본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

1Department of Neuroscience, UT Southwestern Medical Center, 2Department of Anatomy and Neurobiology, Washington University in St. Louis
Published 8/04/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

마우스 액세서리 후각 전구 (AOB)는 감각 코딩의 맥락에서 공부하기 어렵다. 여기, 우리는 AOB 신경 마우스 페로몬과 kairomones의 정보 처리에 대한 연구를 촉진, 자신의 주변 입력에 기능적으로 연결되어있는 한 생체 준비를 생산하는 절개를 보여줍니다.

Cite this Article

Copy Citation

Doyle, W. I., Hammen, G. F., Meeks, J. P. Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb. J. Vis. Exp. (90), e51813, doi:10.3791/51813 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

마우스 액세서리 후각 시스템 (AOS)는 비 휘발성 사회 냄새, 페로몬, 및 kairomones을 검출하는 전문적인 감각의 통로입니다. AOS 경로의 첫 번째 신경 회로는, 액세서리 후각 망울 (AOB)가, 같은 영토 침략과 짝짓기 같은 섹스의 전형적인 행동을 수립에 중요한 역할을했다. 이 작은 (<1mm 3) 회로는 동종의 분비물과 배설물에 화학 감각 신호의 성별, 긴장, 스트레스 등의 독특한 행동 상태를 구별 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 이 시스템의 컴팩트 한 조직이 동시에 회로의 많은 부분에서 기록에 대한 독특한 기회를 제공하는 동안, AOB에있는 감각 처리의 조사는 크게 인해 뇌의 실험적으로 불리한 위치에 도전 남아있다. 여기, 우리는 연결 떠나, 전방 마우스 두개골의 단일 반구 안에 그대로 AOB를 제거하는 다단계 해부을 보여모두 주변 vomeronasal 감각 뉴런 (하여 VSN) 지역 신경 회로 손상에 이온. 절차는 마취제의 부재 및 전기 생리 AOB 회로 소자로부터 광 기록을 용이하게 외관 검사를 지시하는 AOB 표면을 노출. AOB 다운 스트림 활동을 기록하는 동안하여 VSN을 수용하는 vomeronasal 기관 (VNO)로가는 캐뉼라를 삽입하면, 하나는 직접 사회 냄새와 페로몬에 주위를 노출 할 수 있습니다. 이 절차는 행동의 변화에​​ 페로몬에 노출을 연결하는 메커니즘에 대해 설명해 주실 수있는 AOS 정보 처리에 제어 문의 할 수 있습니다.

Introduction

포유류의 뇌에있는 감각 처리는 일반적으로 감각 입력에서 특정 기능을 추출하고, 각각의 다중 상호 연결의 연결 회로에 걸쳐있다. 감각 경로에서 초기 정보 처리는 정상적인 인식과 행동에 매우 중요합니다. 액세서리 후각 시스템 (AOS)에서 액세서리 후각 망울 (AOB)은 호르몬 균형, 2, 침략 3, 4 각성을 지시 다운 스트림 구조로 감각 주변을 연결하는 주요 신경 회로이다. 이와 같이,이 회로 내의 정보 처리 강하게 동물 행동의 변화에​​ 연계된다.

액세서리 후각 망울이 조밀 한 아래의 주요 후각 망울 (MOB)의 등 / 꼬리 / 후방 측면에서 생쥐와 쥐에 있으며 rhinal 부비동 혈관이. AOB는 vomeronasal 기관 (VNO)에있는 주변 vomeronasal 감각 뉴런 (하여 VSN)의 축삭에서 구 심성 신경 지배를받는, 스말그냥 부드러운 구개 위의 앞쪽 주둥이에있는 L 블라인드 종단 관. 이 축삭은 비강의 내측 경계에서 중격 조직의 섬세한 시트를 통과. 몇몇 연구는 마취 된 쥐 5-7 자유로이 탐험 동물 8을 사용하여 생체 내에서 (예 : 마우스 소변 등) AOS 냄새의 근원에 AOB 신경 반응을 탐색 할있다. 영웅은 () tracheotomies 비 휘발성 냄새를 소개하는 깊은 마취를 보장하고 액체 자극 5-7의 구토물이기도를 막는 것을 방지, 교감 자궁 경부 신경절 6 vomeronasal 기관 5,7 직접 삽관의 (b)의 자극에 참여 생체 내 연구에서 마취 및 (c) 전두엽 절제 유무에 관계없이 craniotomies는 AOB (6)에 전극의 발전을 허용합니다. 깨어 / 연구에게 마이크로 드라이브 8-10 참여 외과 주입을 행동. 결론적으로,이 실험 패러다임은 강력하지만 매우 어려운 종종 마취를 필요로합니다.

11-15로 신체 (생체) 외부 살아 감각 구조 및 다운 스트림 신경 회로를 유지하려고했습니다. VNO와 AOB 간의 연결은 동측 남아 있고, 정중선 중격 티슈는 단일 반구 산소화 superfusate에 노출 될 수 있기 때문에, 우리는 자신의 기능적 연결성을 유지하면서, 이러한 구조를 분리하는 이러한 단일 반구 생체 외 접근법을 개발하기 위해 노력하기 때문에. 우리는 최근에 이러한 목표 16 달성에 성공했다. (중간 선 소프트 중격 조직을 따라) 축삭과 AOB 모두 산소 인공 뇌척수를 (superfused에 액세스 할 수있는 600 μm의 기능 <비교적 얕은 때문에 6 시간 -이 준비 VNO과 AOB 살아 기능적 최소 4에 대한 연결을 모두 유지 ACSF). 이 VNO-AOB 생체 준비 얇은 캐 뉼러를 통해 VNO에 제어 자극의 도입을 허용하고,대상 전극 배치 및 / 또는 라이브 형광 현미경의 작은 AOB에 직접 시각적으로 액세스 할 수 있습니다. 하나는 마취제의 부재에서 이러한 회로를 공부하기를 원하는 경우,이 메소드는 장점이있다. 이 방법은 원심 연결을 끊고이므로, 잘 AOB 기능의 원심 변조에 문의에 적합하지 않다. VNO-AOB 생체 준비는 배우기 어렵지만, 한 번 달성이 강력한 감각 회로 회로 조직, 정보 처리 및 신경 가소성을 조사 할 때 신뢰할 수있는 플랫폼을 생산하고 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

모든 실험은 UT 요리 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행하였으며, 실험 동물에 의해 경험 한 스트레스, 불편과 고통을 최소화하도록 선택되었다.

1. 해부 상공 회의소

사용자 지정 해부 실 및 작은, 얇은 플라스틱 판자는 최상의 결과를 (그림 1)이 필요합니다. 이 프로토콜을 시도하기에 앞서 이러한 챔버를 구축 또는 구하십시오.

2. 해부 솔루션

  1. 단계 3.22-5.4에 사용하기 위해 표준 인공 뇌척수 (ACSF)의 1 L를 준비합니다. 염화나트륨 125 밀리미터,의 KCl 2.5 밀리미터, 염화칼슘 2 ㎜, MgCl2를 1 ㎜, 탄산 수소 나트륨 25 밀리미터,의 NaH 2 PO 4 1.25 밀리미터, 미오 이노시톨 3 mm의 나트륨 피루 베이트 2 ㎜, 아스 코르 빈산 나트륨 0.4 ㎜를 추가하고 25 포도당 mM의 발열 물질이없는 물 1 L에.
  2. 에 대한 초기 해부 ACSF (200 ㎖) 준비단계 3.3-3.22에 사용합니다. 표준 ACSF 200 ㎖를 타고 MgCl2를 수화물 0.366 g을 추가하여 9 개 mm로 MgCl2를 농도를 높입니다.
  3. 염화나트륨 115 밀리미터, KCl을 5 밀리미터, 염화칼슘, 2 ㎜, MgCl2를 2 ㎜, 탄산 수소 나트륨 25 밀리미터, HEPES 10 mM의를 포함하는 단계 4.11-5.4에 사용되는 정맥을 통해 VNO에 자극을 수행하는 표준 링어의 솔루션을 준비, 10 mM의 포도당.
  4. 버블 사용할 때까지 15 분의 최소 37 ° C의 물을 욕조에 95 % O 2, 5 % CO 2 가스 표준 ACSF 및 링거의 0.5 L의 0.8 L.
  5. 거품 95 % O 2 초기 해부 ACSF의 200 ㎖, 그것은 4 ° C를 15 ~ 20 분 동안 얼음에 5 % CO 2 가스에 도달 할 때까지

