Strategie per l'inseguimento Anastasis, una cellula di sopravvivenza fenomeno che Inverte Apoptosis

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis. J. Vis. Exp. (96), e51964, doi:10.3791/51964 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Anastasis (greco per "l'aumento per la vita") si riferisce al recupero delle cellule morenti. Prima di queste cellule recuperare, hanno attraversato importanti posti di blocco di apoptosi, tra cui la frammentazione mitocondriale, il rilascio di mitocondriale citocromo c nel citosol, attivazione delle caspasi, condensazione della cromatina, il danno al DNA, la frammentazione nucleare, membrana plasmatica blebbing, restringimento delle cellule, l'esposizione della superficie cellulare di fosfatidilserina, e la formazione di corpi apoptotici. Anastasis può verificarsi quando stimoli apoptotici vengono rimossi prima della morte, consentendo in tal modo le cellule che muoiono per invertire l'apoptosi e potenzialmente di altri meccanismi di morte. Pertanto, Anastasis sembra coinvolgere i processi di guarigione fisiologici che potrebbe anche sostenere le cellule danneggiate in modo inappropriato. Le funzioni ei meccanismi di Anastasis non sono ancora chiare, ostacolato in parte dagli strumenti limitati per rilevare eventi passati dopo il recupero di cellule apparentemente sani. Strategie per l'individuazione Anastasis consentirà studi dei meccanismi fisiologici, i rischi di cellule non-morti in patologia della malattia, e potenziali terapie per modulare Anastasis. Qui, descriviamo strategie efficaci utilizzando la microscopia cellulare dal vivo e un biosensore caspasi mammiferi per l'identificazione e il monitoraggio Anastasis in cellule di mammifero.

Introduction

Apoptosis (greco per "cadere a morte") è generalmente accettato di essere un processo a senso unico che termina nella cella suicidio 1-7. L'alterazione del gene pro-morte geni risultati nella sopravvivenza delle cellule in più che altrimenti morirebbero in animali interi, comprese le cellule che hanno già avviato il 8,9 apoptosi percorso. Allo stesso modo, le manipolazioni genetiche consentono alle cellule di mammifero sane che artificialmente DISPLAY "eat me" segnali o che perdono adesività per la loro matrice extracellulare per sfuggire alla morte per fagocitosi delle cellule tutto o entosis, rispettivamente, 10,11. Tuttavia, noi ed altri hanno dimostrato che senza manipolazione genetica normali cellule di mammifero sane e linee cellulari possono anche recuperare dalle prime fasi di apoptosi 12-15. Utilizzo di strumenti per monitorare le singole cellule, abbiamo ulteriormente dimostrato il recupero da stadio avanzato di apoptosi 12,13, dopo che le cellule sono passati importanti posti di blocco che tipicoly segnare il "punto di non ritorno" 2-6. Questi punti di controllo di fase apoptosi tardiva includono rilascio mitocondriale di citocromo c, attivazione delle caspasi, frammentazione nucleare, e la formazione di corpi apoptotici. Abbiamo adottato una parola composta greco "Anastasis", che significa "in aumento per la vita", per descrivere questa inversione di apoptosi sull'orlo della morte cellulare 2-6.

A meno che l'intero processo di morte-recupero è osservato da imaging cellulare dal vivo, che è difficile da distinguere le cellule che hanno subito anastasis da cellule che non hanno riportato eventi apoptotici. Decenni di lavoro hanno rivelato che le caratteristiche morfologiche del suicidio cellulare per apoptosi sono guidati da eventi biochimici e molecolari evolutivamente conservati 16-19. Questi eventi promuovono autodistruzione delle cellule di regolare i processi di sviluppo e omeostatici di organismi unicellulari e pluricellulari eliminando danneggiato o dcellule angerous 16-19. Mentre le cellule apoptosi possono essere facilmente distinguono per manifestazioni morfologiche, biochimiche e molecolari standardizzate di apoptosi 1,5,6,16,20, attualmente non esiste un marcatore nota specifica per Anastasis 12,13. È importante sottolineare che, le cellule che hanno subito anastasis sembrano essere normali cellule sane e cellule che appena iniziano invertendo apoptosi apparire cellule morenti come apoptotici 12,13. Pertanto, sono necessari nuovi strumenti per concludere con certezza che una data cellula superstite aveva precedentemente sperimentato processi apoptotici attivi.

L'apoptosi è generalmente assunto come una cascata irreversibile perché è un processo di distruzione rapida e massiccia. Mentre potrebbe richiedere alcuni minuti a giorni per alcune cellule di avviare apoptosi, una volta che i mitocondri hanno rilasciato fattori citotossici, come il citocromo c nel citosol 21,22, caspasi possono essere attivate entro 5 minuti 23,24, seguito da citoplasmatica econdensazione nucleare entro 10 minuti 25-27, e la morte cellulare poco dopo 25-27. Caspasi attivate orchestrano apoptosi con l'adesione e inattivando componenti strutturali e funzionali chiave al fine di demolizione cellulari 2,28, come l'inibitore endonucleasi DFF45 / ICAD 29,30. Caspases attivano anche i fattori pro-apoptotici, come BID membro BCL-2 famiglia, che trasloca mitocondri per promuovere il rilascio mitocondriale di citocromo c 31,32. Attività di caspasi traduce anche nella cella di esposizione della superficie della fosfatidilserina come un segnale "eat me" per promuovere fagocitazione di morire cellule da parte dei macrofagi o cellule vicine attraverso fagocitosi 33. Inoltre, gli eventi apoptotici rendono mitocondri disfunzionali, che perturbano bioenergetica cellulari e metabolismo 34,35,36. Così, il recupero da tale distruzione sembra intuitivamente improbabile.

Contrariamente all'originale aspettarsizioni, le cellule possono invertire il processo di morte cellulare per apoptosi anche in una fase avanzata. Monitorando costantemente il destino di morire le cellule in coltura, abbiamo osservato la reversibilità della fase apoptosi in ritardo in un intervallo di celle primarie e linee cellulari 12,13. La rimozione dello stimolo morte ha permesso il recupero dalle caratteristiche evidenti di apoptosi, come la frammentazione mitocondriale, la condensazione della cromatina, il danno al DNA, membrana plasmatica blebbing, l'esposizione della superficie delle cellule della fosfatidilserina, rilascio di mitocondriale citocromo c, attivazione delle caspasi, la frammentazione nucleare, restringimento delle cellule, e la formazione di corpi apoptotici. Queste osservazioni sollevano domande senza risposta per quanto riguarda le funzioni, conseguenze, e meccanismi di Anastasis. Per rispondere a queste domande, un prerequisito è quello di identificare in modo affidabile le cellule che hanno subito Anastasis. Qui, descriviamo i metodi di microscopia dal vivo e un biosensore caspasi per rilevare le cellule che hanno già invertito apoptosi fase tardiva e then sopravvissuto.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparazione di cellule di Imaging Live Cell

  1. Per facilitare l'individuazione di cambiamenti morfologici, scegliere cellule aderenti quali HeLa (carcinoma cervicale umana) cellule che sono piatta sul substrato per visualizzare meglio alterazione della membrana plasmatica e organelli intracellulari.
    Nota: Storno apoptosi è stata osservata in diverse cellule di mammifero 12,13, comprese le cellule del fegato di topo primaria, macrofagi primari topo, i cardiomiociti primari di ratto, e anche delle cellule linee come il rene embrionale cellule HEK-293T umani, africani scimmia verde renali COS epiteliali -7 cellule, il mouse del muscolo cardiaco HL-1 le cellule, fibroblasti di topo NIH 3T3, furetto (Mustela putoris furo), le cellule del cervello, le cellule CRL1656 A375 cancro della pelle umana, cellule CRL1973 cancro ai testicoli umani, piccole celle H446 carcinoma polmonare a cellule umane, il cancro del fegato umano cellule HepG2, cellule MCF7 cancro al seno umano, cellule PC3 cancro alla prostata umano, e neuroblastoma cellule SH-SY5Y umani.
  2. Pre-lavaggio vetrini di vetro di coltura cellulare fondo piatti con etanolo assoluto per la pulizia e la sterilizzazione.
    Nota 1: l'uso di piatti fondo di vetro è raccomandato per l'alta qualità contrasto di interferenza differenziale (DIC) microscopia, e alto confocale di ingrandimento o microscopia a fluorescenza (vedi la discussione).
    Nota 2: Per ingrandimenti elevati (40X, 60 / 63x o 100X obiettivi e le alte aperture numeriche 1.3 o 1.4), l'uso di piatti di coltura cellulare con fondo di vetro più sottile (spessore 0,085-0,16 mm) offre più le distanze per l'imaging di lavoro (vedi protocollo 3 ).
  3. A seconda del tipo di cellula, vetro fondo piastre di coltura possono richiedere rivestimento con poli-D-lisina (0,1 mg / ml), collagene (soluzione 0,01% in 0,01 M di acido acetico) e / o di fibronectina (5 mg / ml) prima semina cellule.
    Nota: è necessaria ottimizzazione del tipo e della concentrazione di agente di rivestimento per linee cellulari differenti. Cellule HeLa possono aderire direttamente sul vetro senza rivestimento. Tuttavia, alcune cellule, Such come topo muscolo cardiaco HL-1 le cellule, non può aderire direttamente alle superfici vetrate, ma richiedono protocolli di coltura e di rivestimento specifici 37.
  4. Seed ~ 2-3 x 10 5 cellule in 35 millimetri di vetro pre-rivestite di cellule bottom cultura piatti e incubare a 37 gradi Celsius (° C), con il 5% di CO 2 per un giorno per raggiungere l'80% di confluenza.
    Nota 1: Le condizioni ottimali di densità cellulare, tempo di incubazione, e la condizione cultura può variare, a seconda del tipo di cellula. Confluenza cellulare può influenzare la risposta apoptotica delle cellule (vedi protocollo 2). Ad alta confluenza, le cellule potrebbero essere meno sensibili alle stesse concentrazioni di stimoli apoptotici.
    Nota 2: Evitare di cellule confluenti, come ad alta densità cellulare può oscurare cambiamenti morfologici delle singole cellule e dei loro organelli.

2. Applicazione e rimozione di apoptosi cellulare stimoli

  1. Poco prima dell'uso, pre-mix l'agente che induce l'apoptosi, con 37 ° C terreno di coltura cellulare. Etanolo (3,6-4,5% Vol / vol) è servito come apoptosi induttore nel presente manifestazione.
    Nota 1: I dati pubblicati e non pubblicati dimostrano che le cellule possono anche invertire apoptosi che viene attivato da altri stimoli apoptotici 12,13, come ad esempio dimetilsolfossido (DMSO, 8% vol / vol per 24 ore), staurosporina (STS, 0,5 micron per 1 ora), e taxolo (1 micron per 12 ore). È necessaria ottimizzazione del dosaggio per innescare l'apoptosi in differenti tipi di cellule per ottenere la dose minima che può innescare la maggioranza delle cellule nella popolazione di sottoporsi apoptosi.
    Nota 2: Pre-miscelazione agenti che inducono apoptosi con mezzo di coltura cellulare è importante evitare l'esposizione uniforme delle cellule apoptotiche stimoli.
  2. Immagine di un gruppo di cellule di salute nel piatto di coltura cellulare prima di applicare l'agente che induce l'apoptosi di stabilire morfologie di base.
  3. Rimuovere il supporto originale dal piatto di coltura cellulare, e quindi applicare 2 ml di premiscelato agente che induce l'apoptosi al piatto aattivare le cellule di sottoporsi apoptosi. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2 (o altre condizioni di coltura normale).
  4. Dopo l'incubazione, osservare le cellule dalla luce, fluorescenza o microscopia confocale per monitorare la progressione della funzionalità apoptotici.
    Nota 1: Le cellule in fase di apoptosi mostreranno caratteristiche morfologiche, biochimiche e molecolari di apoptosi che può essere rilevato al microscopio e biosensori basati fluorescenza (vedere Protocolli di 3 e 4).
    Nota 2: Il tempo di incubazione delle cellule con differenti induttori dell'apoptosi varierà, a seconda del tipo di cellula, condizioni cellulari (come confluenza e stato nutrizionale), e la dose di stimoli morte applicata. Titolazione attenta può essere richiesto.
  5. Quando le cellule mostrano caratteristiche di apoptosi, rimuovere l'agente che induce l'apoptosi lavando le cellule una volta con caldo (37 ° C, o altra temperatura cultura normale) fresco terreno di coltura cellulare.
    Nota 1: Come le cellule apoptotiche sono più liberamente attaccati supiastra di coltura, è importante applicare e rimuovere medie delicatamente in modo che le cellule non verranno lavati via.
    Nota 2: in diretta sospeso cellule possono essere recuperati dal surnatante mediante centrifugazione delicata (160 g per 1 min) e aggiunto di nuovo al piatto cultura.
  6. Incubare le cellule a 37 ° C con 2 ml / piastra da 35 mm di fresco terreno di coltura cellulare in 5% CO 2. In alternativa, l'uso medio condizionato (terreno di coltura privo di cellule raccolte da cellule sane) per migliorare ulteriormente la sopravvivenza delle cellule apoptotiche.
    Nota: lavaggio e cellule incubazione con mezzo fresco consentono la maggioranza delle cellule per invertire apoptosi indotta etanolo dopo esposizione etanolo 12,13. Tuttavia, ripetendo questa fase di lavaggio può essere richiesto quando le cellule sono esposte ad altri stimoli apoptotici (vedi la discussione).

