Imaging Intracellulært Ca

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jiang, R., Haustein, M. D., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (93), e51972, doi:10.3791/51972 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Astrocytter er allestedsnærværende og rigelige gliaceller i hjernen. Det er veletableret, at astrocytter tjene afgørende støtte og homeostatiske roller, herunder buffering af K + koncentration i det ekstracellulære rum, optagelse af neurotransmittere samt give næringsstoffer. Seneste undersøgelser viser imidlertid, at de også vise [Ca2 +] i signaler, der opstår spontant og er steget med neuronal aktivitet 1. Eksistensen af astrocyt [Ca 2+] i signalering i stigende grad blevet anset for at udløse deres kommunikation med neuroner, og som sådan er blevet fortolket som en form for "Ca 2+ uro" i astrocytter. De tilgængelige data over de sidste to årtier antyder to indstillinger, hvor astrocytter og neuroner kan kommunikere, måske i en tovejs måde. Første, astrocytter ofte reagere med en stigning i [Ca2 +] i, når den aktiveres af neurotransmittere ogneuromodulatorer frigives fra neuroner 2. Sekund, [Ca2 +] i stigninger i astrocytter forårsage frigivelse af signalmolekyler fra astrocytter, som igen kan påvirke neuroner og blodkar. Meget tyder på, at molekyler frigives fra astrocytter føre til ændringer i de funktioner af synapser, kredsløb og i sidste ende adfærd 3-5 via astrocyt-til-neuron signalering. Dette er dog fortsat en rivende udvikling forskningsområde, og det er blevet fremført, at en bedre og detaljeret forståelse af astrocyt [Ca 2+] i er nødvendig for at løse nogle af de nuværende usikkerheder 6.

I tidligere arbejde, blev det påvist, at isætning af organiske Ca 2+ indikatorfarvestoffer i astrocytter undlader at detektere [Ca 2+] i signaler i hele astrocytter i kultur og in situ 7-10. Disse resultater er blevet diskuteret af os og andre 6,11,12. Den emerging billede er, at [Ca 2+] i signaler i astrocyt processer (f.eks, grene og branchlets), som er de primære steder for interaktioner med neuroner og blodkar, er sjældent blevet undersøgt i detaljer. For nylig, anvendelse af genetisk indkodede calcium indikatorer (GECIs), såsom cytosoliske GCaMP3, GCaMP5G og GCaMP6 og plasmamembranen tøjrede versioner (f.eks Lck-GCaMP3) har muliggjort studiet af [Ca2 +] i signaler i små rum i astrocytter sådanne som tynde processer, nær plasmamembranen og i hele områder 7,8. Men GECIs har en ulempe i forhold organiske Ca2 + indikatorfarvestoffer og det er kravet om genetiske metoder til at levere de kodende gener selektivt til astrocytter in vivo i perioder på uger til GECIs at være passende udtrykt. In vivo-ekspression opnås typisk ved anvendelse af transgene mus, knock-in-mus eller med virus baseret levering approaches. I den foreliggende JOVE artikel rapporterer vi metoder og procedurer, der anvendes til at levere GECIs til striatale astrocytter hjælp adenoassocierede vira. Vi fokuserer på CYTO-GCaMP3 som et eksempel, men det samme grundlæggende procedure virker for alle andre GECI eller fluorescerende protein baseret reporter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle animalske protokoller var i overensstemmelse med de amerikanske National Institutes of Health Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på UCLA.

1.1) Forbered Mikropipette og AAV2 / 5 Virus Loading

  1. Brug fine borosilikatglas mikropipetter til indsprøjtning af virus. Træk mikropipetten anvendelse af en to-trins trække program med en lodret aftrækker. Smig pipetten i en vinkel på 40 ° ved hjælp af en pipette mølle. Den pipette, der er ideel til brug, har en spids diameter på 20-40 um og et skaft længde af 6 - 7 mm. Autoklaver pipette og kirurgiske instrumenter. Boret steriliseres ved aftørring med 70% ethanol.
  2. Opbevar virus AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 x 10 13 gc / ml) ved -80 ° C i 10 pi alikvoter. Lige før operation, tage ud portioner ud af fryseren og opbevar på is, indtil der anvendes til fyldning the mikropipette.
  3. Fyld mikropipette med virus ved hjælp af en sprøjtepumpe. Stramt forbinde den ene ende af et stykke slange, gennem en passende størrelse slange kompressionsarmaturet til en glassprøjte med en forstærket stemplet. Fastgør autoklaveret mikropipette til den anden ende af det stykke af slangen gennem en passende størrelse aftagelig nål kompressionsbeslag.
  4. Før indlæsning af viral vektor, fjerne luftbobler fra pumpesystemet, herunder slanger, sprøjte og mikropipette ved at fylde systemet med mineralolie farvet med Sudan red IV (~ 1 mg / 50 ml) i en 1 ml sprøjte med en nål (27 G ).
  5. Placere et rent stykke parafilm under glasmikropipette og dispensere 5 - 10 pi af den virale vektor på parafilm.
  6. Suge den virale vektor ved at bevæge stemplet i sprøjten tilbage på 0,5 ul / min, og markere grænsen mellem vektor og olie på glaspipette.

1.2) Anæstesi, hår klippe, HEAD Fiksering og Forberedelse til kraniotomi

  1. Sætte en mus (P49-63, C57BL / 6) i kammeret fyldt med N2 O og O 2 og 5% isofluran. Vurdere anæstesidybden ved tab af målrettet bevægelse og en langsommere respirationsfrekvens (~ 60-90 / min). Klip håret på hovedet, når musen bedøvet.
  2. Monter musen i stereotaktisk ramme, med sit hoved sikret ved stump øre barer og dens næse placeret i en anæstesi og ventilationssystem. Opretholde uafbrudt isofluran 2 - 3%. Påfør kunstige tårer salve til begge øjne, da mus mister deres blink refleks under anæstesi.
  3. Administrer 0,05 ml af buprenorphin (0,1 mg / ml) ved subkutan injektion til smertelindring.
  4. Ren kirurgiske område med 10% povidon-iod og 70% alkohol tre gange, skiftevis mellem de to opløsninger og startende med povidon-iod. Starte forfra og tør mod bagsiden for at fjerne eventuelle allerede skåret hår.
  5. Lav en incision i huden på toppen of hovedet, der begynder mellem øjnene og slutter mellem ørerne.

1.3) kraniotomi og Mikroinjektioner

  1. Fjern periosteum ved at stryge med en vatpind og tør overfladen af ​​kraniet med dental vatkugler. Sæt et mærke omkring injektionsstedet, og bor rundt om kanten af ​​varemærket med en lille stål grat drevet af en høj hastighed boremaskine.
  2. Fjern ben og rengør overfladen med saltvand.
  3. Anbring pipetten ind i den venstre dorsolaterale striatum med følgende koordinater (mm): anterior-posterior +0,8, mediale-laterale: +2,0, dorsal-ventral fra pial overflade: -2.4 13. Bemærk, at disse koordinater betyder, at spidsen af mikroinjektion nålen sidder lige over dorsolaterale striatum (figur 1A, B), hvilket betyder, at det kun lidt trænger inden for denne kerne. Undgå at beskadige blodkar. Hvis pipetten sker for at være ret på et blodkar, let justerekoordinater ved ~ 0,1-0,2 mm.
  4. Start injektion med injektion omkostninger på 0,2 ul / min, og typisk injiceres 1 til 1,5 pi virus.
  5. Lad pipetten på plads efter injektion i 10 min, og derefter trække pipette langsomt.
  6. Afslut ved at lukke operationssåret med kontinuerlig sutur ekstern nylonsutur.

1.4) Recovery

  1. Sæt musen i et rent bur på en varmepude i 24 timer. Må ikke returnere en mus, der har gennemgået kirurgi til selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt. Efterlad ikke mus uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje.
  2. Tilføj Trimethoprim Sulfamethoxiazole (5 ml pr 500 ml vand, der indeholder 40 mg trimethoprim og 200 mg sulfamethoxiazole) i vandet i en uge. Administrere Buprenorphin to gange om dagen i op til 3 dage efter operationen.
  3. Bevar musen på en 12 timers lys-mørke-cyklus, fodres og vandes dagligt, ennd er vægtet gang om dagen op til 3 dage efter operationen. I disse 3 dage, er enhver mus med et tab på mere end 10% af kropsvægten betragtes som kompromitteret, og vil blive aflivet i stedet for at blive underkastet forsøg.
  4. Separat, ændre musebur to gange om ugen, og overvåge for den almene sundhed mindst en gang om dagen. Typisk mus anvendes inden for 2 - 3 uger efter stereotaktisk mikroinjektioner.

2. Akut Brain Slice Forberedelse til Confocal Ca 2+ Imaging

2.1) Udarbejdelse af Cutting og Recording Solutions.

  1. Forbered skære opløsning omfattende (mM): 194 saccharose, 30 NaCl, 4,5 KCI, 10 D-glucose, 1 MgCl2, 1,2 NaH 2 PO 4 og 26 NaHCO3, mættet med 95% O2 og 5% CO2.
  2. Forbered optagelse opløsning omfattende (mM): 124 NaCl, 4,5 KCI, 1 MgCl2, 10 D-glucose, 2 CaCl2, 1,2 NaH 2 PO 4 NaHCO3; pH 7,3-7,4, 290-295 mOsm, mættet med 95% O2 og 5% CO2. Fyld hjernen skive holder bæger med optagelse løsning, og holde det på 34 ° C.

2.2) Slicing

  1. To til tre uger efter stereotaksiske mikroinjektioner, dybt og terminalt bedøver musen, og derefter halshugge det.
  2. Uddrag hjernen, og brug en kniv til at fjerne den uinjicerede højre hjernehalvdel, og monter den venstre onto vibratome skuffen med superlim. Fyld vibratome bakke med iskold skæring buffer, og holde mætte den med 95% O2 og 5% CO2.
  3. Skær koronale eller sagittale striatale hjerneskiver på 300 um tykkelse. Normalt 4. - 5. koronalt, eller 6 - kan 7 sagittale striatale skiver skal indsamles.
  4. Overfør skiverne til skive holder bægeret opvarmes ved 34 ° C, og holde dem der i 30 min før opbevaring dem ved stuetemperatur til efterfølgende RECORDIng.
  5. Inkubér hjerneskiver i iltet optagelse buffer ved stuetemperatur i mindst 30 min før [Ca2 +] i billeddannelse.

3. Immunhistokemi (IHC)

  1. To uger efter virus injektion perfundere mus transkardialt med PBS efterfulgt af 10% formalin i PBS.
  2. Fjerne, post-fix natten over og cryoprotect hjernen i pufret 30% sucrose i mindst 2 dage.
  3. Forbered 40 um snit ved hjælp af en kryostat mikrotom.
  4. Skyl §§ 3 gange med PBS ved 10 min interval.
  5. Inkuber sektioner i 1 time i PBS med 10% normalt gedeserum og 0,5% Triton X-100.
  6. Inkuber sektioner natten over ved 4 ° C i primært antistof fremstillet i PBS med 0,5% Triton X-100. De primære antistoffer blev anvendt, var som følger: chicken anti-GFP 1: 1.000, muse-anti-S100β 1: 400, muse-anti-NeuN 1: 600, muse-anti-glutaminsyntetase 1: 300.
  7. Skyl §§ 3 gange med PBS ved 10 mi intervaller.
  8. Inkuber sektioner med de sekundære antistoffer fremstillet i PBS med 10% normalt gedeserum i 2 timer ved stuetemperatur. De sekundære antistoffer var som følger: gede-anti-muse Alexa546 1: 500, gede-anti-kylling Alexa488 1: 500.
  9. Monter afsnittene om objektglas, tørre og påfør flere dråber af antifade montering medium, derefter langsomt dække sektioner med et dækglas. Opbevar dias ved 4 ° C.
  10. Tag billeder på et konfokalt mikroskop med en 40X olieimmersion linse med en numerisk apertur på 1,3.

4. Confocal [Ca 2+] i Imaging

BEMÆRK: [Ca 2+] i billeddannelse blev udført ved anvendelse af et konfokalt mikroskop med en 40X nedsænkning i vand objektiv med en numerisk apertur på 0,8.

  1. Mellem 1 og 5 timer efter udskæring, sted skive i optagelsen kammer og superfuse med iltet optagelse buffer ved stuetemperatur med flowhastighed på 1 - 2 ml permin. Derefter placere en platin harpe med nylonstrenge på toppen af ​​skive for at minimere bevægelse under eksperimentet.
  2. Visualiser og find den dorsale striatum med lyse felt luminescens under en 10X nedsænkning i vand mål.
  3. Skift til 40X nedsænkning i vand objektiv, og tænd 488 nm linje Argon laser. Ved at ændre fokusplan, finde celler ligger omkring 20 um under skive overflade, viser basal fluorescens i Soma, grene og branchlets. Bemærke, sædvanligvis kompromitterede celler vise fluorescens niveau over gennemsnittet, hvilket bør undgås.
  4. Brug 'ramme scan "-tilstand for at starte scanningen. Normalt laser intensitet justeret til 0,5 - 5% af den maksimale output er tilstrækkeligt til billede [Ca2 +] i med cyto-GCaMP3. Til overvågning [Ca2 +] i dynamik i hele området i astrocytter, den 'ramme scan' med en scanning hastighed på 1 sek pr ramme eller hurtigere er recommended, men dette skal besluttes afhængigt af eksperimentet pågældende.
  5. Hvis det er nødvendigt, at billede [Ca 2+] i i processer, bruge digital forstørrelse på 2 - 3 i fold til at overvåge 1 - 2 astrocytter i hele synsfeltet.
  6. For at undgå mættede pixels under optagelsen, skal du bruge 'Hi-Lo' opslag mode til pseudo-cellerne. Start altid med et "pilot-optagelse" i ca. 5 min, for at teste, om rød farve som tegn på mætning. Hvis ja, sænke laser udgangseffekt, eller sænke PMT / Gain / offset værdier og udføre en anden pilot optagelse for at teste pixelværdier er i den ikke mættet rækkevidde. Typisk de kombinerede parametre, der anvendes til billeddannelse astrocyt [Ca 2+] i i striatum er som følger: laser udgangseffekt 0,5-5% (10 mW), PMT 550-650 volt, Gain 2,0 - 3,5X, og offset 0 - 5%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For astrocyt specifik ekspression af cyto-GCaMP3 i striatum, anvendte vi adeno-associeret virus (AAV) i 5 serotype og GFAP GfaABC 1 D-promotoren (figur 1A), som tidligere har vist sig at drive robust GCaMP3 og reportergen ekspression i hippocampale og corticale astrocytter 8,14. To uger efter virus mikroinjektion i musen striatum, blev mus (ca. 10 uger gamle) perfunderes og IHC blev udført på tynde hjernesnit at evaluere cyto-GCaMP3 ekspression i striatum (figur 1B). Vi har registreret CYTO-GCaMP3 hjælp GFP antistoffer, og også farves skiverne med en kendt astrocyt markør, S100β. CYTO-GCaMP3 ekspression blev kun fundet i S100β positive celler. Ingen ekspression blev fundet i neuroner visualiseret med NeuN (figur 2A og 2B), hvilket tyder astrocyt specifik ekspression. Vigtigere, blev cyto-GCaMP3 ekspression påvist i ~ 60% af S100β positive celler (Fifigur 2C).

Astrocytter reagere på hjernens fornærmelser såsom personskade, iskæmi og infektion ved at vise ændringer, der er blevet kendt som astrocyt reaktionsevne, som repræsenterer et spektrum af mulige ændringer fra mild til svær 15. Vi søgte at vurdere, om virus mikroinjektion forårsagede åbenlys astrocyt reaktivitet. Det blev tidligere vist, at reducerede ekspressionsniveauer af glutaminsynthetase (GS) var forbundet med de reaktive astrocytter 16,17. Derfor blev GS ekspression i striatum af WT og virus injicerede mus sammenlignet. Vi fandt ingen signifikante ændringer i GS-ekspression i striatale astrocytter efter virus injektion (figur 3A - C), hvilket indikerer ingen åbenlys astrocyt reaktivitet ved hjælp af GS niveauer som en metrik. Denne generelle tilgang kunne udvides i fremtiden arbejde for at evaluere astrocyt reaktivitet ved hjælp af andre markører for reaktivitet. Bemærk dog, at GFAP niveauer, der ikke kan være en passende måde at måle reaktivitet i striatal astrocytter, fordi GFAP ikke udtrykkes på påviselige niveauer i de fleste striatale astrocytter under basale betingelser 18. Sammenfattende ved hjælp IHC vi konkludere cyto-GCaMP3 ekspression var robust og specifik for astrocytter i striatum, og at virus injektion forårsagede ikke astrocyt reaktivitet som vurderet ved GS ekspression niveau ændringer.

Vi næste fremstillet akutte hjerneskiver fra virus injicerede mus billedet [Ca2 +] i i striatale astrocytter. Akutte 300 um tykke sagittale eller koronale skiver blev fremstillet, og efter en periode med bedring skiver blev anbragt i en optagelse kammer på et konfokalt mikroskop for [Ca 2+] i billeddannelse ved hjælp af 488 nm linien af en Argon laser. Striatale astrocytter udtrykker cyto-GCaMP3 let kunne identificeres i de fleste (sædvanligvis alle) af de striatale skiver (~ 6-7 skiver per mus), som de viste synlig grøn fluorescens i celler med klart busket morfologi (figur 4 figur 4A; mindst 10 astrocytter udviser CYTO-GCaMP3 kunne afbildes og er plottet i figur 4A som områder af interesse (ROI). Højere forstørrelse billeddannelse med en yderligere digital zoom på 2,0 - 3,0 var nødvendigt at identificere enkelte astrocytter (figur 4B). Under disse omstændigheder blev hele astrocyt områder afsløret ved cyto-GCaMP3 udtryk, som vist i figur 4B. Spontane Ca2 + signaler blev let måles i somata samt i grene og branchlets af astrocytter 6.

Figur 1
Figur 1: Viral levering af GECIs (f.eks cyto-GCaMP3) af AAV2 / 5 i den voksne mus striatum. A. Skematisk illustrerer protokollen for AAV2 / 5 mikroinjektioner ind dorsolaterale striatum.B. Viser den omtrentlige position af mikroinjektion nålen i forhold til striatum og koordinaterne anvendes til stereotaksiske injektioner. Billedet af en Nissl-farvet skive i panel B blev hentet fra ALLEN BRAIN ATLAS.

Figur 2
Figur 2: Cyto-GCaMP3 ekspression var specifik for striatale astrocytter. A - B. Repræsentative billeder, der viser, at cyto-GCaMP3 ekspression colocalizes med en markør for astrocytter (S100β) (B), men ikke med en markør for neuroner (NeuN) (A) C. Oversigt søjlediagram for co-lokaliseringstoppe eksperimenter som de viste. i A og B.

Figur 3
Figur 3: Cyto-GCaMP3 udtryk indenfor striatale astrocytter ikke forårsage ændringer i ekspressionen af GS.A - B. Repræsentative billeder af GCaMP3 og GS IHC fra mus, der havde modtaget AAV2 / 5 for GCaMP3. Billeder til kontrol ikke injicerede mus er også vist. C. Søjlediagram opsummerer resultaterne fra forsøg, såsom dem i A og B (ns ikke indicerer en betydelig anvendelse af en uparret Students t-test, p <0,05).

Figur 4
Figur 4: Repræsentative eksempler på [Ca2 +] i signaler optaget fra striatale astrocytter med CYTO-GCaMP3. A. En fladtrykt Z-stack billede, der viser 10 astrocytter (nummereret 1 - 10) .Den spor under show [Ca 2+] i signaler optaget over 5 min fra de 10 celler, der er vist i en B. en flad og zoomes ind z. -stack billede for en enkelt astrocyte.The spor under show [Ca 2+] isignaler optaget over 5 minutter for den enkelte celle, der er vist i B.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De heri beskrevne fremgangsmåder har givet os mulighed for at udtrykke cyto-GCaMP3 i striatale astrocytter in vivo til efterfølgende [Ca 2+] i billeddannelse in situ. Denne metode har fordele i forhold til at bruge transgene eller knock-i mus, herunder robust udtryk for den målrettede protein, hurtighed og fleksibilitet i eksperimentel implementering og anatomisk specificitet. Ekspressionen af ​​GCaMP3 hjælp AAV2 / 5 blev fundet at være specifik og robust. Kombinationen af GFAP GfaABC 1 D promotor med AAV af serotype 5 er afgørende for at opnå specificitet. En begrænsning af den her beskrevne teknik er, at virus infektion og kirurgi procedure kan forårsage astrocyt reaktivitet, især med høj titer virus 19. Vigtigere er det, i den aktuelle undersøgelse, AAV2 / 5 mikroinjektioner med en relativ lav titer forårsagede ikke fald i GS der har været forbundet med astrocyt reaktivitet 19. Er blevet rapporteret lignende kontrolforanstaltninger for Hippocampal astrocytter 8. Det er imidlertid vigtigt at understrege nødvendigheden af disse kontroller for hvert område i hjernen, der skal undersøges, ikke mindst fordi astrocytter er heterogene 20, og fordi de sandsynligvis forskellige funktioner i forskellige regioner af hjernen.

En af de vigtige faktorer, der kan påvirke robustheden af ​​den målrettede genekspression ved hjælp af virus mikroinjektion er koordinaterne i brug, som varierer mellem forskellige musestammer og ændringer over udviklingen af ​​dyrene. Kun C57BL / 6 mus af ~ 8 uger blev anvendt i hele denne undersøgelse. Det er blevet vist også at viral ekspression af GFP i striatale neuroner og astrocytter i rotter kunne påvises 4 dage efter injektion, nået et plateau med 2 - 4 uger efter injektion, og derefter forblev stabile i 9 måneder efter injektionen 21. Tidsforløbet for CYTO-GCaMP3 udtryk er ikke præcist fastlagt her, men mindst to uger for virus udtryk eranbefales.

Metoden med AAV2 / 5-medieret ekspression af GECIs i striatale astrocytter kan nu anvendes til bedre at forstå astrocyt [Ca 2+] i signalering i striatum. Specifikt CYTO-GCaMP3 udtryk niveau er tilstrækkeligt højt til at tillade billeddannelse af [Ca2 +] i signaler i små bestande af astrocytter (~ 10 celler) og inden for hele områder af enlige astrocytter. Den detaljerede analyse af [Ca2 +] i signalerne er stadig i gang, men til dato [Ca 2+], er blevet opdaget I signaler fra distale processer så vidt ~ 50 um væk fra soma (Figur 4). Detaljerede forsøg med astrocyt [Ca2 +] i signaler og deres korrelative og forårsagende funktioner i striatum er mulige. I fremtiden raffinerede metoder (dvs. promotorer) er nødvendige for at levere GECIs genetisk definerede populationer af astrocytter, så man kanudforske calcium signalering i forskellige populationer af astrocytter 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgements

Størstedelen af ​​arbejdet og det involverede personale blev støttet af NIH tilskud NS060677 og dels ved tilskud fra NIH MH099559 og MH104069 (til BSK). Noget af arbejdet blev også støttet af CHDI Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Syringe Pump Harvard Apparatus 704506
Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Narishige PC-10
Micropipette grinder Narishige EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 Addgene 44331 a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
1 ml syringe BD 309628
syringe needle BD 305109
AAV2/5 virus UPenn vector core NA
Sudan red IV Sigma-Aldrich 67386
Mineral oil CVS Pharmacy 152355
Cryostat Leica CM3050 S
Stereotaxic instrument David Kopf Instruments 900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit FOREDOM K.1070
Paraformaldehyde Santa cruz biotechnology sc-281692
Super Glue Krazy®Glue KG925
Microslicer Ted Pella DTK-Zero 1
Confocal microscopes Olympus FV300 and FV1000
Normal goat serum Vector S-1000
chicken anti-GFP Abcam ab13970
mouse anti-s100β Sigma-Aldrich S2532
mouse anti-NeuN Millipore MAB377
mouse anti-glutamine synthetase Millipore MAB302
goat anti-mouse-Alexa546 Invitrogen A11003
goat anti-chicken-Alexa488 Invitrogen A11039
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5J
Mounting Medium Vector H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
  2. Khakh, B. S., North, R. A. Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS. Neuron. 76, 51-69 (2012).
  3. Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
  4. Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice. J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).
  5. Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release. J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).
  6. Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains. Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).
  7. Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).
  8. Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).
  9. Shigetomi, E., Khakh, B. S. Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes. J Vis Exp. 26, (2009).
  10. Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).
  11. Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).
  12. Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo. Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).
  13. Paxinos, G., Franklin, K. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press. Waltham, MA. (2012).
  14. Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo. Nat Commun. 5, 3262 (2014).
  15. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).
  16. Eid, T., et al. Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy. Lancet. 363, 28-37 (2004).
  17. Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).
  18. Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice. Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).
  19. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).
  20. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
  21. Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat. Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).

Comments

1 Comment

  1. What kind of drug you use to anesthetize the mouse before decapitation? Thank´s

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2016 - 6:27 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics