단백질 분석을위한 지속적인 인식 패턴을 생성하는 전자 혀

Bioengineering

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Hou, Y., Genua, M., Garçon, L. A., Buhot, A., Calemczuk, R., Bonnaffé, D., Lortat-Jacob, H., Livache, T. Electronic Tongue Generating Continuous Recognition Patterns for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (91), e51901, doi:10.3791/51901 (2014).

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Abstract

Introduction

정확하고 빠른 단백질 감지 방법은 의료 진단 및 단백질 체학 (proteomics)에서 매우 중요합니다. 이러한 바이오칩 클래식 단백질 검출 배열은 "자물쇠 및 열쇠"인식의 원리에 기초하고 앱 타머, 항체 또는 모방 체 등의 특정 수용체​​를 필요로한다.

최근 몇 년 동안, 인간의 후각 및 맛보기에 의해 영감을 차동 감지 대안 1로 떠오르고있다. 이 전자 코 / 혀 (EN / ET) 접근법은 표적 분자에 매우 특정 또는 선택적으로 필요하지 않은 교차​​ 반응성 수용체 (CRRs)의 배열 분석 물질의 결합 미분에 기초하므로 번잡을 극복하도록 매우 선택적 수용체의 개발 방법. 그것은 그것의 식별을 가능하게 지문처럼 각각의 샘플에 대한 고유 한 패턴을 만들어 모든 수용체의 결합 반응이다.

ELEC의 개발이 핵심 과제효과적인 단백질 검출 용 트로닉 코 / 혀는 구조적으로 유사한 분석 및 바인딩 이벤트에 적합한 전달 시스템을 구별 할 수있는 능력을 가지고 촬상 소자의 제조이다. 지금까지 연구는 어레이 개발이에 다양한 접근 방법이 신고되었습니다. 한 연구에서, 예를 들어 단백질의 스토리지 기반 식별은 다양한 아미노산 또는 단백질에 대한 별개의 청구 둘레 대한 친 화성, 소수성 코어를 갖는 차동 수용체를 제공하는 디 펩티드에 카르복실기를 결합하여 테트라 carboxyphenylporphyrin 유도체로부터 제조 CRRs를 사용하여 개발되었다 부여 차동 결합. 이 시스템을 사용하면, 다른 단백질과 단백질 혼합물은 분석 물질과의 상호 작용에 따라 3,4 수용체 형광 소광을 측정함으로써 확인되었다. 또 다른 연구에서, hexasubsti에 조합 방식으로 합성 트리 펩티드 및 보론 산 잔기를 함유하는 29 CRRs의 라이브러리환 된 벤젠 비계 표시 - 흡수 비색 검출 5,6로 단백질을 감지하기 위해 개발되었다. 같은 디자인으로, 각각의 수용체는 당 단백질에서 단백질의 차별화에 도움 펩타이드 팔에 분산에 따라 단백질, 및 붕산과 차동 결합 능력을 보여 주었다. 최근 음이온 형광 고분자 폴리 (p-페닐 렌) (PPE)가 결합 다른 양이온 작용 금 나노 입자로 구성된 배열을 감지하고 단백질 칠을 식별하기 위해 만들어졌습니다. 경쟁 단백질 고유 인식 패턴을 생성 단백질 분석 물질 간의 바인딩과 형광을 재생 PPE / 금 나노 입자 복합체를 켄칭. 이 연구에서, 기능화 된 나노 입자 - 단백질 상호 작용은 나노 단부 그룹의 물리 화학적 특성을 변화시킴으로써 조정 하였다. 또한,이 방법은 복잡하고 단백질이 풍부한 배지 등의 단백질 분석을 위해 효과적임을 나타내었다생리 학적으로 관련이 농도에서 인간 혈청으로서, 이와 질환 상태를 진단하기 위해 8 실제 시료 프로파일에서 ET의 전위를 도시.