3. 기본 해부

  1. 해부 영역을 준비합니다. 세 35mm 페트리 접시를 놓고 산소 ACSF, 바로 가위, Adson 집게, # 11 두피를 해부 가위를 해부 곡선 잘린 가위,,엘 칼날과 손잡이와 얼음에 면도날.
  2. 산소 ACSF 4 ° C로 냉각 한 후, 깊이 2 ~ 5 ㎖의 Isothesia (99.9 % 이소 플루오 란)를 사용하여 건조 챔버에서 동물을 마취. 동물이 깊은 마취를 보장하기 위해 꼬리와 발 핀치 테스트를 수행합니다.
  3. 깊은 마취가 확인되면, 동물의 목을 벨 즉시 냉장 해부 ACSF 가득 페트리 접시에 머리를 놓습니다. 참고 : 사용하지 않을 때의 절차를 통해 시원한 곳에 보관하는 냉장 해부 ACSF의 조직을 담근다.
  4. 곡선 가위로 낮은 측면 (복부 인두, 아래 턱, 혀)를 제거합니다.
  5. Adson의 포셉 deglove (껍질) 표피와 두개골의 근육 첨부 파일을 사용하여. 껍질 주동이에 꼬리에서 두피 첨부 파일의 전용 사이트까지 앞니 이상이다. 곡선 가위를 사용하여 접속 지점에서 조직을 잘라. 집게로 잡고 눈을 제거하고 준비에서 떠나십시오. N귀 degloving 절차의 끝, 위턱 뼈없는 근육 첨부 파일 Adson의 집게를 사용하여 섬세한 코의 연골에 여분의 힘을 피하십시오. 참고 : 바로 가위로 두개골의 꼬리 부분에서 두피를 분리합니다.
  6. 가위 팁 (직전 rhinal 동을) 정면 뼈에 몇 mm가 될 때까지 똑바로 가위, 주동이에 꼬리에서 두개골의 중간 선을 삭감.
  7. Adson의 집게를 사용하여 두개골의 정수리와 정면 뼈를 제거합니다. 참고 : 정면 뼈의 조각은 종종 rhinal 동에 꼬리 코 뼈에 부착 된 상태로 유지됩니다. 후각 전구와 접촉하지 않도록주의하여이 조각을 제거합니다.
  8. 부비동에 전두엽 2mm의 꼬리를 통해 관상 컷을 한 다음 컷으로 뇌의 꼬리를 제거하기 위해 메스를 사용합니다. 완전히 후방 조직을 절단하는 메스 연락처 복부 두개골의 뼈 윤곽의 끝을 확인합니다. 참고 :이 수측면 후각 책자 또는 후각 전구에 기계적 스트레스를주지 않고 뇌의 대부분을 제거.
  9. 바로 가위로 복부 두개골의 노출 꼬리 부분을 제거합니다. 부비동과 남아있는 신경 조직을 남겨주세요.
  10. 바로 가위를 사용하여 두개골의 해부학 오른쪽 광대뼈 아치와 얼굴 근육을 제거
  11. 입의 지붕을 노출 (복부 측면을 위로) 주둥이를 뒤집으십시오.
  12. 잘라 앞니에 미각이 바로 꼬리 제거합니다. 입천장에 구개 병렬에서 메스 블레이드의 팁을 삽입하여이 작업을 수행 한 후 앞니를 향해 칼날을 이동합니다.
  13. Adson 집게와 미각의 해제 (주동이의) 가장자리를 잡고 꼬리 쪽 잡아 당겨 제거합니다.
  14. 두개골의 해부학 왼쪽에, 어금니 근처의 작은 난원에서 시작, 꼬리 쪽 팔 라틴 난원을 확장 메스 블레이드를 사용합니다. 메스 즐의 끝을 삽입하여이를 달성어금니 근처 무효로 해제하고 손목을 회전. 참고 : 블레이드의 팁만을 사용에 각별한주의를 기울이십시오 - 깊은 상처가 중격 조직을 손상시킬 수 있습니다.
  15. 해부학 왼쪽 vomeronasal 기관에 주동이를 시작, 앞니를 통해 구개 난원에서 잘라 메스 블레이드의 팁을 사용. 여러 점수 인하를 사용합니다. 너무 깊이 블레이드를 삽입하여 중격 조직과 vomeronasal 신경을 손상하지 마십시오.
  16. 그래서 지느러미 두개골가 직면하고있는 조직을 켠 다음 준비의 꼬리 가장자리에 수직으로 직선 면도날 (중간 선에 평행) 방향.
  17. 조직의 복부 에지에서 즉시 정중선의 왼쪽 면도날의 절삭 날을 터치. 날을 부드럽게 바위와 왼쪽 팔 라틴 난원 (단계 3.14에 도입 된 지역을 절감)를 따라 이동합니다.
  18. 조직의 지느러미 가장자리에서 즉시 정중선의 왼쪽 (1 mm 미만)에 면도기의 최첨단을 배치합니다.
  19. 유지블레이드가 조직의 전방을 향해 압력을 서서히 면도날 바위, 중앙선에 평행. 소공 질의 플레이트에 저항을 알 수 있습니다. 이 저항을 돌파 한 후 즉시 중지합니다. NOTE :이 시점에서, 우반구가 좌반구에서 느슨하게된다. 유일하게 남아있는 연결은 소공 질의 플레이트 등의 주둥이 앞쪽에 따라 반구 사이에있다.
  20. 장갑을 낀 손가락으로 꼬리 양쪽 근처를 잡고 부드럽게 옆으로와 전방을 회전하여 반구를 분리합니다. 참고 :이 단계는 특히 편향 또는 부서지기 쉬운 주둥이 (예를 들어, 이전 마우스)와 생쥐 실험 다양성의 원천입니다. 또한, 강한 저항이 결합 조직을 약화 등의 주둥이 (소공 질의 플레이트 앞쪽) 점수가 발생하는 경우, 서로 떨어져 반구를 회전하는 동안. 이렇게하는 동안, 중격 TI를 손상시킬 수있는, 깊이 메스를 삽입하지 세심한주의를 가지고ssue 및 vomeronasal 신경.
  21. 판자에 조직 접착제의 소량 (50 ~ 100 μL)을 적용하고 부드럽게 Adson의 집게를 사용하여 접착제에 오른쪽 반구의 측면 가장자리를 놓습니다. 판자에 조기 접착제의 중합 및 느슨한 부착을 방지하기 위해 종이 타월을 사용하여 준비의 측면에서 과잉 수분을 제거합니다. 참고 : 조직이 접착제에 배치 된 후 접착제의 중합 반응을 가속화하기 위해 샘플에 냉장 해부 ACSF 몇 방울을 적용합니다. 이 조직은 판자에 단단히 개최 유지되도록합니다.
  22. 보조 해부 실의 중간에 진공 그리스의 작은 금액 (3-5 mm 직경, 깊이 2mm)를 놓고 단단히 그리스에 대한 조직 맞은 판자의면을 배치합니다. 즉시 미세 해부 영역에 전송하고 산소 표준 ACSF와 관류를 시작, 냉장 해부 ACSF으로 해부 챔버를 입력합니다. 후각 망울이 직접 있도록 판자의 방향을갓 산소 표준 ACSF의 스트림.

