Détection de l'épissage alternatif durant la transition épithéliale-mésenchymateuse

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Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition. J. Vis. Exp. (92), e51845, doi:10.3791/51845 (2014).

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Abstract

Introduction

La transition épithéliale-mésenchymateuse (TEM) est un programme de développement qui anime la morphogenèse d'organes et le remodelage tissulaire cours de l'embryogenèse. Lorsque anormalement activée, EMT favorise la métastase de la tumeur et des organes fibrose 1,2. Études convaincantes ont décrit l'importance de la régulation de la transcription au cours du processus de EMT, définie par plusieurs facteurs de transcription, tels que Twist, Snail, et ZEB, qui répriment l'expression de la adhérentes protéine de jonction E-cadhérine, entraînant la perte d'un cobble- pierre comme la morphologie et le gain d'un phénotype mésenchymateux fusiforme 3-8 épithéliale. Des études récentes à travers l'analyse de l'ensemble du génome d'ARN ont révélé qu'il existe un groupe de gènes dont l'épissage modèles sont associés soit aux phénotypes épithéliales ou mésenchymateuses 9,10. Le travail de notre laboratoire relié fonctionnellement épissage alternatif et EMT. En étudiant la surface de la molécule d'adhésion cellulaire CD44, CD44, nous avons démontré que alternative épissage est étroitement régulée pendant EMT, et plus important encore, que CD44 épissure isoforme de commutation de causalité contribue à EMT 11.

L'épissage alternatif est un modèle répandu et conservé de la régulation des gènes, car jusqu'à 95% des gènes multi-exons humains sont épissage alternatif 12-14. En générant de multiples produits de protéines à partir d'un seul gène, épissage alternatif constitue un mécanisme essentiel de la diversité des protéines, en ajoutant une autre couche de complexité au génome humain. En tant que tel, la dérégulation de l'épissage alternatif pourrait conduire à des effets biologiques profonds causent des maladies humaines. En effet, l'épissage alternatif aberrant dans les maladies a été documentée depuis plus d'une décennie 15-25, y compris les conclusions récentes mutations dans les gènes codant pour les machines de splicéosome sont généralement trouvés dans les syndromes myélodysplasiques 26-28. Par conséquent, le développement de méthodes fiables pour la détection de la i alternativement épissésoforms est d'une grande importance dans l'étude de divers processus biologiques, y compris EMT.

Ici, nous fournissons un protocole pour détecter des changements dans l'épissage alternatif en utilisant un modèle d'EMT inductible. Les méthodes de conception d'amorces de PCR et la détection des isoformes d'épissage sont adaptés non seulement pour l'étude de l'épissage alternatif pendant EMT, mais également pour l'étude de l'épissage alternatif dans d'autres processus biologiques. Enquête épissage alternatif pendant EMT est impératif afin de mieux comprendre les mécanismes de EMT et les métastases de la tumeur, facilitant ainsi le développement de stratégies efficaces pour traiter les métastases du cancer.

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Protocol

1. culture cellulaire de EMT induction

Remarque: EMT peut être induite par un traitement de TGFß ou l'expression ectopique de facteurs de transcription Twist, Snail, ou ZEB1 / 2 dans les cellules épithéliales. Décrit dans le présent protocole est un système d'EMT inductible par l'expression de la protéine de fusion Twist-ER dans les cellules épithéliales immortalisées humaines mammaires (HMLE / Twist-ER, un don du Dr J Yang, UCSD) 9,11,29. Dès le 4-hydroxytamoxifène (TAM) de traitement, la protéine de fusion Twist-ER translocation vers le noyau pour diriger la transcription et les résultats dans une transition EMT complet dans 12-14 jours 9,11,29. D'autres systèmes inductibles EMT, comme HMLE / Snail-ER, HMLE / TGFß, et MCF10A / TGFß, peuvent être trouvées dans nos précédentes publications 11,30.