매우 유망하지만,이 시스템은 몇 가지 본질적인 한계가있다. 그들은 설계 및 매우 복잡한 구조를 5 ~ 29 CRRs에서 합성이 필요합니다. 또한, 각각의 측정 다음 리셋 후각 시스템과 달리, 단백질은 샘플 당 센싱 어레이를 제조 요구한다. 마지막으로, 실시간 모니터링에 이벤트 바인딩은 매우 어렵습니다.

이러한 맥락에서, 조합 접근 방식은 서로 다른 물리 화학적 특성을 가진 간단하고 쉽게 접근 분자의 적은 수의 사용에 의해 제안되었다 (중성 음으로 하전 된 양전하 친수성, 소수성,,,, 등.) 빌딩 블록 (BBS) 9있다. 에 혼합물을 변화의 BB들은하고 제어 비율을 혼합 허용함으로써의 금 표면에 자기 조립 (self-assembly)프리즘, 결합 단백질에 적합한 특성을 갖춘 조합 표면의 배열을 만들었습니다. 특히,이 시스템의 자기 조립 단층 신속하고 효율적으로 생산 될 다양한 조합 교차 반응 수용체 (CoCRRs)를 가능하게 높은 분기하는 방식으로 표면 특성의 범위를 쉽게 튜닝 할 수 있습니다. 단백질이 검출 광 검출 시스템을 사용하여 수행되었으며, 플라즈몬 공명 영상 (SPRI)를 표면. 간략하게, LED에서 넓은 빔 단색 편광 프리즘의 표면 전체 CoCRR 어레이 영역을 조명한다. 고해상도 CCD 비디오 카메라는 CoCRR 어레이의 모든 지점에 걸쳐 실시간 차분 화상을 제공한다. 이것은 바인딩 이벤트 및 운동 프로세스 10에 대한 상세 정보를 제공 CoCRR 어레이의 표면에서 로컬 변경을 모두 포착. 한편, 이미징 소프트웨어의 도움으로, 스폿에 대응하는 SPR 이미지는 자동 versu 반사율의 변화로 변환sensorgrams 불리는 결합 곡선 운동의 시리즈를 생성하는 시간이야. 따라서, SPRI 바인딩 이벤트 라벨없는, 동기, 병렬 및 실시간 관찰을 허용한다. 또한, 수득 CoCRR 어레이는 단백질 분석을위한 재생 가능한 재사용이다.

이 프로토콜은 빌딩 블록으로서 만이 작은 분자를 사용하여 전자 혀의 구성을 설명하고 SPRI 연속 인식과 구매 패턴에 따라 공통 단백질 분석 용의 응용을 도시한다.

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Protocol

다양한 솔루션 및 단백질 샘플의 1 준비

  1. 50 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 50 mM의 염화나트륨을 함유하는 인산염 완충액 (PBS-G) 100 ㎖, pH를 6.8에서 10 % 글리세롤을 준비한다.
  2. pH가 7.4에서 10 mM의 HEPES, 150 mM의 염화나트륨, 0.005 % 트윈 20을 함유하는 HEPES 완충 용액 250 ㎖를 준비한다.
  3. PBS-G에서 0.2 밀리미터에 유당 (그림 1) 황산 빌딩 블록 1 (BB1) 유당 및 빌딩 블록이 (BB2)의 주식 솔루션을 준비합니다.
  4. 1 μM에서 꽃대의 hypogaea 렉틴 (AHL) 500 nm의, 미오글로빈에서, 및 500 nm에서 라이소자임 : HEPES 단백질 용액 1 ㎖를 준비합니다.
  5. 초순수에 1 % SDS 20 ㎖를 준비한다.

CoCRR 배열의 2 준비

  1. 75 % 산소 25 %, 아르곤, 0.6 밀리바, 전력 40 W. : 이러한 조건에서 3 분 동안 플라즈마 클리너와 함께 사용하기 전에 프리즘 48 시간의 금 표면을 청소
  2. 열한 순수하고 혼합 solutio 준비[BB1] / BB2와 BB1과의 NS ([BB1] + [BB2]) PBS-G 0.1 ㎜의 전체 BB 농도에서 10 %의 증가에 의해 0과 100 % 사이의 비율.
  3. 입금 합계 44 점 (도 2)와 각 감속비 사통에서 비접촉 감시인을 이용한 프리즘면에 순수 및 이들 혼합 용액 8 NL 방울.
    NOTE : PBS-G에서 추가 10 % 글리세롤, 용매 증발 및 증착 후 BB 농도의 변화를 감소시키는 것이 매우 중요하다.
  4. 초순수 1 ㎖를 함유하는 페트리 접시 안에 프리즘을 배치하고 금 표면에 BB2와 BB1의 자기 조립을위한 RT에서 O / N을 떠난다. 여기서,이 혼합의 SAM의 표면 평균 조성은 증착 혼합 용액의 조성 (도 3) (11)를 반영하는 것으로한다.
  5. 초순수로 충분히 프리즘을 세척 한 후 아르곤의 흐름 아래를 건조.

3 단백질 감지 SPRI에 의해

  1. incubato 설정R이있는 SPRI 장치는 단백질 감지하는 동안 온도 변화에 의해 유도 된 굴절률 변화를 방지하기 위해 25 ° C에 배치됩니다.
  2. (PEEK) 컴퓨터 제어 시린지 펌프, 탈기 및 6 포트 중압 분사 밸브에 연결된 셀 흐름 (도 4) 10 μl를 폴리 에테르 에테르 케톤의 비 - 작용 린스 프리즘입니까. 갓 여과하고 버퍼 HEPES를 실행 탈기와 흐름 시스템에 입력합니다.
  3. 린스 프리즘을 제거하고 유동 셀 CoCRR 어레이를 포함 프리즘을 삽입한다. 100 μL / min의 유량으로 실행 HEPES. CCD 카메라의 도움으로 신속하게 실행 버퍼를 전달하여 프리즘 표면에 존재하는 기포를 제거합니다.
  4. 어레이의 잘 대조 화상과 SPRI 시스템의 통합 소프트웨어의 도움으로 기초하여 관심 영역에 대해 동일한 직경을 가진 원을 그림으로써, 각 자리에 대한 연구 영역을 정의한다.
  5. 반영 플라즈몬 나타내는 곡선을, 추적모든 반점의 입사각의 함수에의 ivity 곡선.
  6. 반사율 곡선의 가장 높은 슬로프에서 작업 각도 (운동 곡선이 기​​록됩니다되는 위치)를 선택합니다. 운동 측정을위한 선정 작업 각도를 해결하기 위해 스캐닝 미러를 돌립니다.
  7. 모든 관광 명소에 대한 반사 신호가 안정적이고 일정하게 될 때까지 흐름 시스템을 통해 HEPES를 계속 실행됩니다.
  8. 위치 "부하"에 주입 밸브 시료 루프 (500 μL)에 주사기와 1 ㎖의 AHL 솔루션을 주입한다. 그런 다음 "주입"위치로 주입 밸브를 넣어. 모든 단백질 주입에 사용 유속 100 μL / 분이었다.
  9. 모든 지점에서 동시에 시간에 대한 반사율의 변화를 모니터링하여 운동 측정을 시작합니다.
  10. 단백질 사출의 끝에서 8 분 동안 버퍼를 실행 어레이를 헹군다. 마지막으로, 그것을 다시 생성 한 ML 1 % SDS를 주입.
  11. 다른 페이지에 대해 동일한 절차를 반복roteins.

(4) 데이터 처리 및 분석

  1. 유동 세포에 단백질 용액의 항목에 따라, 분자 결합이 발생하고 플라즈몬 커브의 시프트 및 반사율의 변화를 유도한다. 화상 획득 소프트웨어 sensorgrams (도 5B)을주고, SPR 이미지 5A 도표주는 스케일 레벨을 그레이 측정 광 강도 값을 변환하고, 시간에 대한 반사율의 변화를 생성한다.
  2. [BB1] 대 각 단백질 주입 단부에 반사율 (R의 %)을 플롯 수학 컴퓨팅 소프트웨어를 사용하여 / ([BB1] + [BB2])는 각 샘플에 대한 2 차원 연속 진화 프로파일 (CEP)을 생성하는 비율 (도 5C).
  3. [BB1] / ([BB1] + [BB2]) sensorgrams의 비율을 추가합니다 (그림 5B)는 각 단백질 (그림 5D)에 대한 3D 연속 진화 풍경 (CEL)을 생성합니다.

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Representative Results

일반적인 단백질 분석 용 전자 혀의 능력을 검사하기 위해, 세 가지 단백질을 사용 하였다 : AHL, 미오글로빈 및 리소자임을. 도 6에 도시 된 바와 같이 각각의 단백질의 경우, 별개의 연속적인 진화 2D 프로파일, CEP는 ET에 의해 생성되었다.

또한, 각각의 단백질에 대해, 시간에 따라 연속 인식 패턴을 실시간으로 흡착 및 탈착 반응 속도를 모니터링 할 수 SPRI, 덕분에, 3D 연속 진화 풍경 (CEL)가, 생성 된 호출. 그림 7에서,이 세 가지 단백질의 특성 CELS이 표시됩니다.

그림 1
이 프로토콜에서 사용되는 두 개의 빌딩 블록의 그림 1 화학 구조 CoCRR 어레이를 제조 하였다.51901 / 51901fig1highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림이
도 2 사통 각 비율 비접촉 압전 감시인을 사용 BB1과 BB2의 순수 및 혼합 용액의 44 방울을 증착 한 후, 프리즘의 사진. 프리즘 1.5 ㎖를 에펜 도르프 튜브 옆에 배치되었다.

그림 3
의 혼합물을 다양한 비율로 BB1과 BB2의 순수하고 혼합 솔루션을 제조 하였다 (11) 차동 수용체를 포함하고 허용 CoCRR 배열의 그림 3 도식 그림 골드 쉬르에 자기 조립프리즘의 얼굴입니다.

그림 4
마이크로 유체 시스템과 결합 SPRI 검출 시스템의 개략도 4 도표.

그림 5
2D 지속적인 진화 프로필 및 3D 연속 진화 풍경 : 개발 된 전자 혀 연속 인식 패턴의 두 가지 유형의 생성을위한 데이터 처리의 그림 5 도식 그림입니다.

그림 6
그림 6 Continuou발 진화 프로필 세 순수한 단백질 :. AHL (500 nM의), 미오글로빈 (1 μM), 및 리소자임 (500 nM의) 이들은 [BB1 대 단백질 사출의 끝에서의 반사율 (R의 %)의 변화를 플롯 팅하여 생성 된 ] / ([BB1] + [BB2]) 비율입니다.

그림 7
맛 7 풍경 그림 : 전자 혀에 의해 생성 된 AHL, 미오글로빈 (myoglobin)와 리소자임의 특성 차원 CELS를.

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Discussion

이 등의 건설을위한 가장 중요한 단계는 시스템의 재현성을 보장하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 예를 들어, BB1과 BB2의 열한 순수 및 혼합 용액에 글리세롤의 10 %를 첨가, 사용 전에 표준화 된 절차와 프리즘의 금 표면을 세정하는 BB들은 프리즘의 금 표면에 자기 조립 중에 용매를 증발 제거하고, 각 [BB1] 여러 복제물 / ([BB1] + [BB2]) 비율 등을 증착하는 단계를 포함한다. SPRI 의한 단백질 검출 용으로, 작동 각도의 선택은 중요하다. 일반적으로, 그것은 반사율 곡선의 최대 기울기에 고정된다. 또한, 등등 작동 온도, 유량, 각 단백질 검출 용 표준화 된 실험 조건을 사용하는 것이 매우 중요하다. 각 단백질을 주입 한 후, CoCRR 어레이는 수용체의 손상없이 시스템을 완전히 재생을 허용하는 적절한 솔루션을 재사용을 위해 다시 생성해야합니다.

e_content은 ">를 사용 하였다이 아닌 당 결합 단백질이 미오글로빈와 리소자임 하나의 렉틴 AHL 함께, 일반적인 단백질 또한 개발 등이 같은 이전에 9보고 설탕 결합 단백질의 연구에만 적용 아니라는 것을 보여, 그러나하려면 그들은. HEPES (산도 7.4)에 전하의 다양한 구성하기로 결정했다 :. 그림 6과 같이 AHL (등전점 (PI) 6.0), 미오글로빈 (PI 7.2)와 리소자임 (PI 11) 특히, 각 단백질은 독특한를 보유 응답 패턴. AHL 약간 부정적인 HEPES에 충전된다. 그 CEP 그것이 음전하 BB2 풍부한 CoCRRs과 강한 상호 작용을 갖는 것을 알 수있다. 대부분의 경우, 그 단백질의 양으로 대전 된 영역 및 BB2 풍부한 CoCRRs 사이의 상호 작용에 기인 심지어 더 높은 농도에서, AHL와 리소자임의 CEPS에 CEP에 미오글로빈를 비교할 때. HEPES에서 전체적으로 중성 미오글로빈, 들어 모든 CoCRRs로 얻어지는 신호 사이에 큰 차이가 없다. 신호 훨씬 싸다이며WER. 긍정적 HEPES 충전되어 리소자임, 관해서는, 최대 신호는 순수한 BB2 함유 CoCRR 얻었다.

3D 연속 진화 프리가 생성 된 각각의 단백질에 대해, 실시간으로 흡착 및 탈착 반응 속도를 모니터링 할 수 SPRI의 이점 덕분. 시간 종속 인식 패턴이 종류의 단백질 분석을위한 부가 분화 파라미터를 가져온다. 특히,이 분석 CoCRRs의 세트에 대해 유사한 친 화성을 제시하지만, 그들의 상호 작용의 반응 속도가 상이한 분석에 매우 유용 할 수있다. 도 7에 도시 된 바와 같이, CELS 쉽게 구별 가능하다. 이들 결과는 함께 CoCRRs 세 단백질의 상호 작용은 소수성 중성 및 하전 아미노산 잔기의 분포 그들의 표면 특성에 의존하는 것을 알 수있다. CEP 및 CEL 모두 단백질 차별 prospec위한 "지문"로서 사용될 수있다TIVE 식별. 따라서, ET 일반적인 단백질의 분석을 위해 효과적이다.

본원에 기재된 프로토콜은 단백질 분석 ET를 구성하는 조합 방식을 사용한다. 합성 할 구조적으로 복잡하고 번잡 분자의 수를 사용하는 다른 방법과는 달리, 두 개의 작은 분자는 본 연구에서 양호한 해상도로 단백질을 구별 할 수있는 교차 - 반응성 수용체 어레이를 제조하는데 사용 하였다. 또한, 이전의 연구에 따르면, ET는, 안정하고 재현성 9 재사용이다. 또한, SPRI 실시간으로 결합 된 사건을 검사하는 전례없는 신뢰성 소설 연속 인식 패턴을 생성 할 수 있습니다. 가까운 미래에, 상보 물리 화학적 특성을 갖는 추가 BB들은 액체 또는 가스의 복잡한 혼합물의 분석 어레이 CoCRR의 다양성을 증가시키기 위해 도입된다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
SPRi apparatus  Horiba Scientific-GenOptics SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25 °C.
Incubator Memmert
Syringe pump  Cavro scientific instruments Cavro XLP 6000
Micro Elite Degasser  Alltech AT590507
6-port medium pressure injection valve Upchurch Scientific The volume of injection loop used is 500 µl.
Femto plasma cleaner (version 7) Diener Electronic On-line degassing system with 2 channel.
Spotter Siliflow It is a non-contact piezoelectric spotter.
SPRi-Biochip Horiba Scientific-GenOptics 36000067 The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes.
Erythrina cristagalli lectin  Sigma-Aldrich L5390
Arachis hypogaea lectin  Sigma-Aldrich L0881
Myoglobin Sigma-Aldrich M1882
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
CXCL12α Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9
CXCL12γ  Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9
Lactose Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9
Sulfated lactose Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9
Glycerol Sigma-Aldrich G5150
SDS Sigma-Aldrich L4509
Tween 20 Sigma-Aldrich 274348
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014

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References

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