4. 보조 해부

  1. 미세 집게를 사용하여 준비에서 눈에 보이는 반대편 (왼쪽) 후각 망울 또는 대뇌 피질의 조직을 제거합니다. (세미 무딘 점을 형성하는) 미세 집게를 함께 꼬집어하고 중간 선 부근의 지느러미와 조직의 꼬리 부분에 배치합니다. 부드럽게 멀리 전방 움직임에 천천히 오른쪽 뇌의 조직을 박리, 중간 선을 따라 슬쩍 집게를 실행합니다. 반대측의 후각 망울의 조직을 포함하여 반대측의 조직을 모두 제거합니다. AOB 또는 vomeronasal 신경에 손상을 줄 수있는 조직을 찌르지 않도록 세심한주의를 기울입니다.
  2. 후각 망울의 등 / 내측 표면을 따라 흰색 뇌경막을 준수하십시오. 미세 집게 두 쌍의 경질의 백인 부분에 잡고 후각 망울의 등 / 꼬리 가장자리를 따라이 경막 눈물 멀리 그 시점에서 그들을 잡아 당깁니다. 경질 단단히입니다후각 전구를 감싸, 그것을 제거하는 동안 쉽게 자체 조직을 통해 슬라이스 할 수 있습니다. 후각 망울과 AOB 자체의 내측 표면의 손상을 방지. 참고 : 경질이 시점에서 쉽게 찢어 저항하는 경우, 분리를 용이하게하기 좋은 봄 팁 해부 가위로 작은 상처를 소개합니다.
  3. 차분히 기본 후각 전구를 손상시키지 않고 미세 집게와 정면 외피를 벗겨. AOB에 바로 꼬리 반투명 순으로 나타나는 혈관의 컬렉션을 준수하십시오. 전기 생리학 실험에서 전극의 침투를 용이하게하기 위해 미세 집게로이 그물을 제거합니다. 그것은 정면 피질 후퇴하는 동안 AOB에서 분리로 집게로 그물을 잡고 AOB을 만지지 않도록 조심하면서, 꼬리 쪽과 내측으로 잡아 당겨 제거합니다. 전두엽 피질의 후각 전구에서 분리되면, AOB에 복부와 뒤 집게로 절단하여 제거합니다. 참고 : 예를 가지고그것이 너무 크게 할 경우 그물 제거와 함께 치료를 트림에 대한 사구체 층이 손상 될 수 있습니다.
  4. 노출 반대편 비강에서, 미세 집게를 사용하여 남아있는 반대측 중격 조직 (혈관을 포함하는 얇은 황색 시트)를 제거합니다. (중격 뼈 근처) 꼬리 / 등의 지역에서 조직을 파악하고 전방 측을 향해 조직을 리프트 / 당깁니다. 참고 : 반대측 중격 조직이 실수로 hemisection 단계 (단계 3.20) 동안 제거 할 수 있습니다. 이러한 경우에, 흰색, 무 혈관 중격 연골과 약간 투명, 혈관 중격 뼈를 관찰합니다. 이 경우, 스텝 8.8은 생략 될 수있다.
  5. 조심스럽게 중격 연골과 VNO "날개"(두 VNOs의 지느러미 가장자리를 따라 실행 뼈 조직의 얇은 조각 사이의 미세 집게의 단일 지점을 실행하여 반대측 VNO를 제거합니다.
    1. 연골의 날개 분리 후, 배쪽으로 집게의 끝으로 이동중간 선 부근 반대측 VNO에. 집게로 잡고 멀리 들어 올려 제거 할 수 있도록, 그것을 풀어야 반대측 VNO의 주동이 / 꼬리 축을 따라 여러 위치에서이 단계를 반복합니다.
  6. 미세 집게와 꼬리 / 복부 가장자리에 상처를 (그것이 중격 뼈의 복부 가장자리를 따라 흰색 무혈성 지구 실행에 좁은 곳)함으로써 중격 연골을 제거하기 위해 준비합니다.
  7. 반 무딘 점을 만들기 위해 함께 미세 집게를 집어 중격 연골을 제거합니다. 단계 4.6에서 만든 컷을 확인, 해당 컷에 (측면) 뒤에 슬쩍 집게를 삽입 한 다음 천천히 중격 조직에서와 rostrally 진행 연골을 들어 올립니다. 참고 : 기본 중격 조직을 방해하지 마십시오. 연골 들어 올릴으로 인해 연골에 느슨하게 유착에 중격 조직 스트레칭의 기본 시트를 관찰합니다. 느슨한의 사이트를 따라 슬쩍 미세 집게의 정기 온화하고 안정된 움직임dhesion 크게 두 구조의 성공적인 분리를 용이하게 할 수있다.
  8. 중격 뼈를 제거하기 위해 구부러진 팁 # 3 포셉 한 쌍을 사용합니다. 각도 중격 뼈 접근 거의 중격 뼈의 평면에 평행. 중격 조직과 중격 뼈 사이의 곡선 가지를 삽입합니다. 집게와 뼈를 잡고 부드럽게 소공 질의 플레이트 근처에 균열 때까지 앞뒤로 뼈를 이동합니다. NOTE : 일부 경우에, 중격 뼈 소공 질의 플레이트 근처 속보 레지스트 것이다. 이 경우, 부드럽게 단지 4.8 단계를 반복 한 다음, 소공 질의 판에 전방 지느러미 / 복부 축을 따라 중격 골을 득점하는 미세 집게를 사용합니다.
  9. 입구에 미세 집게 일쌍으로 곤란 및 미세 집게의 또 다른 쌍의 rostrally 당겨 단지 VNO에 주동이의 흰색 연골을 제거합니다.
  10. 빠른 관류 장치에 폴리이 미드 정맥을 연결하고 폴리이 미드 캐 뉼러를 통해 링거액 (0.1 ~ 0.3 ㎖ / 분)의 흐름을 시작합니다.NOTE : 라인, 작은 양의 유량계 측정 유량. 컴퓨터 제어 공기 부양 스위칭 장치의 사용은 자극시 유량의 변화를 줄일 수 있습니다. 응답을 자극 특정 보장하기 위해 모의 자극 (링거액을 제어)에 대한 응답으로 자극을 테스트하는 신경 반응을 비교.
  11. VNO 입구 정맥 평행의 방향. 캐 뉼러가 만족 VNO 입구 평행하면 출구 압력이 VNO이 원인으로, 혈관의 피난 선도 "팽창"본다. 바로이 VNO 개방 평행하게되도록 정맥 상수의 각도를 유지하는 VNO에 캐 뉼러를 삽입합니다. 참고 : 플라스틱 판자에 대한 미세 집게 일쌍과 정맥을 잡고 약간 위쪽 각도로 정맥의 끝을 미세 집게의 또 다른 쌍을 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 하나의 실수 VNO 뒤에 뉼러를 배치하는 경우, 유출은 VNO 혈관에게 발생할 수대피, 적절한 삽관을 수행 한 인상을 선도. 적절한 위치는 링거 용액에 염료를 혼입에 의해 확인 될 수있다. 정맥이 제대로 배치되면, 염료 만해야 VNO 입구를 통해 종료합니다. 또한, 하나는 정맥이 VNO의 반투명 중간 부분을 통해 쉽게 볼 수 있음을 확인하여 적절한 위치를 확인할 수 있습니다.
  12. AOB가 VNO에서 정맥을 제거하지 않도록주의하고, 표준 ACSF의 직접 교류가 될 때까지 천천히 플라스틱 판자를 이동합니다. 해부가 완료되고 생리 기능의 평가는 즉시 시작할 수 있습니다. 5 단계는 간단히 이러한 평가를 만들기위한 한 가지 방법에 대해 설명합니다.