  1. Maintenir des cellules HMLE / Twist-ER mammaire dans un milieu de croissance de cellules epitheliales sans sérum (MEGM) dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. Passage des cellules tous les 2-3 jours quand ils atteignent 80% de confluence. Incuber les cellules avec 0,15% de trypsine à 37 ° C pendant 5-10 min, puis inactiver la trypsine avec du sérum de veau à 5% / DMEM. Isoler les cellules et les remettre en suspension dans MEGM. cellules de plaque dans une nouvelle boîte de culture tissulaire dans un rapport de 1 à 4.
  2. Dissoudre TAM dans l'éthanol pour obtenir une solution à 200 pM. Protéger TAM de la lumière et conserver à -20 ° C. Avant utilisation, fraîchement ajouter TAM dans MEGM médias à une dilution de 1: 10 000 pour obtenir une concentration finale de 20 nM TAM.
  3. Pour l'induction de l'EMT, l'assiette des cellules de 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER dans une boîte de 10 cm de culture de tissu en double exemplaire. cellules de culture avec 20 nM médias TAM contenant MEGM.
  4. Plate cellules de 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER dans un plat de 10 cm en double exemplaire et traiter les cellules avec 0,01% d'éthanol comme un contrôle non-TAM traité.
  5. Deux jours après l'incubation, prendre des photos sous un microscope optique à un grossissement de 10X pour enregistrer les changements morphologiques des cellules.
  6. Aspirer le milieu d'un plat de contrôle ou TAM-traitécellules. Laver les cellules avec du PBS froid et les cellules de la récolte par la mise au rebut de la moitié de la plaque dans du tampon de lyse d'ARN pour l'isolement d'ARN et l'autre moitié dans du tampon RIPA pour l'analyse des protéines.
  7. cellules de passage de la commande ou de la vaisselle TAM-traités par 1,6 x 10 6 cellules re-placage dans un plat de 10 cm en double exemplaire. Traiter en continu les cellules avec 20 nM TAM ou véhicule.
  8. Répéter les étapes 5 à 7, une fois tous les deux jours jusqu'au jour 14, moment auquel les cellules Twist-ER TAM-traités présentent une mésenchymateuses morphologie fusiforme, tandis que les cellules témoins traités avec le véhicule à maintenir la morphologie epitheliale pavé analogue.

2 Caractérisation des EMT

Remarque: A la fin de l'EMT est indiqué par: (1) Téléphones changements morphologiques d'une morphologie épithéliale pavés comme à un aspect fusiforme fibroblastique-comme; (2) La perte de la E-cadhérine localisation au niveau des jonctions cellule-cellule; et (3) L'expression de marqueurs de commutation EMT, définie par la pertede marqueurs et de gain de marqueurs mésenchymateuses épithéliales.

Téléphones changements morphologiques sont capturés par microscope optique à un grossissement de 10X au cours du temps des EMT induction, décrit dans la section 1 de détection immuno-fluorescence de la E-cadhérine à cellules jonctions est décrit dans cette section. L'expression des marqueurs de TEM est détectée par immuno-empreinte. Marqueurs épithéliaux courants sont la E-cadhérine, γ-caténine, et occludine, et des marqueurs mésenchymateuses incluent la fibronectine, la N-cadhérine et la vimentine. Les procédures générales de immunoblot sont décrits à la section 4.

  1. Au jour 12 du traitement TAM, graines 1 x 10 5 cellules sur une lamelle de verre de 12 mm circulaire placés dans un puits d'une plaque de 24 puits.
  2. 48 heures après l'ensemencement des cellules, moyen d'aspiration et de lavage avec préchauffé PBS.
  3. Fixer les cellules avec préchauffé paraformaldéhyde à 4% pendant 15 min.
  4. Laver les cellules trois fois avec du PBS.
  5. Incuber les cellules avec 0,2% de Triton X-100 dans du PBS pendant 15minutes à température ambiante.
  6. Laver les cellules trois fois avec du PBS.
  7. Incuber les cellules dans 5% de BSA / PBS pendant 1 heure à température ambiante pour bloquer la liaison non spécifique.
  8. Incuber les cellules avec l'anticorps primaire E-cadhérine à une dilution 1:50 de BSA à 1% / PBS dans une chambre humidifiée O / N à 4 ° C. REMARQUE: La gamme de dilution d'anticorps primaire est normalement comprise entre 1:50 et 1: 200, et la dilution optimale pour chaque anticorps doit être déterminée expérimentalement.
  9. Décanter l'anticorps primaire et laver les cellules trois fois avec du PBS.
  10. Incuber les cellules avec un anticorps secondaire marqué par fluorescence à une dilution de 1: 500 à 1 heure à température ambiante. De cette étape, protéger les cellules de la lumière.
  11. Décanter l'anticorps secondaire et laver trois fois avec du PBS.
  12. cellules de taches avec 0,1-1 g / ml DAPI ou Hoechst pendant 10 min.
  13. Rincer les cellules avec du PBS à trois reprises.
  14. Mont lamelles de avec une goutte de milieu de montage, et des lamelles d'étanchéité avec du vernis à ongles.
  15. Respecter les cellules et prendreimages sous un microscope à fluorescence 63X.

La coloration avec des anticorps supplémentaires peut être effectuée pour confirmer le phénotype de l'EMT. Par exemple, la N-cadhérine et α-actine de muscle lisse peuvent être colorées pour un phénotype 29,31,32 mésenchymateuses. La réorganisation de la structure du cytosquelette peut être contrôlée par coloration des cellules avec de la phalloïdine pour 11 F-actine. En outre, les dosages de la motilité cellulaire et la résistance à la mort cellulaire peuvent être effectuées pour étudier les propriétés d'EMT 11.

