 2
4 5 2 1
5 5 3 1
平均 4.8 3.2 1

表2。アベラトランスジェニックCの GE番号虫は微粒子銃を使用して生成。

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Discussion

このプロトコルでは、急激な温度が可能に変更された無菌の液体メディアmCeHRを提示ワームは、多数の生産を生成エレガンス 。ワームは、Eを汚染することなく成長しているように、このメディアは、いくつかの利点を示しています大腸菌や細菌の副生成物及び栄養と毒性試験に利用することができます。 Eの使用このような研究において、大腸菌または他の細菌にはいくつかの欠点がある。例えば、細菌の増殖は、様々な条件下で変更することができますし、細菌は、結果の解釈を交絡、アッセイされている分子を代謝することができる。したがって、これらの研究を行うために定義された培地の開発は非常に有利である。

C.ものの虫はこれまでの研究15、C成長し、ワームの液体培地中で増殖させてきたエレガンス維持培地(CEMM)我々はOBSE何とは異なり、世代時間16内の個別の遅延を示しているmCeHR培地でRVE。私たちの主な目標は、C.を活用することであったヘムおよび金属代謝上の特定の重点を置いて栄養素の恒常性を研究するための 。このことを念頭に置いて、mCeHR、我々のグループによって生成された修正は、この目標を達成し、直接ウォームに、最終的には脊椎動物モデル系17、18にヘムの恒常性を維持するために必要な多数の遺伝子の同定につながった。再公式mCeHR-1メディアもPanagrellusのよみがえった、Oscheiusのmyriophila、およびCを含む他の線虫種のために利用することができますremanei。また、低金属配合物mCeHR-2およびmCeHR-3は、重金属毒性および要件12を調べる研究に利用することができる。

順化の前に、N2ワームがmCeHR培地中で約7〜10日の長い世代時間を示す。ワームは、継代培養されるように、この世代時間がOP5上に成長させたワームと同様の4日間まで低下0細菌。しかし、世代時間がもっともらしくあるための供給、移動、または特定の栄養所要量の欠陥の特定の変異型ワームのために長くなることがあります。

無菌液体培地を使用する場合は細心の注意を払った無菌技術が利用されていることが重要です。通常、抗生物質の使用が最小化され、ワー​​ムを培地に順応し、残留細菌が除去されるように、最終的には排除した。抗生物質は、最初はそれがワームの文化を圧倒することができ、残留細菌の増殖を防ぐように設立した培養物が無菌であることを確認する必要があります。漂白の2つの連続ラウンド後に、抗生物質のみをマスク無菌的にワームを成長させるために不可欠である貧弱な無菌技術抗生物質の継続的な使用法として、培養物から省略されている層流キャビネット内でこれらの技術を用いて、著者らは、無菌的にワームを成長させることができた汚染のない。 MEDの加えて、適切なストレージIAとコンポーネントは、ワームの維持および増殖に不可欠である。ワームは、成長率をチェックし、必須栄養素が枯渇しているようにdauer形成につながることが混雑を防ぐために、継代培養する必要があります。これは、ワームの密度が3,000ワーム/ミリリットル/ cm 2超えないこと保証することによって防止することができる。 C.の成長に新しく追加された研究者虫は無菌的に日々のワームをチェックし、毎週のワームをカウントすることによってこれを達成することができます。

C.研究者 、遺伝子発現およびタンパク質局在の可視化を可能にする蛍光標識マーカーを発現するトランスジェニックワームを生成することにより、その透明な特性を利用エレガンス 。染色体外配列やトランスジェニックと指摘上昇した遺伝子発現の問題を回避し、低コピー組込み体の生成のために許可されたバイオリスティックボンバードメントを利用して注入19を使用して生成。使用してトランスジェニックを生成する以前に、一つの欠点Cの微粒子衝撃虫は手順20に必要なUNC-119(ED3)ワームを大量に生成するために卵のプレートを調製するための要件でした。各変換が必要とされるワームの数のための20の卵のプレートを必要とした。無菌mCeHR液体培養を使用することで、より効率的な成長と、その後、爆撃のためのより多くのワームが可能になります。さらに、爆撃は、UNC-119(ED3)ワーム21を使用しないように、薬物選択と併せて使用することができる。

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Disclosures

著者らは、競合する経済的利益や利益相反がないことを宣言します。

Acknowledgments

この作品は、HealthGrants DK85035及びDK074797(IH)の国立研究所によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MgCl2•6H2O Sigma M-2393
Sodium citrate Sigma S-4641
Potassium citrate monohydrate Sigma P-1722
CuCl2•2H2O Fisher C455-500
MnCl2•4H2O Fisher M87-100
ZnCl2 Sigma Z-0152
Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O Sigma F-1018
CaCl2•2H2O Fisher C70-500
Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt Sigma A-1752
Cytidine 5 -phosphate Sigma C-1006
Guanosine 2' - and 3' -monophosphate Sigma G-8002
Uridine 5 -phosphate, disodium salt Sigma U-6375
Thymine Sigma T0376
N-Acetylglucosamine Sigma A3286
DL-Alanine Fisher S25648 
p-Aminobenzoic Acid Sigma A-9878
Biotin Sigma B-4639
Cyanocobalamine (B-12) Sigma V-2876
Folinate (Ca) Sigma F-7878
Niacin Sigma N-0761
Niacinamide Sigma N-3376
Pantetheine Sigma P-2125
Pantothenate (Ca) Sigma P-6292
Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) ACRCS 21663-0100
Pyridoxal 5'-phosphate Sigma P-3657
Pyridoxamine 2HCl Sigma P-9158
Pyridoxine HCl Sigma P-6280
Riboflavin 5-PO4(Na) Sigma R-7774
Thiamine HCl Sigma T-1270
DL-6,8-Thioctic Acid Sigma T-1395
KH2PO4 Sigma P-5379
Choline di-acid citrate Sigma C-2004
myo-Inositol Sigma I-5125
D-Glucose Sigma G-7520
Lactalbumin enzymatic hydrolysate Sigma L-9010
Brain Heart Infusion BD 211065
Hemin chloride Frontier Scientific H651-9
HEPES, sodium salt Sigma H-3784
Cholesterol J.T. Baker F676-05
MEM Non-Essential Amino Acids Invitrogen 11140-076
MEM Amino Acids Solution Invitrogen 11130-051
Nalidixic acid sodium salt Sigma N4382
Tetracycline Hydrochloride MP Biomedicals 2194542
Biolistic Delivery System BioRad 165-2257
Gold particles (Au Powder)   Ferro Electronic Material Systems 6420 2504, JZP01010KM
or
Gold Particles 1.0 μm BioRad  165-2263

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