3. Microscopia Live Cell

  1. Si consiglia di utilizzare un confocale o fluorescenza microscopio invertito con controllo ambientale (37 ° C,2) 5% CO per le cellule vive microscopia.
    Nota: È anche possibile immagine le cellule utilizzando microscopi verticali con un obiettivo immersione dell'acqua. Immergere l'obiettivo direttamente nel terreno di coltura per celle di immagine. Tuttavia, le cellule possono essere schiacciati dall'obiettivo immersione durante la messa a fuoco.
  2. Pre-riscaldare il microscopio (come camera ambientale di controllo, fase incubatore, e riscaldamento oggettiva) almeno 2 ore prima di imaging.
    Nota: Questo consente ai componenti del microscopio di raggiungere termo-equilibrio, in modo che possa evitare la deriva della messa a fuoco e spostamento del piano xy dovuto alla dilatazione e contrazione termica dei componenti.
  3. Posizionare un piatto di vetro fondo 35 mm di cellule in coltura (Vedere protocollo 1) sul palcoscenico di un microscopio invertito e catturare le immagini delle cellule utilizzando un obiettivo 40X o 63X piano a Apochromat con apertura numerica (NA) 1.3 o 1.4 per l'imaging cellule dal fondo del piatto con vetrino.
    Nota: Evitare di applicare più di 2 ml di terrenoa 35 millimetri di vetro piatto inferiore, come il peso del mezzo potrebbe causare curvatura del fondo di vetro, rendendo difficile l'immagine di un campo di celle nello stesso piano focale.
  4. Mantenere cellule a 37 ° C o la corrispondente temperatura normale durante l'intero processo di imaging.
    Nota: Il processo di apoptosi, e probabilmente l'inversione di apoptosi, dipende da attività enzimatiche sensibili alla temperatura. Pertanto, mantenendo le cellule a 37 ° C (ad esempio con una fase di microscopio top incubatore) è importante tutto l'esperimento. Diminuzione temperatura potrebbe rallentare la risposta apoptotica e la risposta di recupero dopo la rimozione dello stimolo apoptotico.
  5. Utilizzare un dispositivo di umidità o di porre un foglio trasparente (vedi Materiali) sul piatto cultura per ridurre la perdita di acqua per evaporazione dal mezzo.
    Nota: la pellicola potrebbe disturbare la polarità della luce per microscopia DIC. Ripristinare polarità regolando il polarizzatore nel percorso della luce.
  6. Mantenere pHmezzo di coltura cellulare (pH 6.8 -7.3) incubando in 5% CO 2 con una camera di controllo ambientale sul microscopio.
    Nota: Manutenzione del pH nel terreno di coltura può essere ottenuto anche con l'aggiunta di tampone HEPES, oppure utilizzando commerciale CO 2 medio -indipendente (Vedere Materials). Le condizioni ottimali possono variare, a seconda del tipo di cellula.
  7. Ridurre al minimo di fluorescenza / laser (eccitazione intensità della luce) l'esposizione alle cellule durante il processo di imaging per evitare fototossicità riducendo l'intensità di fluorescenza al più basso necessario per ottenere immagini di alta qualità di cellule / strutture cellulari o biosensori espressi (dettagli nel protocollo 4).

4. Strategie per individuare e seguire Anastasis durante e dopo apoptotici Eventi

  1. Membrana plasmatica blebbing, condensazione citoplasmatica, restringimento delle cellule e la formazione del corpo apoptotico (vedi figure 1A - C, E).
    1. Eseguire time-lapse diffe cellule vivecontrasto renziale interferenza (DIC) o microscopia a contrasto di fase per monitorare un gruppo di cellule di salute e di osservare la loro morfologia cellulare (Vedere protocollo 3 per microscopia cellule vive, e vedi la discussione).
      Nota 1: ridurre l'intensità della fonte di luce per DIC / fase di imaging contratto per evitare di fototossicità alle cellule.
      Nota 2: Se DIC e microscopio a contrasto di fase non sono disponibili, utilizzare CellTracker per macchiare citosol per delineare la morfologia delle cellule vive per microscopia confocale o epi-fluorescenza e monitorare la morfologia cellulare.
    2. Applicare stimolo morte cellulare per attivare le cellule a subire apoptosi (Vedere protocollo 2 per l'applicazione e la rimozione di stimoli apoptotici).
    3. Osservare cellule trattate per caratteristiche morfologiche di apoptosi, come membrana plasmatica blebbing, condensazione citoplasmatica, restringimento delle cellule e la formazione del corpo apoptotico (Figure 1A, 1B, 1C, 1E).
    4. Lavare via stimoli di morte, e le cellule ri-approvvigionamento con terreno fresco quando le cellule displacaratteristiche morfologiche y di apoptosi.
      Nota 1: Applicare stimolo morte cellulare o cambiare il mezzo di coltura cellulare sul palco microscopio durante time-lapse imaging cellulare dal vivo può essere ottenuto utilizzando una camera di coltura cellulare di perfusione, o può essere eseguita direttamente sul piatto di coltura cellulare pipettando con cautela senza toccare il piatto, durante gli intervalli tra imaging.
      Nota 2: sistemi di compensazione della deriva Usa attenzione per evitare fuori fuoco delle cellule a causa della perdita di termo-equilibrio del sistema del microscopio dopo la modifica del mezzo di coltura cellulare (vedi la discussione).
    5. Continuo time-lapse imaging per monitorare il destino delle cellule che presentano caratteristiche di apoptosi. Le cellule che invertire l'apoptosi in grado di riparare i danni e recuperare normale morfologia piatta (Figure 1A, 1B, 1C, 1E).
  2. Frammentazione mitocondriale, DNA / condensazione della cromatina, e la frammentazione nucleare (vedi figure 1D, 1F, 1G).
    1. Per visualizzare mitochondria, cellule macchia con 50 deep dye nM MitoTracker rosso / rosso / verde fluorescente, e contemporaneamente colorano il nucleo con 10 ug / ml di Hoechst 33342 blu colorante nucleare in un terreno di coltura per 20 minuti a 37 ° C con il 5% di CO 2.
      Nota 1: Ridurre la concentrazione di coloranti e la durata dell'incubazione per evitare citotossicità e ridurre fluorescenza di fondo quando necessario. Ottimizzare le condizioni di colorazione per ottenere un buon rapporto segnale rumore con la minima quantità di colorante e l'incubazione tempo per la colorazione.
      Nota 2: Utilizzare le macchie fluorescenti per i mitocondri, come MitoTracker Red CMXRos, MitoTracker Deep Red FM, o MitoTracker Verde FM, che non perde fuori dai mitocondri durante l'apoptosi. Questo permette di visualizzare la morfologia mitocondriale durante l'apoptosi e Anastasis. Vedere i materiali e le attrezzature per la tavola dettagli su queste macchie.
    2. Conservare cellule colorate al buio per evitare photobleaching.
    3. Rimuovere l'eccesso macchia lavando le cellule3 volte con 37 ° C-buffer fosfato salino (PBS) o soluzione fresca mezzo di coltura cellulare, con 1 min di incubazione in un mezzo fresco tra ogni lavaggio, e poi incubare ulteriormente nel mezzo fresco per 20 minuti prima del lavaggio finale per consentire eccessiva macchie per uscire le celle per ridurre sfondo segnali non specifici per l'imaging.
      Nota: Abbreviare i tempi di incubazione con mezzo cellulare dopo colorazione può provocare alta sfondo per l'imaging.
    4. Eseguire in tempo reale confocale cellule vive o microscopia a fluorescenza di cellule sane immagine prima di applicare l'induzione di apoptosi (Vedere protocollo 3 per microscopia cellule vive).
      Nota: Le cellule sane mostrano mitocondri tubolari e nuclei rotondi nella maggior parte dei tipi di cellule (figure 1D, 1F, 1G).
    5. Trigger cellule a subire apoptosi (Vedere protocollo 2 per l'applicazione e la rimozione di stimoli apoptotici alle cellule).
    6. Continua time-lapse microscopia cellule in vivo di osservare alterazioni morpholog mitocondriale e nucleareies subito dopo lo stimolo di morte è applicata alle celle. Osservare cellule per visualizzare distingue apoptosi come frammentazione mitocondriale e gonfiore, la condensazione della cromatina e frammentazione nucleare, contrariamente alle cellule sane visualizzazione mitocondri tubolari e nuclei rotondi.
    7. Quando le cellule mostrano caratteristiche di apoptosi, lavare e la fornitura di cellule con terreno fresco, e continuare time-lapse imaging per monitorare il destino delle cellule. Le cellule che invertire apoptosi riacquistare mitocondriale normale morfologia nucleare (figure 1D, 1F, 1G).
      Nota: Eseguire la microscopia DIC in parallelo quando possibile ottenere ulteriori informazioni per l'accesso alle fasi di apoptosi osservando le alterazioni della morfologia cellulare nello stesso gruppo di cellule (vedi protocollo 4.1 per microscopia DIC).
  3. Rilevazione di rilascio mitocondriale di citocromo c utilizzando cellule che esprimono stabilmente un GFP fusione citocromo c protein (vedi figura 2).
    1. Cellule Macchia stabilmente esprimenti citocromo c-GFP 23,24 con MitoTracker Red per etichettare mitocondri cellulari polarizzati (per vivere cella mitocondri colorazione Vedere i punti da 4.2.1 a 4.2.3).
    2. Eseguire in tempo reale confocale cellule vive o epi-microscopia a fluorescenza per monitorare le cellule sane (dettagli nel protocollo 3 per l'imaging cellulare dal vivo).
      Nota: Il segnale GFP citocromo c localizza prevalentemente nei mitocondri delle cellule sane (figure 2A i, 2B).
    3. Trigger cellule a subire apoptosi (Vedere protocollo 2 per l'applicazione e la rimozione di stimoli apoptotici alle cellule). Continua la microscopia time-lapse per osservare traslocazione del citocromo c-GFP dai mitocondri al citoplasma (Figure 2Aii-iii, 2B).
      Nota: rilascio mitocondriale di citocromo c nel citosol è un marker di membrana mitocondriale esterna permeabilizzazione (MOMP)4, un passaggio fondamentale in mitocondri-dipendente apoptosi 21,22
    4. Quando le cellule mostrano il segnale GFP citocromo c nel citoplasma, rimuovere lo stimolo morte cellulare, e le cellule di alimentazione con terreno fresco (Vedi protocollo 2). Continua time-lapse imaging per monitorare il destino delle cellule con GFP citosolico.
      Nota: Le cellule che invertire apoptosi ritrovare normale morfologia cellulare, e ridurre il loro segnale GFP citocromo c citosolico presumibilmente attraverso la degradazione o la traslocazione di nuovo ai mitocondri (Figure 2Aiv-vii, 2B).
    5. Cattura immagini DIC in parallelo per ottenere ulteriori informazioni per l'accesso le fasi di apoptosi osservando alterazioni nella morfologia delle cellule in cellule singole o gruppi di cellule (Vedi protocollo 4.1 per microscopia DIC).
  4. Rilevazione di attività caspasi usando un biosensore caspasi (vedi figura 3)
    1. Cellule trasfezione con la caspasi biosensori NES-DEVD-YFP-NLS per16 a 24 ore prima di sottoporli ad uno stimolo apoptotico 13.
    2. Colorare le culture trasfettate con Hoechst 33342 per etichettare nuclei cellulari (per la cella colorazione nucleare in diretta Vedere i punti da 4.2.1 a 4.2.3).
    3. Eseguire in tempo reale confocale cellule vive o epi-microscopia a fluorescenza per monitorare le cellule sane (dettagli nel protocollo 3 per l'imaging cellulare dal vivo).
      Nota: Il segnale biosensore NES-DEVD-YFP-NLS localizza principalmente nel citoplasma delle cellule sane grazie al suo segnale di esportazione nucleare (NES) (Figure 3A, 3Bi e 3C, vedi la discussione).
    4. Trigger cellule a subire apoptosi (Vedere protocollo 2 per l'applicazione e la rimozione di stimoli apoptotici alle cellule). Continua la microscopia time-lapse per osservare la traslocazione nucleare di YFP.
      Nota: L'attivazione delle caspasi fende il motivo DEVD nel caspasi biosensori NES-DEVD-YFP-NLS, con conseguente YFP-NLS traslocazione dal citoplasma al nucleo (Figure 3A, 3Bii-iv, vedi la discussione).
    5. Nota: Le cellule che inversa apoptosi riconquistare normale morfologia cellulare, ma mantenere il segnale YFP nucleare (Figure 3Bv-x, celle 1 e 2, e 3D).
    6. Continua time-lapse imaging per monitorare il destino delle cellule che mostrano YFP nucleare.
      Nota: Il segnale YFP nucleare diventerà degradate parecchie ore dopo che le cellule hanno invertito apoptosi (Figure 3B, vi-x, Cella 1, vedere i risultati e discussione) presumibilmente attraverso i normali meccanismi di clearance delle cellule, come la degradazione del proteasoma.
    7. Cattura immagini DIC in parallelo per ottenere ulteriori informazioni per accedere alle fasi di apoptosi osservando alterazioni nella morfologia cellulare in cellule singole o un gruppo di celle. (Vedere Protocollo 4.1 per microscopia DIC).
  5. L'esposizione della superficie cellulare della fosfatidilserina (vedi figura 4)
    1. Cellule Seed su glass coprioggetto per raggiungere confluenza cella 80% (vedi protocollo 1).
    2. Co-macchia le cellule con MitoTracker rosso fluorescente e blu Hoechst 33342 macchia per i mitocondri e nuclei, rispettivamente (per mitocondriale delle cellule vive e colorazione nucleare Vedere i punti da 4.2.1 a 4.2.3).
    3. Attivare le cellule a sottoporsi apoptosi mediante un induttore di apoptosi (Vedere protocollo 2).
    4. Applicare fluorescente marcato annessina V (vedi Materiali) per colorare le cellule apoptotiche 10 min a 37 ° C prima della rimozione del induttore apoptosi per rilevare l'esposizione della fosfatidilserina sulla superficie delle cellule apoptotiche.
      Nota 1: Healthy cellule non sono colorate con annessina V perché fosfatidilserina è normalmente sequestrato su quello interno-volantino della membrana plasmatica delle cellule 38. Le cellule apoptotiche sono colorate con annessina V, che si lega alla fosfatidilserina sulla superficie cellulare (Figure 4A e 4B).
      Nota 2: annessina V fluorescente marcato può essere applicato anche a colorare le cellule apoptotiche immediatamente dopo la rimozione del induttore apoptosi, con 10 min di incubazione.
    5. Rimuovere stimoli morte cellulare, lavare le cellule colorate con caldo PBS o mezzo fresco una volta, e quindi la fornitura di cellule con terreno fresco per 2 ore a 37 ° C con il 5% di CO 2 (Vedi protocollo 2).
      Nota 1: Le cellule che invertita apoptosi riconquistare la morfologia normale e mantenere fluorescente segnale annessina V dopo aver recuperato la morfologia normale (figure 4A, 4B e).
      Nota 2: Il segnale annessina V diminuisce con il tempo sulle cellule recuperate (vedi la discussione).
    6. Fissare le cellule in momenti scelti con 4% paraformaldeide contenente 8% di saccarosio in 1x PBS per 20 minuti al buio a temperatura ambiente, e lavare le cellule fissate con PBS per 3 volte per rimuovere paraformaldeide prima cellule montaggio su vetrini coprioggetto con antifade di montaggio (vedi Materiali) per microscopia confocale o epi-fluorescenza e osservare annessina V sulle cellule dopo la rimozione di apoptosi induttore.
      Nota 1: saccarosio in fissativo conserva la struttura della membrana cellulare durante la fissazione.
      Nota 2: Conservare la soluzione paraformaldeide al buio a 4 ° C per prevenire il degrado.
      Nota 3: Warm up soluzione paraformaldeide a temperatura ambiente prima di applicarlo alle cellule per la fissazione per evitare shock freddo alle cellule.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Per studiare l'inversione di apoptosi, le cellule di coltura di tessuti vengono prima esposti ad uno stimolo morte per innescare l'apoptosi. Quando le cellule mostrano caratteristiche di apoptosi, terreno di coltura fresco viene poi applicato per lavare via stimolo e poi incubare le cellule morenti per consentire il recupero (Figura 1A). Qui, la questione chiave affrontata è fino a che punto le singole cellule in coltura morenti possono progredire verso l'apoptosi e ancora subire Anastasis. Questa domanda può essere definitivamente risolta da un monitoraggio continuo con biomarcatori per seguire destini cellulari utilizzando i metodi descritti di seguito.