3 Détection de Splice isoformes en utilisant des tests qRT-PCR

  1. Conception Primer
    REMARQUE: paires d'amorces doivent être soigneusement conçues pour amplifier isoformes d'épissage distinctes. Le saut d'exon, le cas de l'épissage alternatif le plus fréquemment observé, est montrée ici comme un exemple pour illustrer la stratégie de conception d'amorce. Figure 1A représente un quatre exon pré-ARNm, avec le troisième exon comme un exon variable. L'inclusion de l'exon 3 résultats dansla production d'une isoforme d'épissage plus, alors saut de l'exon 3 génère une épissure isoforme plus courte. Les amorces doivent être conçues pour distinguer l'isoforme de l'exon 3 et l'exon-inclus-3-isoforme sautée, et à détecter la transcription total de cet ARNm.
    1. Pour la détection de l'exon inclusion, de concevoir avec soin une amorce sens à l'intérieur de l'exon 3 de variable, et une amorce anti-sens à l'intérieur de l'exon constitutive proximité 4, permettant l'amplification spécifique de l'isoforme de l'exon-inclus variable. Veillez à ne pas concevoir deux amorces sens et antisens dans le même exon variable afin d'éviter les produits de PCR amplifiés à partir d'ADN génomique ou pré-ARNm.
    2. Pour amplifier spécifiquement le saut d'exon événements, conception une des amorces couvrant la jonction de l'exon 2 et constitutive exon 4 qui seraient autrement détruits quand l'exon 3 variables est inclus. Concevoir l'autre amorce à l'intérieur du exon constitutive 4 En tant que tel, les produits de PCR sont générés uniquement lorsque l'exon 3 variables est non compris leed et constitutif exon 2 et l'exon 4 sont ensuite réunis.
    3. Pour détecter des transcrits totaux de la génétique, de concevoir les amorces dans les deux exons 1 et 2 constitutifs Ainsi, les produits PCR sont amplifiés à partir de toutes les isoformes.
    4. S'assurer que la température de fusion (Tm) des amorces pour l'ensemble est d'environ 55 ° C, la longueur de chaque amorce est d'environ 18 à 22 nucléotides, et la taille des produits de PCR se situe entre 80 et 150 paires de bases.
  2. extraction de l'ARN: l'ARN extrait à l'aide d'un kit totale d'isolement d'ARN (voir le tableau des matériaux).
    1. Prélever des cellules dans 350 tampon de lyse ARN ul.
    2. Ajouter 350 ul de 70% d'éthanol au lysat et bien mélanger.
    3. Transférer l'échantillon dans la colonne de purification de l'ARN.
    4. Centrifugeuse à 10.000 g pendant 1 min et le rejet accréditives.
    5. Laver la colonne une fois avec 500 pi de lavage de l'ARN tampon I et deux fois avec de l'ARN tampon de lavage II.
    6. Retirer le tampon de lavage d'ARN résiduelII à partir de la colonne par une centrifugation à vitesse maximale pendant deux minutes.
    7. Transférer la colonne dans un nouveau tube de 1,5 ml, ajouter de l'eau sans nucléase 50 ul au centre de la matrice de la colonne et éluer l'ARN par centrifugation à la vitesse maximale.
  3. Synthèse de premier brin d'ADNc
    1. Déterminer la concentration et de la qualité de l'ARN par une mesure d'absorption UV. Remarque: Bonne qualité de l'ARN devrait avoir une 260 nm / 280 nm rapport d'absorbance d'environ 2,0.
    2. Mise en place de la transcriptase inverse (RT) des réactions qui contiennent 250 ARN ng totale, 0,05 ug d'amorces hexamères aléatoires, 50 pmol de MgCl2, 10 pmol de dNTP, un tampon de 2 pi de 5 x GoScript, et 1 pl RT enzyme dans un volume final de 20 ul.
    3. Réaliser des réactions de RT à 42 ° C pendant 1 h, suivie d'une incubation à 70 ° C pendant 5 minutes pour inactiver l'enzyme RT.
  4. PCR en temps réel
    1. Mis en place 20 réactions ul qui se composent de 10 ul SYBR maître vert mélange,0,1 à 1,0 pi d'ADNc matrice, et 5 pmoles d'amorces sens et antisens.
    2. Exécuter la PCR en temps réel avec 40 cycles des étapes suivantes: dénaturation à 95 ° C pendant 10 sec, 58 ° C pour un recuit de 10 secondes, et 60 ° C pendant 30 sec prolongement. Réaliser des réactions de PCR en trois exemplaires.
    3. Vérifiez courbes de dissociation et assurez-vous qu'un seul pic est observé pour chaque jeu d'amorces.
    4. Obtenir les valeurs cycle de quantification (Cq) en calculant les secondes valeurs dérivées des courbes d'amplification.
    5. Calculer la quantité relative (RQ) d'ARNm cibles dans les échantillons induits par rapport à l'échantillon non induit en utilisant le «delta delta Cq (ΔΔCq)« méthode comme représenté par la formule suivante. Utilisez gènes de ménage, comme GAPDH ou PAD, comme une référence.

L'équation 1
Pour calculer plus précisément les valeurs relatives des isoformes d'épissage, til utiliser des gènes de référence multiples doit être considéré. Les résultats peuvent être analysés en utilisant une méthode de quantification de la valeur absolue modifié décrit par Pfaffl 33,34 et al.

4. examen de Splice isoformes au niveau des protéines

  1. Prélever des cellules dans 100 tampon RIPA glacée ul.
  2. Réglez lysats sur la glace pendant environ 10 min.
  3. Centrifuger à 14 000 g pendant 10 min à 4 ° C, et recueillir le surnageant.
  4. Mesurer la concentration de protéine par des essais de Bradford.
  5. Diluer les échantillons de protéine dans un tampon de charge SDS charger et de 20 à 40 ug de protéines dans des gels à 10% de SDS-PAGE.
  6. Exécutez gels SDS-PAGE à 20 mA pendant 1,5 heure.
  7. Transfert des protéines sur des membranes de PVDF dans un système de transfert humide à 4 ° C pendant 3 heures à 85 V. ajuster le temps de transfert en fonction du poids moléculaire des protéines cibles.
  8. membrane de bloc dans 5% de lait écrémé pendant 30 min à 1 h à température ambiante.
  9. Incuber membrane with un anticorps primaire à 4 ° CO / N. La gamme de dilution d'anticorps primaire est normalement comprise entre 1: 200 et 1: 5000, déterminer la dilution optimale pour chaque anticorps expérimentalement. La dilution des anticorps utilisés dans ce protocole peut être trouvé dans le "Tableau de réactifs et d'équipements spécifiques".
    1. Pour détecter les isoformes d'épissage, utiliser des anticorps spécifiques qui reconnaissent une isoforme particulière. En variante, en utilisant un anticorps qui reconnaît l'épitope dans la région codante de l'exon constitutive et détecter les isoformes d'épissage en même temps en fonction de leurs différentes dimensions de la protéine.
    2. Dans le même temps, surveiller EMT par immunoblot des marqueurs de l'EMT. Utiliser la E-cadhérine, γ-caténine, et occludine comme marqueurs épithéliaux, et la fibronectine, la N-cadhérine et la vimentine comme marqueurs mésenchymateuses.
  10. Membrane Laver trois fois avec du TBS-T (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) à un intervalle de 5 minutes.
  11. Incuber la membrane avec une fourmi secondaire conjugué à la HRPibody dans une dilution 1: 10 000 à 1 heure à température ambiante.
  12. Membrane Laver trois fois avec du TBS-T à un intervalle de 5 minutes.
  13. Visualiser protéine avec un système de détection de chimioluminescence et exposer la membrane à un film d'autoradiographie.

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Representative Results

Les procédures décrites ci-dessus fournissent une méthode robuste pour détecter l'épissage alternatif pendant EMT. Les résultats représentatifs de commutation de l'isoforme CD44 épissure pendant EMT induite Twist-sont donnés ci-dessous à titre d'exemple.

EMT induite Twist-dans les cellules HMLE / Twist-ER a été caractérisée par une transition d'un pavée comme phénotype épithélial à un phénotype fibroblastique allongée (figure 2A), l'absence de marqueurs épithéliaux E-cadhérine, γ-caténine et occludines et la régulation à la hausse des marqueurs mésenchymateuses la fibronectine, la N-cadhérine, et la vimentine (Figure 2B). En outre, EMT a été évaluée par la perte de la E-cadhérine au niveau des jonctions localisation cellule-cellule (figure 2C).

L'expression de commutation de CD44 isoformes d'épissage au cours EMT a été examiné par qRT-PCR et immunobuvardage. Le gène CD44 humain est composé de neuf exons variables. L'épissage alternatif de CD44 permet aux cellules de proproduire des variants de CD44 (CD44v) qui comprennent au moins un exon variable et le niveau de CD44 (CD44s) qui est dépourvue de tous les exons variables. figure 3A représente la stratégie de conception d'amorces pour la détection de différentes isoformes d'épissage de CD44. Pour la détection des CD44s produits exon-sauté, l'amorce sens est située dans l'exon constitutive 5, tandis que l'amorce inverse s'étend à travers la jonction entre les exons constitutifs 5 et 6 pour la détection de CD44v isoformes d'épissage contenant la variable v5 et v6 exons, la amorces sens et antisens sont conçus dans la v5 et v6, respectivement. Les amorces pour la détection de variables d'autres isoformes contenant un exon-CD44 peuvent être conçues en utilisant la même stratégie. En outre, la transcription de CD44 totale est détectée en utilisant des amorces sens et antisens qui se trouvent dans l'exon constitutive 2 et l'exon 3, respectivement (figure 3A). Comme le montre la figure 3B, qRT-PCR en utilisant des analyses de ces jeux d'amorces indiqué une diminution significative de CD44v ARNm et l'ARNm CD44s augmentation après 14 jours de traitement TAM dans les cellules HMLE Twist-ER-exprimant. En revanche, la transcription de CD44 totale est restée inchangée pendant EMT (Figure 3C). En accord avec les résultats de la qRT-PCR, le niveau de protéine de CD44v remarquablement diminué, alors que l'expression de la protéine a été CD44s fortement régulée à la hausse (Figure 3D). Par conséquent, la principale isoforme CD44 a été déplacé de CD44v à CD44s pendant le processus d'EMT.

Figure 1
Figure 1: conception d'amorce. Des schémas illustrant la position des amorces pour détecter les isoformes d'épissage dans un modèle de saut d'exon. Les cases grises représentent les exons constitutifs, les boîtes oranges représentent les exons variables, et les lignes fines des boîtes de raccordement représentent introns. Les emplacements amorces sont indiqued par des flèches: flèches noires indiquent les jeux d'amorces pour la détection de l'ARNm total flèches orange indiquent les jeux d'amorces pour amplifier isoformes d'exon-inclus, et les flèches bleues indiquent les jeux d'amorces pour détecter les isoformes de saut d'exon.

Figure 2
Figure 2 Induction de l'EMT. (A) des images à contraste de phase (10X) illustrant les changements morphologiques dans les cellules HMLE / Twist-ER avant (non traité) et après 14 jours de traitement TAM. (B) analyse immunoblot de marqueurs EMT dans les cellules HMLE / Twist-ER avant (non traité) et après 14 jours de traitement TAM. Après traitement TAM, marqueurs épithéliaux E-cadhérine, γ-caténine, et occludine ont été régulés à la baisse, et mésenchymateuses marqueurs fibronectine, la N-cadhérine, et la vimentine a été régulée à la hausse. (C) images de fluorescence immunitaire (63X) indiquant la perte de la E-cadhérinelocalisation au niveau des jonctions cellule-cellule après 14 jours de traitement TAM. Coloration verte indique la E-cadhérine, et la coloration DAPI (bleu) indique noyaux. Barre d'échelle = 10 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 Interrupteur d'isoformes d'épissage CD44 pendant EMT. (A) de conception amorce pour la détection d'isoformes d'épissage de CD44. Les cases grises représentent les exons constitutifs, les boîtes oranges représentent les exons variables, et les lignes fines des boîtes de raccordement représentent introns. Les emplacements d'amorces sont indiquées par des flèches: flèches noires indiquent les jeux d'amorces pour détecter CD44 ARNm total, flèches orange indiquent les jeux d'amorces pour amplifier CD44v5-6, et les flèches bleues indiquent les jeux d'amorces pourdétecter CD44s. (B, C) ​​analyse qRT-PCR des niveaux d'isoformes de CD44 au cours EMT en utilisant des amorces qui détectent spécifiquement CD44v contenant les exons variables v5 et v6 (v5 / 6) et CD44s (B), et CD44 ARNm total (C) . Niveaux d'expression relatifs des ARNm dans Jour 14 cellules ont été normalisées à jour correspondant 0 cellules TAM groupes traités et non traités. Les barres d'erreur représentent la SEM; n = 3 (D) analyse immunoblot des isoformes de CD44 au cours EMT TAM-induite dans les cellules HMLE / Twist-ER. Les niveaux de la E-cadhérine et la N-cadhérine ont été suivis afin d'identifier le statut EMT.

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Discussion

La procédure décrite ici permet la détection de l'épissage alternatif dans un modèle d'EMT inductible. Ainsi, les modifications dynamiques de l'isoforme d'épissage expression peuvent être capturées pendant toute la durée de temps de EMT. Cette méthode présente des avantages sur l'utilisation de epithelial- différente ou des lignées de cellules mésenchymateuses-représentant pour la comparaison de l'épissage alternatif d'arrière-plans génétiques distinctes provenant de lignées cellulaires liées à l'ONU-pourraient influencer indûment l'épissage alternatif. Cependant, l'induction réussie de EMT doit être confirmée avec soin en utilisant divers marqueurs de l'EMT avant des conclusions sur l'évolution de l'épissage alternatif peuvent être tirées. En outre, en plus du système d'EMT Twist-ER-inductible décrit ici, d'autres systèmes d'EMT, tels que ceux induits par Snail-ER ou TGFß sont recommandés pour la validation des résultats expérimentaux 11,30.

La commutation des isoformes d'épissage lors EMT peut être détecté dans les deux niveaux d'ARN et de protéines. Splice isodes anticorps spécifiques de fiche sont préférés pour l'analyse des protéines. Lorsque des anticorps spécifiques de l'isoforme n'est pas disponible, les niveaux d'isoformes d'épissage de protéines peuvent être déterminées en fonction de leur poids moléculaire par SDS-PAGE par immuno-empreinte. Le niveau de chaque isoforme de l'ARN peut être quantifié par des amorces spécifiques d'isoformes. En utilisant des tests qRT-PCR, le facteur de changement de chaque isoforme peut être déterminé avec tact et précision. En particulier, lorsque les matériaux expérimentaux sont limités, tels que l'analyse de l'expression d'une isoforme d'épissage particulier dans des échantillons cliniques, l'analyse qRT-PCR fournit une mesure quantitative qui compenser l'absence d'anticorps spécifiques d'isoformes pour l'immunohistochimie.

La méthode décrite ici est appropriée pour la détection de modifications d'épissage des isoformes connues au cours de l'EMT. De plus, cette méthode peut être étendue à l'étude de l'ensemble du génome de l'épissage alternatif et pour l'identification de commutation épissure isoforme roman pendant EMT. Pour ce faire,utilisation d'une technique à grande échelle, telles que l'ARN-séquençage profond épissage ou les plates-formes de biopuces sensible, peut être effectuée en utilisant des ARN isolés à partir du modèle d'EMT inductible décrit ci-dessus. Néanmoins, la validation qRT-PCR de l'évolution des isoformes est nécessaire après une analyse à grande échelle.

En conclusion, l'épissage alternatif est régulée de façon dynamique au cours de l'EMT, un processus qui est essentiel pour le développement embryonnaire et la métastase des tumeurs. Compte tenu de la fréquence élevée de l'épissage alternatif dans le génome humain, il est probable que la régulation de l'épissage alternatif joue un rôle important dans de nombreux processus biologiques et pathologiques, y compris la différenciation cellulaire, le développement des tissus, et la mort cellulaire programmée de 35 à 41. Le protocole décrit ci-après pour la détection d'isoformes d'épissage est applicable à ces systèmes.

Modalités expérimentales supplémentaires, tels que des dosages d'épissage reporter à minigènes peuvent be utilisé pour approfondir l'étude des mécanismes de régulation d'éléments agissant en cis et les facteurs agissant en trans qui contrôlent l'épissage alternatif 30,42,43. En outre, le rôle fonctionnel d'une isoforme d'épissage particulier pendant EMT peut être étudiée en faisant taire ou ectopique exprimant l'isoforme spécifique et suivi EMT induction dans le système EMT-inductible décrit 11.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxytamoxifen Sigma H7904 Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 μM. Keep the solution at -20 °C protected from light.
E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit Omega Bio-Tek R6731 Total RNA isolation kit
GoScript Reverse Transcription System Promega A5001 Reagent for qRT-PCR assay
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6002 Reagent for qRT-PCR assay
LightCycler 480 Real-Time PCR System Roche Equipment for qRT-PCR assay
CD44 antibody R&D Systems BBA10 1:1,000 dilution
E-cadherin antibody Cell Signaling Technology 4065 1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence
γ-Catenin antibody Cell Signaling Technology 2309 1:1,000 dilution
Occludin antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-5562 1:500 dilution
Fibronectin antibody BD Transduction Laboratories 610077 1:5,000 dilution
N-cadherin antibody BD Transduction Laboratories 610920 1:2,000 dilution
Vimentin antibody NeoMarkers MS-129-p1 1:500 dilution
GAPDH antibody Millipore Corporation MAB374 1:10,000 dilution
Amasham ECL Western blotting detection reagent GE Health Life Science RPN2209 Chemiluminescence system

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References

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