5. 평가

  1. 세포 증폭기 및 오실로스코프에 연결된 2-4 MΩ 붕규산 유리 미세 전극으로 AOB의 표면을 침투.
  2. 천천히에서 100 ~ 200 ㎛의 깊이에 미세 전극을 사전50 ㎛ / 분의 속도로 표면. 참고 :이 조직의 깊이에, 하나는 미세 전압의 날카로운, 짧은 (~ 1 ~ 2 밀리 초) 편향에 의해 예시 가끔 자발적 활동 전위 파형을 발생합니다.
  3. 활동 전위 파형을 발생하면, 미세 전극을 발전 정지.
  4. 관찰 및 / 또는 VSN 활성의 공지 된 활성화 제 (예를 들어, 50 mM의 KCl을 함유 링거액)로 제어 링거에서 자극 전달 솔루션을 바꾸면서 활동 전위 속도를 기록한다. 해부에 성공하면, 활동 전위 속도 또는 지역 현장 잠재력 자극에 의​​존하는 변화는 관찰 할 수있다. 참고 : 모든 AOB 뉴런 (50 밀리미터의 KCl을 포함하는 링거액 등의) 발사 속도의 증가에 따라 모든 자극에 응답합니다. 발사 속도의 자극에 의​​존 감소는 또한 기능적인 연결 및 성공적인 절개를 나타냅니다. 두 개 이상의 뉴런가 발생하는 경우에 그VNO의 자극에 응답하지 않는, 또는 어떤 활동 전위가 여러 전극 침투 후 관찰되지 않은 경우,이 실패 절개를 제안합니다. 이 경우, 새로운 절개는 3 단계에서 시작될 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

이러한 준비와 성공을 달성하는 것은 광범위한 연습이 필요하고, 실패 할 수있는 몇 가지 단계가 있습니다. 하나는 성공을 달성하기 전에 많은 시도를 필요로 할 것으로 예상해야한다. 사용자 지정 해부 실이 프로토콜의 성공적인 완료를 위해 필요하며, 이전에 절개의 이후 단계를 시작하기 얻어야한다. 도 1에 제시된 챔버 설계는이 목적을 위해 충분하며, 최소의 가공 요구에 비교적 저렴한 플라스틱으로 만들어 질 수있다. 하나는 챔버를 생산하는 능력이 부족한 경우, 로컬 또는 온라인 가공 회사에서 협의 될 수 있으며 사용료 챔버를 구성 할 수있다.

준비를 통해 변화의 큰 소스는 실험 동물의 두개골과 주둥이의 뼈의 밀도와 취성이다. hemisection 단계 (단계 3.14-3.20) 동안, 목표 동측 중격 조직 함께 둘 vomeronasal 기관을 분리하며동측 액세서리 후각 망울. 그러나 반대측 반구에 부착 남아 중격 티슈위한 주둥이의 등쪽 뼈 특히 근처 어태치먼트 포인트.이 효과적이고 비효율적 hemisection의 일례를 보여준다 드물지 않다.

다른 일반적인 해부 오류는 vomeronasal 신경의 축삭이 vomeronasal 기관 근처 중격 조직 (그림 3a3b) 또는 AOB 근처 (그림 3C3D)으로 손상 될 수있는 동안 미세 해부 동안 발생한다. 이들과 유사한 이벤트를 사용할 수 없게 준비를 렌더링하여 VSN과 AOB 사이의 불완전한 연결 발생합니다.

준비의 성공에 마지막 장애물은 VNO 삽관 단계 (4.11 단계)입니다. VNO 정맥의 적절한 배치는 즉시 추방을 일으키는 원인이되는 VNO 루멘의 가압가 발생합니다 vomeronasal 펌프에서 잔여 혈액. 정맥은 비교적 투명 vomeronasal 상피 아래에 명확하게 볼 수 있어야하고, 정맥의 모양은 VNO 안쪽 길이를 따라 균일해야한다. 절차가 성공적으로 완료되면, 하나는 VSN의 취기 알려진 소스 (그림 4)와 VNO 자극에 대한 응답 등의 신경 활동의 하나의 단위 전기 생리학 녹음 등의 생리 학적 분석을 사용하여 기능적인 연결을 확인할 수 있습니다.

그림 1
그림 1.) 설계 단계 3.22-5.4에 사용되는 사용자 지정 해부 실의 도면. 참고 :. 작은 구멍이 프로토콜에 사용되는 해부 실의 원하는 B) 예제 사진과 솔루션 및 가스 처리 입구와 출구를 수용 할 수 드릴 수 있습니다. m/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg "대상 ="_blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. A, B) 성공 (대표 이미지) 및 hemisection 단계 (3.20 단계) 후 실패 (B) 준비. VNO, 중격 조직, 후각 전구 (있는 OB)는 모든 동측 반구 (이 경우, 오른쪽 (아래) 반구에서 유지되어야한다. 코 비갑개가 동측 반구에서 볼 경우, 해부 실패했습니다. 마크가 똑딱 간격 1mm가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

d/51813/51813fig3highres.jpg "폭 ="600 "/>
그림 3. A, B) VNO과 AOB 간 손상 및 손상된 중격 조직의 대표 이미지. B에서 해부 집게는 VN 축삭 책자. C, D) 비 손상 및 손상 AOBs를 손상 조직과 부주의 한 접촉을했다. D에서 동측 OB 주변 경질의 제거는 중간 AOB 근처 조직의 눈에 보이는 덩어리를 일으키는 원인이되는 AOB 근처 vomeronasal 신경을 절단하는 결과. 스케일 바의 길이는 1mm입니다.

그림 4
성공적인 준비 AOB 신경 세포 (세포 하나의 단위 기록)에서 기록 된 활동 전위의 그림 4.) 예 래스터 플롯. 블랙 쇼 추적 제어 링거액은 5 초 (회색 B의 VNO에 전달되었을 때 발포 비율에 변화 없음황소). 빨간색 표시의 흔적 BALB / C 마우스 여성의 소변 VNO 자극에 동일한 신경 세포의 반응은 링거 식염수. B에서 같은 응답) 요정 자극 시간 막대 그래프로 100 배 희석. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

이 프로토콜에서 설명하는 VNO-AOB 생체 준비는 생체 내 5-7 급성 라이브 슬라이스 AOB 기능의 17 실험에서 마취 할 수있는 유용한 대안이다. 또한 전기 생리학 및 광학 레코딩을위한 회로 소자를 노출 급성 AOB 슬라이스 실험과는 달리,이 혼합물은 모든 감각 구 심성과 내 AOB의 연결을 유지합니다. 이 또한 생체 방법에 마취라고 할 수 있지만, 마취제의 존재는 반드시 이것과 다른 후각 회로 (18) 정보 처리를 위해 매우 중요합니다 신경 기능, 즉 흥분성 / 억제의 균형을 변경합니다. 제제는 마취제의 사용을 피할 수 있기 때문에, 그리고 AOB 표면이 완전히 superfusate에 노출되기 때문에, 그것은 로컬 신경 처리에 약리 문의 의무이다.

이 준비의 몇 가지 제한 사항이 물론 있습니다. EV가깊은 AOB 층, 많은 억제 과립 세포 16를 수용하는 세포 내부의 층, 즉 깊은 부분의 점진적인 퇴행 idence. 또한, 원심 입력은 AOB의 활동에 적극적으로 참여를 제거, 절개 중에 절단됩니다. VNO의 삽관은 vomeronasal 펌프의 정상 동작 유무를 무시하고 VNO 루멘에 존재하는 내인성 유체를 멀리 플러시합니다.

이 방법으로 성공을 달성하는 데 중요한 단계는 섬세한 hemisection (3.20 단계) 및 VNO 삽관 (단계 4.11)이다. 하나는 안정적으로 기능적으로 연결된 생체 준비를 생산하기 위해 광범위한 연습을 필요로 할 것으로 예상 할 수 있습니다. 여기에 이용되는 보조 해부 챔버 (예 : 묽은 소변 등) 마우스 페로몬의 소스와 VNO의 자극 중 하나의 전극 기록을 사용하여 기능적인 연결을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 보조 해부 챔버의 13, 15 수정이 B 수전자 준비는 다 광자 이미징 같은 다른 목적에 적합한 각도로 회전 할 수 있도록 해당했다.

생활 AOB 공부에 많은 기술적 인 장애물은 오랫동안 사회 냄새와 페로몬 감각 처리에 대한 우리의 이해에 장벽을 제기했다. 이 해부 프로토콜이 감각 통로의 초기 신경 구성 요소를 멀리 해부함으로써, 하나는 이러한 어려운 연구 회로 실험 액세스 할 수 있습니다. 우리는 vomeronasal 감각 처리 (19)과 감각 매핑 (Hammen 등., 게시되지 않은)에 대한 자세한 문의는이 혼합물을 사용했다. 이 기술은 AOB에있는 감각 처리에 미래 연구 조직 (예를 들면, 다 광자 이미징 및 optogenetics)에 광 액세스를 필요로 특히 유용 할 것입니다. 이 방법의 장점은 생체 내 접근 방법들을 보완, 그리고 신경 메커니즘을 조사하는 우리의 툴킷을 향상 vomeronasal 매개 이렇게사회적 및 생식 행동.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 할 관심의 큰 충돌이 없습니다.

Acknowledgements

, F30 DC011673 (GFH : NINDS, NIH)과 유타 남서부 시작 기금 (JPM) :이 연구는 R00 DC011780 (NINDS, NIH JPM)에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight Scissors Fine Science Tools 14002-14
Fine Scissors-Straight Fine Science Tools 14060-10
Fine Scissors-Curved Fine Science Tools 14061-10
Adson Forceps Fine Science Tools 11006-12
#3 Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
#11 Scalpel Blades Fisher Scientific 3120030
Straight Carbon Steel Razor Blades Fisher Scientific 12-640
35 mm Petri Dish Fisher Scientific 08-772-21
Dissection Chamber Custom  N/A See Figure 1
Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm Custom  N/A
Dow Corning Silicon Vacuum grease Fisher Scientific 146355D
#5 Forceps, Student Fine Science Tools 91150-20
#5 Forceps, Biologie Tip Fine Science Tools 11295-10
#5 Forceps, Student Fine Science Tools 91150-20
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08
1/16" Male Luer Cole-Parmer EW-45505-00
1/16" Tubing Fisher Scientific 14-171-129
Two ton epoxy Grainger 5E157
ValveBank Pressurized Perfusion Kit AutoMate Scientific 09-16
ValveLink digital/manual controller AutoMate Scientific 01-18
NaCl Sigma-Aldrich various
KCl Sigma-Aldrich various
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich various
MgCl2 hexahydrate Sigma-Aldrich various
NaHCO3 Sigma-Aldrich various
NaH2PO4 Sigma-Aldrich various
myo-inositol Sigma-Aldrich various
Na-pyruvate Sigma-Aldrich various
Na-ascorbate Sigma-Aldrich various
HEPES buffer Sigma-Aldrich various
Glucose Sigma-Aldrich various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruce, H. M. An exteroceptive block to pregnancy in the mouse. Nature. 184, 105 (1959).
  2. Bellringer, J. F., Pratt, H. P., Keverne, E. B. Involvement of the vomeronasal organ and prolactin in pheromonal induction of delayed implantation in mice. J Reprod Fertil. 59, 223-228 (1980).
  3. Bean, N. J. Modulation of agonistic behavior by the dual olfactory system in male mice. Physiol Behav. 29, 433-437 (1982).
  4. Meredith, M. Vomeronasal organ removal before sexual experience impairs male hamster mating behavior. Physiol Behav. 36, 737-743 (1986).
  5. Hendrickson, R. C., Krauthamer, S., Essenberg, J. M., Holy, T. E. Inhibition shapes sex selectivity in the mouse accessory olfactory bulb. J Neurosci. 28, 12523-12534 (2008).
  6. Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2010).
  7. Tolokh, I. I., Fu, X., Holy, T. E. Reliable sex and strain discrimination in the mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 13903-13913 (2013).
  8. Luo, M., Fee, M. S., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the accessory olfactory bulb of behaving mice. Science. 299, 1196-1201 (2003).
  9. Binns, K. E., Brennan, P. A. Changes in electrophysiological activity in the accessory olfactory bulb and medial amygdala associated with mate recognition in mice. Eur J Neurosci. 21, 2529-2537 (2005).
  10. Leszkowicz, E., et al. Noradrenaline-induced enhancement of oscillatory local field potentials in the mouse accessory olfactory bulb does not depend on disinhibition of mitral cells. Eur J Neurosci. 35, 1433-1445 (2012).
  11. Ames, A. 3r, Gurian, B. S. Electrical Recordings from Isolated Mammalian Retina Mounted as a Membrane. Arch Ophthalmol. 70, 837-841 (1963).
  12. Flock, A. F., Strelioff, D. Studies on hair cells in isolated coils from the guinea pig cochlea. Hear Res. 15, 11-18 (1984).
  13. Woodbury, C. J., Ritter, A. M., Koerber, H. R. Central anatomy of individual rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors innervating the 'hairy' skin of newborn mice: early maturation of hair follicle afferents. J Comp Neurol. 436, 304-323 (2001).
  14. Llinas, R., Muhlethaler, M. An electrophysiological study of the in vitro, perfused brain stem-cerebellum of adult guinea-pig. The Journal of physiology. 404, 215-240 (1988).
  15. Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
  16. Meeks, J. P., Holy, T. E. An ex vivo preparation of the intact mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. J Neurosci Methods. 177, 440-447 (2009).
  17. Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
  18. Kato, H. K., Chu, M. W., Isaacson, J. S., Komiyama, T. Dynamic sensory representations in the olfactory bulb: modulation by wakefulness and experience. 76, 962-975 (2012).
  19. Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system. Nature. 13, 723-730 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats