Imaging intracelular de Ca
1Department of Physiology, University of California Los Angeles, 2Department of Neurobiology, University of California Los Angeles

Neuroscience

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Jiang, R., Haustein, M. D., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (93), e51972, doi:10.3791/51972 (2014).

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Abstract

Introduction

Los astrocitos son células gliales ubicuas y abundantes del cerebro. Está bien establecido que los astrocitos sirven de soporte vital y las funciones homeostáticas que incluyen el almacenamiento en búfer de concentración de K + en el espacio extracelular, la captación de neurotransmisores, así como proporcionar nutrientes. Sin embargo, estudios recientes muestran que también muestran [Ca 2 +] i señales, que se producen de forma espontánea y se incrementan por la actividad neuronal 1. La existencia de los astrocitos [Ca 2 +] i de señalización se ha pensado cada vez más para activar su comunicación con las neuronas, y como tal se ha interpretado como una forma de "Ca 2+ excitabilidad" dentro de los astrocitos. Los datos disponibles en las últimas dos décadas sugieren dos escenarios en los que los astrocitos y las neuronas pueden comunicarse, tal vez de una manera bidireccional. En primer lugar, los astrocitos a menudo responden con un aumento de la [Ca 2 +] i cuando se activa mediante neurotransmisores yneuromoduladores liberados por las neuronas 2. En segundo lugar, la [Ca 2 +] i se incrementa dentro de los astrocitos provoca la liberación de moléculas de señalización de los astrocitos que a su vez puede afectar a las neuronas y los vasos sanguíneos. La evidencia sugiere que las moléculas liberadas a partir de astrocitos conducen a cambios en las funciones de las sinapsis, circuitos y en última instancia el comportamiento de 3-5 a través de la señalización de astrocitos a neurona. Sin embargo, esto sigue siendo un área de investigación en rápido desarrollo, y se ha argumentado que una comprensión mejor y más detallada de los astrocitos [Ca 2 +] i es necesaria para resolver algunas de las incertidumbres actuales 6.

En trabajos anteriores, se demostró que la carga a granel de orgánicos de Ca 2+ colorantes indicadores en los astrocitos no puede detectar con fiabilidad [Ca 2 +] i señales dentro de los astrocitos en la totalidad de la cultura e in situ 7-10. Estos resultados han sido discutidos por nosotros y otros 6,11,12. El Emerging imagen es que el [Ca 2 +] i señales dentro de los procesos de astrocitos (por ejemplo, ramas y ramillas), que son los sitios principales para la interacción con las neuronas y los vasos sanguíneos, rara vez han sido exploradas en detalle. Recientemente, el uso de indicadores de calcio codificados genéticamente (Gecis) tales como GCaMP3 citosólica, GCaMP5G y GCaMP6 y membrana plasmática versiones atados (por ejemplo, Lck-GCaMP3) ha permitido el estudio de la [Ca2 +] i en las señales de pequeños compartimentos de astrocitos tales procesos como delgadas, cerca de la membrana plasmática y dentro de territorios enteros 7,8. Sin embargo, tienen una desventaja Gecis sobre orgánicos Ca 2+ colorantes indicadores y que es el requisito de métodos genéticos para entregar los genes que codifican selectivamente a los astrocitos in vivo durante períodos de semanas para el Gecis sea apropiadamente expresado. Expresión in vivo se logra típicamente usando ratones transgénicos, knock-en ratones o con la entrega de aplicaciones a base de viruscucarachas. En el presente artículo JoVE informamos métodos y procedimientos empleados para entregar Gecis a los astrocitos del cuerpo estriado utilizando virus adeno-asociado. Nos centramos en cito-GCaMP3 como un ejemplo, pero el mismo procedimiento básico funciona para cualquier otra GECI o fluorescente reportero base de proteínas.

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Protocol

Todos los animales protocolos fueron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la UCLA.

1.1) Preparar Micropipeta y AAV2 / 5 Virus Cargando

  1. Utilice micropipetas de vidrio de borosilicato finas para la inyección del virus. Tire de la micropipeta utilizando un programa tirando de dos pasos con un extractor vertical. Bevel la pipeta en un ángulo de 40 ° utilizando un molinillo de pipeta. La pipeta que es ideal para su uso tendrá un diámetro de punta de 20 - 40 micras y una longitud de vástago de 6-7 mm. Autoclave la pipeta y los instrumentos quirúrgicos. El taladro se esteriliza por frotándolos con etanol al 70%.
  2. Guarde el virus AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 x 10 13 gc / ml), a -80 ° C en 10 ml de alícuotas. Justo antes de la cirugía, sacar las alícuotas del congelador y almacenar en hielo hasta que se utilizaron para llenar ªe micropipeta.
  3. Llene la micropipeta con virus usando una bomba de jeringa. Conectar firmemente un extremo de un trozo de tubo, a través de un tubo de tamaño apropiado de compresión apropiado, a una jeringa de vidrio con un émbolo reforzada. Coloque la micropipeta autoclave hasta el otro extremo de la pieza de tubería a través de una compresión de la aguja extraíble de tamaño apropiado apropiado.
  4. Antes de cargar el vector viral, eliminar las burbujas de aire del sistema de bombeo incluyendo tubo, jeringa y micropipeta por llenar el sistema con aceite mineral coloreado con rojo Sudán IV (~ 1 mg / 50 ml) en una jeringa de 1 ml con una aguja (27 G ).
  5. Coloque un trozo limpio de Parafilm bajo la micropipeta de vidrio, y dispensar de 5 - 10 l de la vector viral en el Parafilm.
  6. Aspirar el vector viral moviendo el émbolo de la jeringa hacia atrás a 0,5 l / min, y marcar el límite entre el vector y el aceite en la pipeta de vidrio.

1.2) La anestesia, corte de pelo, Head Fijación y preparación por una craneotomía

  1. Poner un ratón (P49-63, C57BL / 6) en la cámara llena de N 2 O y O 2, y 5% de isoflurano. Evaluar la profundidad de la anestesia por pérdida de movimiento intencional y un ritmo respiratorio más lento (~ 60-90 / min). Cortar el pelo en la cabeza cuando se anestesia el ratón.
  2. Coloque el ratón en el marco estereotáxico, con la cabeza protegida por barras de oído contundentes y su nariz colocados en un sistema de anestesia y ventilación. Mantener isoflurano continua a 2 - 3%. Aplicar las lágrimas artificiales pomada para ambos ojos ya que los ratones pierden su reflejo de parpadeo bajo anestesia.
  3. Administrar 0,05 ml de buprenorfina (0,1 mg / ml) mediante inyección subcutánea para el alivio del dolor.
  4. Área quirúrgica limpia con 10% de povidona yodada y alcohol al 70% tres veces, alternando entre las dos soluciones y comenzando con povidona yodada. Comience desde la parte frontal y limpie hacia la parte posterior para eliminar los pelos ya cortadas.
  5. Hacer una incisión en la piel en la parte superior of la cabeza que comienza entre los ojos y termina entre las orejas.

1.3) craneotomía y microinyecciones

  1. Retire el periostio al golpear con un hisopo de algodón y luego seque la superficie del cráneo con bolas de algodón dentales. Hacer una marca alrededor del sitio de inyección, y perforar alrededor del borde de la marca usando una pequeña rebaba de acero accionado por un taladro de alta velocidad.
  2. Retire el hueso y limpiar la superficie con solución salina.
  3. Coloque la pipeta en el dorsal izquierdo lateral estriado con las siguientes coordenadas (mm): 0.8 anterior-posterior, medial-lateral: 2.0, dorsal-ventral de la superficie pial: -2.4 13. Tenga en cuenta que estas coordenadas significan que la punta de la aguja de microinyección se encuentra justo por encima del cuerpo estriado dorsolateral (Figura 1A, B), lo que significa que penetra sólo ligeramente dentro de este núcleo. Evitar los vasos sanguíneos perjudiciales. Si la pipeta pasa a ser justo en un vaso sanguíneo, ajustar ligeramente elcoordina por ~ 0,1 a 0,2 mm.
  4. Iniciar la inyección con velocidad de inyección fijada en 0,2 l / min, y típicamente inyectar de 1 a 1,5 l de virus.
  5. Deja la pipeta en el lugar después de la inyección durante 10 min, y luego retirar la pipeta lentamente.
  6. Termine por el cierre de la herida quirúrgica con una sutura continua de sutura de nylon externa.

1.4) Recuperación

  1. Ponga el ratón en una jaula limpia sobre una almohadilla caliente durante 24 horas. No devuelva un ratón que ha sido sometido a cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente. No deje el ratón sin atención hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener el decúbito esternal.
  2. Añadir Trimetoprim Sulfamethoxiazole (5 ml por 500 ml de agua, que contienen 40 mg de trimetoprim y 200 mg sulfamethoxiazole) en el agua durante una semana. Administrar buprenorfina dos veces al día durante un máximo de 3 días después de la cirugía.
  3. Mantener el ratón en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas, alimentado y regado diario, unnd se pondera una vez por día hasta 3 días después de la cirugía. En estos 3 días, cualquier ratón con una pérdida de más del 10% del peso corporal se considera como comprometida, y se practicó la eutanasia en lugar de ser sometida a experimentación.
  4. Por separado, cambiar la jaula del ratón dos veces por semana, y vigilar para la salud general al menos una vez por día. Por lo general, el ratón se utiliza dentro de 2 - 3 semanas después de las microinyecciones estereotáxica.

2. aguda del cerebro rebanada preparación para confocal Ca 2+ Imaging

2.1) Preparación de soluciones de grabación y corte.

  1. Preparar la solución que comprende (mM) de corte: 194 sacarosa, 30 NaCl, 4,5 KCl, 10 D-glucosa, 1 MgCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4, 26 y NaHCO 3, saturado con 95% O 2 y 5% de CO 2.
  2. Preparar la solución de grabación que comprende (mM): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1 MgCl 2, 10 D-glucosa, 2 CaCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4 NaHCO3; pH 7.3 a 7.4, 290 a 295 mOsm, saturada con 95% de O2 y 5% de CO 2. Llene el vaso de precipitados de cortes de cerebro con la celebración de solución de grabación, y la mantendrá a 34 ° C.

2.2) El rebanar

  1. De dos a tres semanas después de la microinyección estereotáxica, profunda y terminal anestesiar el ratón, y luego decapitar a ella.
  2. Extraer el cerebro, y el uso de una cuchilla para eliminar el hemisferio derecho no inyectado, y montar el uno a la izquierda en la bandeja vibratome utilizando pegamento. Llenar la bandeja vibratome con tampón de hielo de corte en frío, y mantener la saturación con 95% de O2 y 5% de CO 2.
  3. Cortar rodajas de cerebro del cuerpo estriado coronal o sagital a 300 micras de espesor. Por lo general, 4 - 5 coronal, o 6 - 7 rebanadas estriatales sagitales se pueden recoger.
  4. Transferir las rebanadas al vaso de precipitados con rodaja calentado a 34 ° C, y mantenerlos allí durante 30 minutos antes de guardarlos a temperatura ambiente para su posterior recording.
  5. Se incuban las rodajas de cerebro en memoria intermedia de grabación oxigenada a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos antes de la [Ca 2 +] i de imágenes.

3. La inmunohistoquímica (IHC)

  1. Dos semanas después de la inyección de virus, perfundir el ratón transcardially con PBS seguido por 10% de formalina en PBS.
  2. Retire, posterior a fijar durante la noche, y cryoprotect el cerebro en tampón sacarosa al 30% por lo menos durante 2 días.
  3. Preparar 40 micras secciones usando un microtomo criostato.
  4. Enjuague las secciones 3 veces con PBS a 10 minutos de intervalo.
  5. Incubar las secciones durante 1 hora en PBS con 10% de suero normal de cabra y con 0,5% de Triton X-100.
  6. Incubar las secciones durante la noche a 4 ° C en anticuerpo primario preparado en PBS con 0,5% de Triton X-100. Los anticuerpos primarios utilizados fueron los siguientes: pollo anti-GFP 1: 1000, de ratón anti-S100β 1: 400, de ratón anti-NeuN 1: 600, ratón anti-sintetasa glutamina 1: 300.
  7. Enjuague las secciones 3 veces con PBS a 10 men intervalos.
  8. Incubar las secciones con anticuerpos secundarios preparados en PBS con 10% de suero normal de cabra durante 2 hr a temperatura ambiente. Los segundos anticuerpos fueron los siguientes: de cabra anti-ratón Alexa546 1: 500, de cabra anti-pollo Alexa488 1: 500.
  9. Monte las secciones sobre portaobjetos de vidrio, secos y aplicar varias gotas de Antifade medio de montaje, a continuación, cubrir lentamente las secciones con un cubreobjetos de vidrio. Guarde las diapositivas a 4 ° C.
  10. Tomar imágenes en un microscopio confocal con una lente de inmersión en aceite 40X con una apertura numérica de 1,3.

4. confocal [Ca 2 +] i Imaging

NOTA: [Ca2 +] i la formación de imágenes se realizó utilizando un microscopio confocal con una lente objetivo de 40X de inmersión en agua con una apertura numérica de 0,8.

  1. Entre 1 y 5 horas después de cortar, lugar rebanada en la cámara de grabación y superfuse con tampón de grabación oxigenada a temperatura ambiente con velocidad de flujo de 1 - 2 ml pormin. A continuación, coloque un arpa de platino con cuerdas de nylon en la parte superior de la rebanada para minimizar el movimiento durante el experimento.
  2. Visualizar y localizar el cuerpo estriado dorsal con brillante luminiscencia campo bajo un objetivo de inmersión en agua 10 veces.
  3. Cambie a la lente objetivo de 40X de inmersión en agua, y encienda la línea de 488 nm del láser de argón. Al cambiar el plano focal, encontrar células situadas a unos 20 m por debajo de la superficie de corte, presentan fluorescencia basal en Soma, ramas y ramillas. Es de destacar que las células comprometidas suelen mostrar nivel de fluorescencia por encima del promedio, lo que debe evitarse.
  4. Utilice el modo 'scan marco "para iniciar la exploración. Por lo general, la intensidad del láser ajustado a 0,5 - 5% de de la salida máxima es suficiente para imagen [Ca2 +] i con cito-GCaMP3. Para el seguimiento de [Ca 2 +] i dinámica en todo el territorio de los astrocitos, la 'exploración de cuadros' con una velocidad de barrido de 1 segundo por fotograma o más rápido es RECOMEnded, pero esto tiene que ser decidido en función del experimento en cuestión.
  5. Si es necesario, a la imagen [Ca 2 +] i en los procesos, utilice ampliación digital de 2 a 3 veces para supervisar 1 - 2 astrocitos en todo el campo de visión.
  6. Para evitar píxeles saturados durante la grabación, utilice el modo de búsqueda 'HiLo' a Pseudocolor las células. Comience siempre con una "grabación piloto" durante unos 5 minutos, para probar si el color rojo aparece como indicación de saturación. Si es así, menor será la potencia de salida del láser, o bajar la PMT / Ganancia / valores de desplazamiento y realizar otra grabación piloto para probar los valores de píxeles están en el rango no saturada. Por lo general, los parámetros combinados utilizan para astrocito de imágenes [Ca 2 +] i en el cuerpo estriado son las siguientes: la potencia del láser de salida 0,5 a 5% (de 10 mW), PMT 550-650 Voltios, Ganancia 2,0 - 3,5 veces, y el offset 0 - 5%.

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Representative Results

Para la expresión específica de astrocitos de cito-GCaMP3 en el cuerpo estriado, se utilizó virus adeno-asociado (AAV) del serotipo 5, y el promotor de GFAP GfaABC 1 D (Figura 1A), que se ha demostrado previamente para conducir GCaMP3 robusto y gen reportero expresión en astrocitos del hipocampo y corticales 8,14. Dos semanas después de la microinyección virus en el cuerpo estriado de ratón, el ratón (~ 10 semanas de edad) y se perfundió IHC se realizó en secciones de cerebro delgadas para evaluar la expresión cito-GCaMP3 en el cuerpo estriado (Figura 1B). Detectamos cito-GCaMP3 utilizando anticuerpos GFP y también manchadas las rebanadas con un marcador de astrocitos conocido, S100β. Expresión cito-GCaMP3 sólo se encuentra en las células S100β positivos. No se encontró expresión en las neuronas visualizados con NeuN (Figura 2A y 2B), lo que sugiere la expresión específica de astrocitos. Es importante destacar que se detectó la expresión cito-GCaMP3 en ~ 60% de las células positivas S100β (Fifigura 2C).

Los astrocitos responden a insultos cerebrales tales como lesiones, la isquemia y la infección mediante la visualización de los cambios que se han hecho conocido como la reactividad de los astrocitos, lo que representa un espectro de posibles cambios de leves a graves 15. Hemos tratado de evaluar si la microinyección virus causó la reactividad de los astrocitos manifiesta. Se ha demostrado anteriormente que la reducción de los niveles de expresión de glutamina sintetasa (GS) se asociaron con los astrocitos reactivos 16,17. Por lo tanto, la expresión de GS en el cuerpo estriado de ratones WT y de virus inyectado se comparó. No se encontraron cambios significativos en la expresión de GS en astrocitos del cuerpo estriado después de la inyección del virus (Figura 3A - C), indicando que no hay reactividad de los astrocitos abierta usando niveles GS como una métrica. Este planteamiento general podría ampliarse en el futuro trabajo para evaluar la reactividad de los astrocitos utilizando otros marcadores de reactividad. Sin embargo, tenga en cuenta que los niveles de GFAP pueden no ser una forma adecuada para medir la reactividad en striatAL astrocitos, porque GFAP no se expresa a niveles detectables en la mayoría de los astrocitos estriatales en condiciones basales 18. En resumen, mediante el uso de IHC concluimos expresión cito-GCaMP3 era robusta y específica a los astrocitos en el cuerpo estriado, y que la inyección de virus no causamos la reactividad de los astrocitos según la evaluación de cambios en el nivel de expresión de la SG.

A continuación preparamos rodajas de cerebro agudas de los ratones inyectados con el virus de la imagen [Ca 2 +] i en los astrocitos del cuerpo estriado. Se prepararon 300 micras de espesor rebanadas sagital o coronal agudas, y después de un período de recuperación de las rebanadas se colocaron en una cámara de grabación en un microscopio confocal de [Ca 2 +] i la formación de imágenes utilizando la línea de 488 nm de un láser de argón. Astrocitos estriatales que expresan cito-GCaMP3 podrían ser fácilmente identificados en la mayoría (por lo general todas) de las rebanadas estriatales (~ 6 - 7 rebanadas por ratón), ya que mostraban fluorescencia verde visible en las células con morfología claramente espeso (Figura 4 la Figura 4A; al menos 10 astrocitos muestran cito-GCaMP3 podrían obtenerse imágenes y se representan gráficamente en la Figura 4A como Regiones de interés (ROI). Superior de imagen de magnificación con un zoom digital adicional de 2,0-3,0 fue necesario identificar los astrocitos individuales (Figura 4B). Bajo estas circunstancias, territorios enteros de astrocitos fueron revelados por la expresión cito-GCaMP3, como se muestra en la Figura 4B. Espontáneas Ca 2 + señales se midieron fácilmente en la somata así como en las ramas y ramitas de astrocitos 6.

Figura 1
Figura 1: entrega viral de Gecis (por ejemplo, cito-GCaMP3) por AAV2 / 5 en el cuerpo estriado del ratón adulto. A. Esquema ilustra el protocolo para AAV2 / 5 microinyecciones en el cuerpo estriado dorsolateral.B. Muestra la posición aproximada de la aguja de microinyección en relación con el cuerpo estriado y las coordenadas utilizadas para las inyecciones estereotáxica. La imagen de una rebanada manchado-Nissl en el panel B ha sido descargado de ALLEN CEREBRO ATLAS.

Figura 2
Figura 2: Cito-GCaMP3 expresión era específico para astrocitos del cuerpo estriado. A - imágenes B. representativo que muestra que la expresión de cito-GCaMP3 colocaliza con un marcador para astrocitos (S100β) (B), pero no con un marcador de neuronas (NeuN) (A) C. Resumen gráfico de barras para los experimentos de colocalización como los que se muestran. en A y B.

Figura 3
Figura 3: expresión cito-GCaMP3 dentro de los astrocitos del cuerpo estriado no causó cambios en la expresión de la SG.A - imágenes B. representativos de GCaMP3 y GS IHC de los ratones que habían recibido AAV2 / 5 para GCaMP3. También se muestran imágenes de control de ratones no inyectados. C. Barra gráfica resume los resultados de los experimentos, como los de A y B (ns: no significativo mediante la prueba de la t de Student para datos independientes una, p <0,05).

Figura 4
Figura 4: Ejemplos representativos de [Ca 2 +] i señales registradas a partir de astrocitos estriadas con cito-GCaMP3. Imagen z-pila mostrando 10 astrocitos (numeradas 1-10) A. Un aplanado .La traza a continuación muestran la [Ca 2 +] i señales registró más de 5 min de las células 10 que se muestran en A B. Un aplanado y zoom en z. imagen -stack para una sola traza astrocyte.The a continuación muestran la [Ca 2 +] iseñales registradas durante 5 min para la célula única se muestra en B.

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Discussion

Los métodos descritos en el presente documento nos han permitido expresar cito-GCaMP3 en astrocitos del cuerpo estriado en vivo para su posterior [Ca 2 +] i de imágenes in situ. Este método tiene ventajas sobre el uso transgénica o ratones knock-in, incluyendo la expresión robusta de la proteína objetivo, rapidez y flexibilidad de aplicación experimental y especificidad anatómica. La expresión de GCaMP3 usando AAV2 / 5 se encontró que era específica y robusta. La combinación de GFAP GfaABC promotor 1 D con AAV de serotipo 5 es crítica para lograr la especificidad. Una limitación de la técnica descrita aquí es que la infección por virus y procedimiento de cirugía pueden causar reactividad de los astrocitos, especialmente con virus de alto título 19. Es importante destacar que en el estudio actual, AAV2 / 5 microinyecciones con un título bajo relación no causaron disminuciones en la GS que se han asociado con la reactividad de los astrocitos 19. Controles similares han sido reportados por hippastrocitos ocampal 8. Sin embargo, es importante hacer hincapié en la necesidad de estos controles para cada área del cerebro a ser estudiado, sobre todo porque los astrocitos son heterogéneos 20, y debido a que probablemente desempeñan funciones diferentes en distintas regiones del cerebro.

Uno de los factores importantes que pueden afectar la robustez de la expresión génica dirigida usando microinyección virus es las coordenadas en uso, que varía entre las diferentes cepas de ratón y cambios a lo largo del desarrollo de los animales. Sólo se utilizaron ratones C57BL / 6 de ~ 8 semanas de edad durante todo este estudio. También se ha demostrado que la expresión viral de GFP en las neuronas del cuerpo estriado y astrocitos en ratas se pudo detectar 4 días después de la inyección, alcanzó una meseta por 2 - 4 semanas después de la inyección, y luego se mantuvo estable durante 9 meses después de la inyección 21. El curso temporal de la expresión de cito-GCaMP3 no se ha determinado precisamente aquí, pero al menos dos semanas para la expresión del virus sonrecomendada.

El enfoque de la utilización de AAV2 / 5 mediada por la expresión de Gecis en astrocitos estriatales ahora se puede utilizar para comprender mejor los astrocitos [Ca2 +] i de señalización en el cuerpo estriado. En concreto, el nivel de expresión cito-GCaMP3 es suficientemente alta para permitir la proyección de imagen de [Ca 2 +] i señales en pequeñas poblaciones de astrocitos (~ 10 células) y dentro de la totalidad de los territorios de los astrocitos individuales. El análisis detallado de [Ca2 +] i señales todavía está en curso, pero hasta la fecha [Ca2 +] i se han detectado señales de los procesos distales en cuanto a ~ 50 m de distancia del soma (Figura 4). Experimentos detallados en astrocitos [Ca 2 +] i señales y sus funciones correlativas y causales dentro del cuerpo estriado son factibles. En el futuro, los enfoques refinados (es decir, los promotores) se necesitan para entregar Gecis a poblaciones definidas genéticamente de astrocitos de modo que uno puedeexplorar la señalización de calcio dentro de las diversas poblaciones de astrocitos 20.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

La mayor parte del trabajo y el personal involucrado fueron apoyados por el NIH subvención NS060677 y en parte por el NIH otorga MH099559 y MH104069 (a BSK). Parte del trabajo también fue apoyado por la Fundación CHDI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Syringe Pump Harvard Apparatus 704506
Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Narishige PC-10
Micropipette grinder Narishige EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 Addgene 44331 a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
1 ml syringe BD 309628
syringe needle BD 305109
AAV2/5 virus UPenn vector core NA
Sudan red IV Sigma-Aldrich 67386
Mineral oil CVS Pharmacy 152355
Cryostat Leica CM3050 S
Stereotaxic instrument David Kopf Instruments 900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit FOREDOM K.1070
Paraformaldehyde Santa cruz biotechnology sc-281692
Super Glue Krazy®Glue KG925
Microslicer Ted Pella DTK-Zero 1
Confocal microscopes Olympus FV300 and FV1000
Normal goat serum Vector S-1000
chicken anti-GFP Abcam ab13970
mouse anti-s100β Sigma-Aldrich S2532
mouse anti-NeuN Millipore MAB377
mouse anti-glutamine synthetase Millipore MAB302
goat anti-mouse-Alexa546 Invitrogen A11003
goat anti-chicken-Alexa488 Invitrogen A11039
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5J
Mounting Medium Vector H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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1 Comment

  1. What kind of drug you use to anesthetize the mouse before decapitation? Thank´s

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2016 - 6:27 PM

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