Noi descriviamo primo nostre strategie per rilevare l'inversione di apoptosi in cellule di coltura tissutale utilizzando time-lapse microscopia cellule vive, che è richiesta per il monitoraggio e la registrazione della risposta delle cellule individuali prima, durante e dopo l'esposizione ad uno stimolo apoptotico 12,13. Cellule aderenti sane sparsi sul loro substrato allegato (Figura 1BI) 12,13, e visualizzato mitocondri filamentose e nuclei rotondi prima del trattamento (figure 1CI, Di, Ei, Fi, Gi) 12,13. Dopo l'esposizione al 3,8-4,5% di etanolo in mezzo di coltura cellulare (vol / vol), DIC o microscopia a contrasto di fase hanno rivelato che le cellule esposte caratteristiche morfologiche di apoptosi, tra cui la formazione di condensa citoplasmatica, membrana plasmatica blebbing, e restringimento delle cellule (figure 1Bii, 1Cii- iii, e 1Eii-vi) 12,13. Apoptotica formazione corpo dalle stesse cellule è stata prontamente osservato da DIC (Figure 1Eii-vi). La frammentazione dei mitocondri MitoTracker-etichettati (Figure 1Dii-iii, 1Fii-vi) 12,13 e la condensazione del DNA nucleare Hoechst-macchiato (Figure 1Dii-iii, Fii-iii, Gii) 12,13, e la frammentazione dei nuclei (FicoUres 1Evi e FVI, frecce bianche), sono stati rilevati simultaneamente da microscopia confocale o epi-fluorescenza. Le cellule che hanno invertito con successo l'apoptosi sono stati successivamente osservati per riconquistare la morfologia normale, apparentemente riparare il danno (figure 1Biii, C e Div-vi, E e FVII-xii, e GIII) 12,13. Le cellule in queste condizioni anche erano stati indicati per riconquistare la motilità organello, migrazione cellulare, e endocitosi funzionale basato sulla captazione di fluorescenza emettono Quantum Dots e cellule divisione 13. È interessante notare che, alcune cellule che l'apoptosi venerato visualizzata morfologia irregolare nucleare (Figura 1Fxii), e anche la divisione cellulare anormale e la formazione di micronuclei (Figure 1Giv-vii) 13, che è un biomarcatore di danno al DNA, rotture cromosomiche e tutta la perdita cromosomica in cellule che si dividono 39, 40. Displaced chromosomes o frammenti cromosomici fuori non riescono a essere inclusi nei nuclei delle cellule figlia sono racchiusi da una membrana nucleare 39, 40. Pertanto, a seguito di Anastasis potrebbe essere il l'ospitare dei genomi che sono state danneggiate durante l'apoptosi interrotta, portando a tumorigenesi e progressione del cancro. La presenza di micronuclei è comune anche in cellule tumorali 40,41.

Rilascio di mitocondriale citocromo c è un passo fondamentale per mediare o amplificare caspasi-dipendente apoptosi 20-22. Utilizzando cellule HeLa che esprimono stabilmente GFP-tagged citocromo c, abbiamo monitorato il trasferimento subcellulare di citocromo c durante l'apoptosi e Anastasis mediante microscopia confocale. Come riportato 23,24, citocromo c-GFP localizzato mitocondri prima del trattamento (Figure 2AI e B), ma poi è stato rilasciato nel citoplasma dopo uno stimolo morte era stata applicata (figure 2Aii,2Aiii e B). Altri morfologie caratteristici come la frammentazione mitocondriale e la membrana plasmatica blebbing, sono stati osservati anche in cellule che aveva rilasciato il citocromo c-GFP (Figura 2Aiii). Queste cellule sono state segnalate a subire la morte cellulare subito dopo il rilascio di citocromo c 23-27. Tuttavia, dopo la rimozione dello stimolo morte, abbiamo osservato che i livelli di citocromo c citosolico GFP diminuiti, i mitocondri riacquistato strutture filamentose, e la membrana plasmatica recuperato un aspetto normale (Figure 2Aiv-vii, e B). Pertanto, le cellule apoptotiche possono subire anastasis dopo il rilascio mitocondriale di citocromo c.

Amplificazione di valle caspasi-DEVD scissione è generalmente considerata come la "punto di non ritorno" in apoptosi 2,5. Pertanto, abbiamo utilizzato una caspasi biosensore NES-DEVD-YFP-NLS esprnon elaborato da un plasmide 13, rendendo possibile rilevare cellule sopravvissute che hanno già sperimentato attività caspasi (Figura 3A). Questo biosensore caspasi è un polipeptide con un segnale esclusione nucleare N-terminale (NES), un linker con la caspasi-3/7 sito consenso di scissione (DEVD) 26,42,43, seguita da una proteina fluorescente gialla (YFP) e segnale di localizzazione nucleare C-terminale (NLS). In cellule sane, questo biosensore localizza prevalentemente al citosol in funzione dei NES (Figure 3Bi, Ci-IV, e D) 13. Durante l'apoptosi, caspasi attivate fendono il motivo DEVD, rilasciando YFP-NLS, che trasloca in modo efficiente dal citoplasma al nucleo di cellule che, contemporaneamente, o successivamente, mostrano altre caratteristiche di apoptosi, come DNA / condensazione della cromatina e ritiro delle cellule (figure 3B ii -IV, e D) 13. Così, laCells SE mantengono funzione di importazione nucleare dopo l'attivazione delle caspasi. Dopo la rimozione del induttore apoptosi, cellule che subiscono visualizzazione anastasis ripristino morfologico anche dopo l'avvenuta attivazione delle caspasi (Figure 3Bv-x, e D) 13, a quanto pare invertire fase apoptosi in ritardo. Durante il recupero della morfologia normale, il segnale YFP nucleare diminuisce di intensità in alcune cellule quando cominciano a invertire apoptosi dopo la rimozione dello stimolo morte (Figure 3Bv-x, Cella 1) 13, suggerendo che le cellule si degradano il biosensore caspasi-spaccati, eventualmente lo stesso meccanismo utilizzato per rimuovere altri prodotti caspasi-spaccati durante e dopo Anastasis.

Anastasis può essere rilevata anche senza la microscopia cellule vive. Ciò può essere ottenuto utilizzando fluorescente annessina V 38,44, che lega e marchi esteriorizzati fosfatidilserina (PS) in un primo passo in apoptosi ( (Figura 4B) 13, come fosfatidilserina è limitato al foglietto interno della membrana plasmatica delle cellule sane 38. Al contrario, le cellule morenti apoptotici etanolo-indotta espongono fosfatidilserina sulla superficie cellulare (Figura 4B) 13, e, quindi, possono essere etichettati con l'annessina fluorescenti V 38,44. Notevolmente, cellule annessina V marcata possono riacquistare la morfologia normale dopo la rimozione degli stimoli di morte, il che suggerisce che i cardiomiociti primari hanno invertito l'apoptosi (Figura 4B) 13. Altri hanno già applicato una strategia simile a suggerire che il recupero da apoptosi potrebbe verificarsi in vivo. In un modello in vivo di danno ischemico transitorio, annessina V etichettatura caspasi-dipendente dei cardiomiociti in conigli e topi apparentemente riconsultati nella internalizzazione di annessina V sopravvivendo celle dopo ischemia transitoria 45, suggerendo potrebbe verificarsi di animali vivi che Anastasis. Inoltre, altri due studi cell sorting usati per identificare una frazione di annessina V marcata con il mouse BCL 1 .3B3 cellule di linfoma B (esposti ad anticorpi anti-immunoglobulina che inducono apoptosi in BCL 1 .3B3) e carcinoma mammario topo cellule MOD temperatura esprimenti p53 -sensitive (che provoca l'apoptosi dopo incubate sotto la temperatura permissiva) ha continuato a proliferare dopo che sono stati restituiti alle normali condizioni di coltura 14,15. Collettivamente, questi studi suggeriscono che annessina V è utile per determinare il destino delle cellule che si sono invertiti apoptosi senza live-cell immagini di microscopia. Tuttavia, ci sono avvertimenti con questa strategia, come annessina V fluorescenza non è permanente (Figura 4B) 13, rimanendo rilevabile solo per pochi ore dopo la rimozione dello stimolo morte, perchéquesti metodi non possono fornire il monitoraggio a lungo termine di cellule che invertito apoptosi.

Figura 1
Figura 1: Monitoraggio inversione di apoptosi mediante imaging cellulare dal vivo. (Ristampato con il permesso di Tang et al, MBOC 23, 2240-2252 13, per le figure 1A -. D e G). (A) Approccio di indurre l'apoptosi e successivamente consentire cellule in coltura di recuperare dopo aver lavato via il induttore apoptosi. (B) Time-lapse fase cellule vive microscopio a contrasto di cellule di topo fegato primari sani (non trattato), lo stesso gruppo di cellule che sono stati trattati con 4,5% di etanolo in terreno di coltura (vol / vol) per 5 ore (trattato), e poi lavate e incubate con ulteriore terreno di coltura fresco per 24 ore (lavato). Bar Scala, 100 micron. (C) continuo time-lapse cellule vive epi-microscopia a fluorescenza della stessa cella del mouse primario del fegato prima ethatrattamento nol (i), ai tempi indicati dopo trattamento con 4,5% di etanolo in mezzo di coltura cellulare per 2,5 ore (ii e iii), e dopo il lavaggio e incubazione con mezzo fresco per permettere il recupero per 1 ora (iv - vi). Fusione di immagini di mitocondri MitoTracker-macchiati (rosso) e la Hoechst-macchiato nucleo (blu) sono stati visualizzati mediante microscopia fluorescenza, e la morfologia delle cellule al microscopio DIC. Bar Scala, 10 micron (D) solo (senza DIC) immagini. Incorporate fluorescenza da pannello C rivelare morfologie organelli. (E) continua time-lapse cellule vive microscopia confocale delle piccole cellule di carcinoma polmonare a cellule umane H446 prima del trattamento di etanolo (i) , dopo trattamento con 3,8% di etanolo in mezzo di coltura cellulare per 2 h 28 min (ii-vi), e dopo il lavaggio e incubazione con mezzo fresco per permettere il recupero (vii-xii). Fusione di immagini di mitocondri MitoTracker-macchiati (rosso) e nuclei Hoechst-colorate (blu) sono stati visualizzati mediante microscopia confocale, ec ell morfologia al microscopio DIC. Frecce bianche indicano un nucleo frammentato in corpi apoptotici (vi). Bar Scala, 10 micron. (F) Fusa immagini fluorescenza solo (senza DIC) dal pannello E rivelare morfologie organelli. (G) continua time-lapse cellule vive microscopia a fluorescenza per l'imaging nucleare monocromatica Hoechst macchiato di una singola cellula HeLa che subisce divisione cellulare impreciso. Prima del trattamento etanolo (i), il trattamento con 4,3% di etanolo in mezzo di coltura cellulare per 5 ore (ii) e dopo la rimozione etanolo (lavato, iii-vi). Pannelli iv rivela divisioni cellulari anormali. Le frecce rosse indicano i principali nuclei nelle celle separate (IV-VI). Bar Scala, 30 micron. I tempi sono indicati come hr: min. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2 "src =" / files / ftp_upload / 51964 / 51964fig2highres.jpg "/>
Figura 2: Rilevamento inversione di apoptosi dopo il rilascio mitocondriale di citocromo c (A) continua time-lapse in diretta cellule microscopia confocale di cellule HeLa esprimono stabilmente citocromo c-GFP (Cito C-GFP) prima (i), durante (ii-iii) e dopo (iii-vii) l'esposizione al 3,9% di etanolo in mezzo di coltura cellulare. Immagini confocale unite di CytoC-GFP (green), mitocondri MitoTracker-colorati (rosso), e nuclei Hoechst-macchiati (blu) sono combinati con immagini DIC (pannello di sinistra). Versioni unmerged sono indicati separatamente per CytoC-GFP, presentato come una mappa di calore di intensità del segnale (pannello centrale di sinistra), immagine in bianco e nero di CytoC-GFP (pannello centrale), e l'immagine in bianco e nero dei mitocondri (pannello centrale a destra). Fusione di immagini di CytoC-GFP e mitocondri (pannello di destra). (B) Il cambiamento del citocromo c-citosolica GFP intensità delle cellule, Cel segnalel 1 e Cella 2, come indicato nell'immagine CytoC-GFP in bianco e nero a Panel Ai in. I tempi sono indicati come hr: min. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Rilevamento inversione di apoptosi dopo attivazione delle caspasi (Ristampato con il permesso di Tang et al, MBOC 23, 2240-2252 13, per le figure 3A - D.). (A) Schema della proteina di fusione caspasi biosensore composto da un segnale di esportazione nucleare (NES), il sito DEVD caspasi scissione, proteina fluorescente gialla (YFP), e il segnale di localizzazione nucleare (NLS). (B) continua time-lapse in diretta cell microscopia confocale di cellule HeLa che esprimono le caspasi biosensori NES-DEVD-YFP-NLS prima (i), durante (ii -IV) e dopo (vx) esposizione a 4,3% di etanolo in mezzo di coltura cellulare. Immagini confocale unite del biosensore caspasi (verde), nuclei Hoechst-colorate (blu) e immagini DIC (pannello di sinistra), a immagini monocromatiche di segnale YFP (pannello centrale), e una mappa di calore che indica l'intensità del segnale YFP (pannello di destra) . (C) controlli non trattati analizzati come nel pannello B. (D) quantificata intensità di fluorescenza per il biosensore caspasi nucleare attivato in cellule singole (numerate 1 e 2 nel pannello Bi) prima, durante e dopo l'esposizione di etanolo, e nei controlli non trattati (numerati 3 e 4 nel pannello Ci) sono stati calcolati come percentuale della YFP presente nel nucleo (intensità cellule segnale YFP nucleare / totale x 100%). I tempi sono indicati come hr: min. Bar Scala, 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

ays "> Figura 4
Figura 4: Rilevamento inversione di apoptosi da fluorescenti marcati annessina V (Ristampato con il permesso di Tang et al, MBOC 23, 2240-2252 13, per le figure 4A - B.). (A) Diagramma della annessina V-FITC anastasis dosaggio utilizzato nel pannello B. (B) ratto neonatale miociti ventricolari cardiaci primari sono stati esposti al 4,5% di etanolo in mezzo di coltura cellulare per 5 ore, e poi incubate con annessina V-FITC per 10 min prima della rimozione del mezzo etanolo. Le cellule sono state fissate sia immediatamente (trattati), o fissati dopo rialimentazione con terreno fresco per un ulteriore recupero 2 ore (lavati). Le cellule non trattate che sono stati esposti annessina V-FITC servono come controllo (non trattato). Mitocondri MitoTracker-colorate (rosse), nuclei Hoechst-colorati (blu) e annessina V-FITC (verde) sono stati visualizzati mediante microscopia confocale, e la morfologia delle cellule è stato visualizzato mediante microscopia DIC. Scbar ale, 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anastasis si riferisce al fenomeno in cui le cellule che hanno attivato cellule morte percorso successivamente invertire il processo di morte e sopravvivere. Qui, abbiamo dimostrato che l'imaging cellulare dal vivo può essere utilizzata per confermare che le stesse cellule singole, infatti, possono invertire apoptotica processo di morte cellulare in una fase avanzata, e poi continuare a sopravvivere e riprodursi. I nostri protocolli descrivono diversi cellulari ottimizzati condizioni trattamento specifico tipo di indurre l'apoptosi e consentire una gran parte delle cellule a subire l'inversione di apoptosi monitorati con diversi biomarcatori per la verifica. Per quanto riguarda i problemi tecnici, piatti fondo di vetro sono stati usati per cellule di coltura per l'imaging 12,13, a causa del vetro sottile altamente trasparente tra le cellule e l'obiettivo del microscopio, che permette lunghe distanze di lavoro per confocale alta qualità o microscopia a fluorescenza in alto ingrandimento, facilita l'osservazione di apoptosi classico tra cui la frammentazione mitocondriale, Il rilascio di citocromo c, e la condensazione nucleare e frammentazione. Glass anche non distorce la polarità della luce, per consentire DIC microscopia ad alta qualità per il monitoraggio delle blebbing membrane, restringimento cellulare delle cellule, e la formazione del corpo apoptotico durante l'apoptosi. Microscopia DIC presenta vantaggi rispetto microscopio a contrasto di fase rispetto di queste caratteristiche morfologiche di apoptosi, come DIC migliora il contrasto dei campioni di cellule non colorati e trasparenti, migliorando il rilevamento di morfologie cellulari. Se DIC e microscopio a contrasto di fase non sono disponibili, CellTracker può essere utilizzato per colorare citosol per delineare la morfologia delle cellule vive per microscopia confocale o epi-fluorescenza e monitorare la morfologia cellulare.

L'applicazione di dosi appropriate di stimoli di morte e le strategie di rimozione degli stimoli sono passaggi critici per il rilevamento di Anastasis. Abbiamo scelto di utilizzare basse concentrazioni di etanolo come stimolo morte per la sperimentazione described qui perché una grande percentuale di cellule trattate può subire uniformemente apoptosi e può recuperare da questo, potenzialmente più mite, stimoli la morte. Tuttavia, questi approcci possono essere applicati con successo con altri stimoli di morte, come abbiamo riportato 12,13. Tuttavia, alcuni stimoli di morte sono intrinsecamente più difficili di altri, come ad esempio staurosporina (STS), un uso comune agente che induce l'apoptosi. Forse perché si lega suoi substrati con alta affinità 46-48, lavaggi ripetuti sono essenziali ma ancora non può rimuovere efficacemente STS dalle cellule. In questo caso, con concentrazioni di farmaco inferiori e tempi di incubazione della droga più breve che può ancora attivare processo di morte apoptotica potrebbe essere utile per consentire a più celle per invertire apoptosi. Rialimentazione cellule con mezzo di coltura cellulare condizionato può anche migliorare l'inversione di apoptosi migliore del mezzo di coltura cellulare fresca. Le cellule apoptotiche sono di solito vagamente collegati alla superficie piatto cultura particolare sulla sur vetrofacce, quindi è importante per lavare via le induttori dell'apoptosi delicatamente per evitare il distacco delle cellule. Rivestimento piatti di vetro con poli-D-lisina, collagene e / o fibronectina potrebbe aumentare l'aderenza cellulare per consentire alcuni tipi di cellule, come cardiomiociti 37, per collegare correttamente sulla superficie di vetro di piatti di coltura cellulare, in particolare dopo l'esposizione delle cellule a una stimoli morte.

Il processo di apoptosi, e probabilmente l'inversione di apoptosi, dipende attività enzimatiche che possono essere influenzati dalla temperatura. Pertanto, mantenendo le cellule a 37 ° C o al loro normale condizione di cultura è importante durante il processo di imaging in tempo reale di garantire la riproducibilità dei risultati sperimentali. Microscopio Pre-caldo prima di iniziare l'imaging cellulare dal vivo è anche un passaggio fondamentale che permette ai componenti del microscopio di raggiungere termo-equilibrio. Questo può evitare la deriva di messa a fuoco e spostamento del piano xy dovuto alla dilatazione e contrazione termica delcomponenti durante l'imaging cellulare dal vivo. Applicazione o rimozione dello stimolo morte cambiando il mezzo di un piatto di coltura sia con una pipetta o perfusione nel sistema di microscopia pre-riscaldato durante l'imaging time-lapse può ancora causare deriva di attenzione a causa di cambiamenti di temperatura o volume del mezzo. Acquisizione Z-stack può aiutare a celle di immagine sul piano focale corretto, ma aumenta il rischio di fototossicità causa di ulteriore esposizione delle cellule a laser fluorescenti. In alternativa, l'uso di sistemi di compensazione fuoco deriva, ad esempio un sistema di correzione automatica di messa a fuoco basata laser infrarosso, può mantenere le cellule allo stesso piano focale durante time-lapse imaging cellule vive mantenendo la distanza tra il cellule / vetro e l'obiettivo senza ulteriori L'esposizione delle cellule a breve lunghezza d'onda, la fluorescenza fototossico.

Rilascio mitocondriale di proteine ​​apoptogenica quali citocromo c, e l'attivazione delle caspasi effettrici, quali il downstream / effettoo caspasi-3 e caspasi-7, sono stati generalmente considerato il "punto di non ritorno" nel processo di morte cellulare per apoptosi 2,5,6. Western blot sono stati utilizzati per rilevare la scissione (attivazione) della caspasi-3 e suoi substrati come poli (ADP) -ribose polimerasi-1 (PARP) e DFF45 / ICAD nella popolazione cellula intera durante l'induzione di apoptosi e dopo la rimozione di apoptotico stimoli, e ha rivelato che spaccati caspasi-3, ICAD e PARP presentò nelle cellule durante l'esposizione a stimoli di morte, ma è scomparso dopo che le cellule sono state ri-alimentazione con la cultura fresca media 13. Tuttavia, questi metodi rivelano la condizione generale della popolazione di cellule, ma non distinguono le singole cellule che alla fine moriranno da quelli che inverte l'apoptosi e quindi sopravvivere. Frazionamento biochimico per analizzare il rilascio di mitocondriale citocromo c ha avvertimenti simili. Pertanto, per monitorare il destino di singole cellule dopo citocromo c rilascio e caspasi-accoltiva-, due delle caratteristiche più riconosciute di apoptosi 2,5,6, GFP-tagged citocromo c (Cito C-GFP) ed un biosensore caspasi, come quello usato qui NES-DEVD-YFP-NLS, combinato con cellule vive microscopia aggirano questi problemi osservando direttamente ripristino morfologico e la traslocazione del biosensore Cyto C-GFP nelle stesse cellule. Questi risultati indicano la reversibilità di apoptosi dopo citocromo c mitocondriale rilascio e l'attivazione delle caspasi.

La sfida attuale per studiare anastasis è la mancanza di tecniche di marcatura per rilevare le cellule che hanno subito anastasis in qualsiasi momento durante la loro vita, in vivo o in vitro. Espressione stabile della caspasi biosensori NES-DEVD-YFP-NLS consente anche il rilevamento di attività caspasi se caspasi sono attivati ​​di nuovo in futuro, ma non registra in modo permanente l'attività delle caspasi come il biosensore attivato sarà degradato senza Sustaattività di caspasi ined 13. Altri biosensori caspasi precedentemente riportati, come ad esempio i biosensori SCAT basato FRET-(es ECFP- [DEVD] -Venus) 26,49 così come reporter fluorescenti Apoliner (CD8-RFP- [DQVD] GFP) 50 o CPV (es CD8 - [DEVD] -Venus) 51,52, può essere utilizzato per rilevare l'attività della caspasi in animali interi e in cellule in coltura, ma hanno limitazioni simili. Analogamente, Cyto C-GFP non può essere utilizzato per monitorare le cellule che invertiti apoptosi in lungo termine, come viene rilasciato dai mitocondri nel citosol durante l'apoptosi e viene successivamente degradato. Etichettatura annessina V è stato usato per monitorare cellule che invertito apoptosi, ma l'intensità del segnale declina anche con il tempo, quindi non è utile per il monitoraggio a lungo termine di anastasis 13,45. Continuo a lungo termine imaging in vivo potrebbe essere utilizzato per monitorare il destino delle stesse cellule dopo l'esposizione di stimoli di morte. Tuttavia, a lungo termine imaging in vivo è ancora impegnativo to eseguire in maggior parte degli animali vivi. Pertanto sono necessari ulteriori approcci per estendere la ricerca Anastasis a studi intero animale, e per lo screening di farmaci che potrebbero promuovere o inibire anastasis utilizzando colture cellulari

In futuro, sono necessari nuovi protocolli e tecniche che traccia il destino delle cellule a lungo termine per sviluppare e testare le implicazioni fisiologiche, patologiche e terapeutiche di Anastasis. Abbiamo proposto che anastasis potrebbe essere un meccanismo generale sopravvivenza cellulare per salvare cellule danneggiate che sono difficili da sostituire, come neuroni maturi e cellule cardiache 13. Tuttavia, Anastasis di cellule tumorali apoptotiche dopo trattamenti chemioterapici potrebbe comportare il recupero delle cellule pericolose che portano alla recidiva di tumori resistenti 12,13. Anastasis potrebbe anche essere un importante meccanismo di tumorigenesi, come alcune cellule mostrano trasformazione oncogena dopo invertiti apoptosi 13. Pertanto, migliorando Anastasis potrebbe essere un nuovo Therastrategia peutico per inibire la neurodegenerazione e lo scompenso cardiaco, sopprimendo Anastasis come un nuovo modo per prevenire o curare i tumori. Sviluppare biosensori per monitorare l'inversione di apoptosi in sistemi modello di malattia farà progredire la comprensione dei meccanismi di sopravvivenza delle cellule di Anastasis, e potenziali terapie per malattie incurabili modulando Anastasis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Ringraziamo Rev. Dr. Ralph Bohlmann e Rev. Dr. James Voelz per suggerire la parola "Anastasis" per descrivere l'inversione di apoptosi; Douglas R. verde per le cellule HeLa esprimono stabilmente citocromo c-GFP; Charles M. Rudin e Eric E. Gardner per H446 cellule; Heather Lamb per l'assistenza in disegno a fumetti al video; Yee Hui Yeo per preziosa la discussione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), la borsa di studio Dr. Walter Szeto Memorial (HLT), borsa di studio Fulbright 007-2009 (HLT), Life Science Research Foundation Fellowship (HLT), NIH concede NS037402 (JMH) e NS083373 (JMH), e del Comitato Grants Università di Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang è un Shurl e Kay Curci Foundation Fellow della Research Foundation Life Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LSM780 confocal microscopy Carl Zeiss
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0-14-C
Transparent CultFoi Carl Zeiss 000000-1116-084
CO2 independent medium Life Technologies 18045-088
CellTracker Life Technologies C34552
Mitotracker Red CMXRos Life Technologies M-7512
Hoechst 33342 Life Technologies H1399
Fluorescently labeled annexin V Biovision K201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
  3. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  4. Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
  5. Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
  6. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
  7. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
  8. Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
  9. Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
  10. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  11. Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  14. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
  15. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
  16. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  17. Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
  18. Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
  19. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  20. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
  21. Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
  22. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
  23. Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
  24. Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
  25. Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
  27. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
  28. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
  29. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
  30. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
  31. Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
  32. Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
  33. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
  34. Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
  35. Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
  36. Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
  37. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
  38. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  40. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  41. Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
  42. Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680 (2013).
  43. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
  44. Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
  45. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
  46. Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
  47. Bertrand, R., Solary, E., O'Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
  48. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
  49. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
  50. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
  51. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
  52. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics