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Non-Terminal techniques d'échantillonnage de sang chez les cobayes

Biology

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Summary

Même si un modèle connu, le cochon de Guinée représente actuellement un créneau en sciences des animaux de laboratoire et des données limitées sont disponibles sur l'exécution de la plupart des procédures. Ici, nous présentons quatre approches différentes pour non-terminal dans les techniques de prélèvement sanguin in vivo chez soit des cobayes conscients ou anesthésiés.

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Birck, M. M., Tveden-Nyborg, P., Lindblad, M. M., Lykkesfeldt, J. Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs. J. Vis. Exp. (92), e51982, doi:10.3791/51982 (2014).

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Abstract

Les cochons d'Inde possèdent plusieurs similitudes biologiques pour les humains et sont validés modèles animaux expérimentaux 1-3. Cependant, l'utilisation de cobayes représente actuellement une zone relativement étroite des données de recherche et descriptives sur la méthodologie spécifique est proportionnellement rares. Les caractéristiques anatomiques de cobayes sont un peu différent des autres modèles de rongeurs, d'où la modulation des techniques d'échantillonnage pour tenir compte des différences spécifiques de l'espèce, par exemple., Par rapport à des souris et des rats, sont nécessaires pour obtenir des échantillons de qualité suffisantes et élevés. Comme la fois court et long terme dans les études in vivo souvent besoin de sang répété échantillonner le choix de la technique doit être bien pris en compte afin de réduire le stress et l'inconfort chez les animaux, mais aussi pour assurer la survie ainsi que la conformité avec les exigences de taille de l'échantillon et de l'accessibilité. Des prélèvements sanguins peuvent être obtenus à un certain nombre de sites de cobayes par exemple., La saphène et jugulaireveines, chaque technique contenant à la fois des avantages et des inconvénients de 4,5. Ici, nous présentons quatre techniques différentes de prélèvement sanguin soit pour des cobayes conscients ou anesthésiés. Les procédures sont toutes les procédures non-terminaux à condition que les volumes d'échantillon et le nombre d'échantillons ne pas dépasser les lignes directrices pour la collecte de sang chez les animaux de laboratoire 6. Toutes les méthodes décrites ont été soigneusement testés et demandé répétée dans le prélèvement de sang dans les études in vivo au sein de notre centre de recherche.

Introduction

Le cochon de Guinée est un modèle animal expérimental précieux et validé en raison d'un certain nombre de similitudes biologiques pour les humains tels que l'exigence d'un apport alimentaire en vitamine C, lipoprotéines plasmatiques comparables enzymes métabolisant et profils de lipoprotéines, ainsi que les similitudes partagées avec placentation humaine et développement prénatal 1-3,7,8. Cela rend le cochon de Guinée un modèle attrayant et adapté aux effets de maladies liés à l'alimentation tels que la non-stéatose hépatique, les maladies cardiovasculaires et les effets supposés de la carence en vitamine C, mais aussi l'effet par exemple de l'étude., Intervention alimentaire de la mère sur le développement progéniture.

Prélèvement de sang répétée est souvent nécessaire à la fois court et long terme dans les études in vivo. En raison des différences anatomiques spécifiques à l'espèce modulation de la technique d'échantillonnage est nécessaire afin d'obtenir des échantillons de sang chez les cobayes par rapport à d'autres modèles de rongeurs 3,9. Cette technique permet d'échantillons de petites quantités de sang (100 à 400 ul), par exemple, répété., Pour déterminer les marqueurs biochimiques dans le plasma. Si un échantillon de taille encore plus petite est suffisante (50-100 pi), ce qui peut très facilement être obtenu par ponction de la veine de l'oreille. Cette technique peut également être réalisée chez des animaux conscients et est utile par exemple lorsque l'on mesure la glycémie 10,11. L'échantillonnage de la veine jugulaire permet la collecte de plus grandes quantités de sang (1-2 ml) mais nécessite une anesthésie.

Ici, nous présentons quatre techniques différentes de prélèvement sanguin soit pour des cobayes conscients ou anesthésiés. Le procedures sont toutes les procédures non-terminaux à condition que les volumes d'échantillon et le nombre d'échantillons ne pas dépasser les lignes directrices pour la collecte de sang chez les animaux de laboratoire 6. Il est dans l'intérêt de la bonne science, ainsi que de bien-être animal que l'accent devrait être maintenu à un minimum. Par conséquent, seul bien formé et personnel compétent doit effectuer les procédures sur les animaux.

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Protocol

Les procédures indiquées ont été réalisées selon des protocoles approuvés par l'Inspection expérimentation animale danois sous le ministère de l'Alimentation, de l'Agriculture et de la Pêche.

1 prélèvement sanguin de la saphène latérale ou tarsien Vein

  1. Effectuez cette procédure sans anesthésie et l'aide d'un enquêteur, un traitement de la cochon de Guinée, et un prélèvement de l'échantillon.
  2. Raser la région du tarse de la patte arrière avec un rasoir électrique jusqu'à ce que les veines sont visibles. S'assurer que la zone est assez grande pour éviter fourrure interférer avec le site de ponction.
  3. Placez la patte arrière dans un bain d'eau tiède et frottez doucement la jambe, ce qui rend les veines plus dilatées et évident.
  4. Essuyez la jambe avec une serviette propre et désinfecter le site de ponction avec de la gaze ou un coton-tige imbibé d'alcool à 70%.
  5. Retenez le cochon de Guinée et d'étendre la jambe arrière vers le bas tout en exerçant une légère pression immédiatement au-dessus du genou to fournir stase.
  6. Piquer la veine à l'aide d'une aiguille de 21 G ou lancette. Prélever le sang par exemple., À l'aide d'un tube de collecte ou capillaire. Manipuler doucement la jambe pour faciliter le flux sanguin.
  7. Relâcher la stase, une fois que l'échantillon a été obtenu. Appliquez un morceau de gaze ou de coton avec une légère pression sur le site de ponction jusqu'à ce que le saignement s'est arrêté.
  8. Retour à l'animal de sa cage et le moniteur pendant 5-10 min pour assurer l'hémostase.

2. échantillonnage du sang de la veine de l'oreille

  1. Effectuez cette procédure sans anesthésie soit seul ou de préférence avec l'aide d'un collègue.
  2. Désinfecter la surface dorsale de l'oreille à l'aide de la gaze ou un coton-tige imbibé d'alcool à 70%.
  3. Appliquez une légère pression à la base de l'oreille pour fournir stase.
  4. Piquer la veine à l'aide d'une aiguille de 21 G ou lancette, et recueillir le sang.
  5. Relâchez la stase, une fois l'échantillon a été obtenu, Appliquez un morceau de gaze ou de coton hydrophile gepression ntle au site de ponction jusqu'à ce que le saignement s'est arrêté.
  6. Retour à l'animal de sa cage et le moniteur pendant 5-10 min pour assurer l'hémostase.

3 Prélèvement de sang de la veine jugulaire

  1. Effectuer cette procédure en utilisant l'aide d'un enquêteur supplémentaire; une manipulation du cochon de Guinée et un prélèvement de l'échantillon.
  2. Anesthésier le cochon de Guinée avec un anesthésique approprié pour toute la durée de cette procédure. Un mélange de tilétamine (0,93 mg / kg), zolazepam (0,93 mg / kg), de xylazine (1,49 mg / kg) et le butorphanol (0,06 mg / kg) peut être utilisé.
  3. Placez le cochon de Guinée anesthésié sur le dos et retirer délicatement les pattes de devant caudale.
  4. Rasage et désinfecter (par exemple., Avec 70% d'alcool), la partie ventrale du cou.
  5. Enduire la seringue avec l'héparine ou de l'EDTA avant l'échantillonnage afin de réduire le risque de formation de caillots.
  6. Palper la clavicule et insérer un 25 G (ou 23 G) aiguille montée sur une seringue de 1 ml apron 1 cm en dehors de la ligne médiane au niveau de l'articulation de l'épaule. Conserver la seringue dans un léger angle vers le haut et interne tout en appliquant une légère pression négative. Éviter d'endommager les structures sous-jacentes comme la veine jugulaire est situé tout à fait superficielle. Inclinez le cou du cochon de Guinée légèrement vers l'arrière pour fournir stase augmentation de la veine.
  7. Relâchez les pattes avant lorsque l'échantillon de sang est obtenu, et soulager la stase avant que l'aiguille est rétractée. Utilisez un morceau sec de gaze ou de coton pour appliquer une légère pression sur le site de ponction.
  8. Retour de l'animal dans une cage de récupération et de suivi pour s'assurer l'hémostase et la récupération après l'anesthésie.

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Representative Results

Quatre approches différentes techniques in vivo non terminaux dans de prélèvement sanguin soit dans les cobayes conscients ou anesthésiés ont été présentés. Figure 1 illustre l'évolution de la saphène et la veine latérale du tarse dans le cochon de Guinée et sites de ponction possibles. les veines de l'oreille, visibles sur la face dorsale d'une oreille de porc Guinée sont illustrés à la Figure 2 Ces veines peuvent être utilisés pour le prélèvement sanguin lorsque seul un très petit volume est requise. La position du cochon de Guinée pour le prélèvement de sang de la jugulaire est présentée dans la figure 3. L'évolution de la veine jugulaire est illustré par les flèches avec la flèche pointant vers le plus haut sur ​​le site de ponction recommandée.

Figure 1
Figure 1: La veine saphène latérale et du tarse dans le cochon de Guinée. L'image illustre l'évolution et lasite de ponction pour le prélèvement de sang à partir de la saphène latérale (flèche supérieure) ou la veine du tarse (flèche inférieure) dans le cochon de Guinée.

Figure 2
Figure 2 veines de l'oreille. Cette image illustre les veines de l'oreille (flèches) visibles sur la face dorsale de l'oreille de porc Guinée. Ces nervures peuvent être utilisés pour le prélèvement sanguin lorsque seulement un très petit volume est requise.

Figure 3
Figure 3 Position du cochon de Guinée pour jugulaire prélèvement de sang de la veine. Cela illustre la position du cochon de Guinée et le site de ponction jugulaire pour le prélèvement de sang de la veine. Les flèches indiquent le parcours de la veine jugulaire avec la flèche supérieure pointant vers le point de ponction recommandé.

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Discussion

Par rapport à des souris et des rats, cochons d'Inde sont craintifs par nature et doivent être abordés calmement et correctement traitées afin de réduire le stress. D'un point de vue de la protection des animaux, agissant avec soin est naturellement une priorité; Toutefois, ce sera aussi réduire le risque d'effets de l'anxiété associée sur les données recueillies par ex., l'augmentation des taux de corticostéroïdes dans le sang et glucose 12. De même, la gestion quotidienne habituer les animaux aux procédures normales et peut servir à réduire le stress encore plus loin. Une expertise pratique dans une technique de prélèvement de sang particulière devrait être acquise par la première observation d'un opérateur expérimenté et par la suite effectuer la technique sous surveillance jusqu'à la compétence est atteint. La technique choisie devrait idéalement à la fois de réduire le stress et l'inconfort à un minimum, mais aussi pour assurer la survie ainsi que la conformité avec les exigences de taille de l'échantillon et de l'accessibilité. Pour toutes les méthodes d'échantillonnage de sang présentées les techniques d'asepsie doivent êtreutilisée pour minimiser les risques d'infection et d'assurer la collecte des échantillons non contaminés.

Les approches illustrées à la prise de sang assurer la survie de l'animal à condition que le volume de l'échantillon et de la fréquence est réalisée conformément aux lignes directrices et peuvent tous être appliqué pour un échantillonnage répété dans les deux études à court terme et à long terme 6. Ceci permet une surveillance constante des animaux individuels au fil du temps en réduisant les présentes variance et le nombre d'animaux inclus dans le respect de (réduction) des 3R 13,14. Les techniques présentées ici ont différentes gammes de volume de l'échantillon obtenu (quelques pi jusqu'à 1-2 ml) qui devrait être pris en considération avant de commencer une expérience. Bien que les procédures de collecte de sang de la veine jugulaire chez le cobaye anesthésié ONU ont été décrits 12, nous recommandons fortement l'utilisation de l'anesthésie pour réduire le stress et l'inconfort autant que possible. Ce faisant, le choix de l'anesthésie doit être prudenty adressée, en notant que les cochons d'Inde sont notoirement difficiles à anesthésier et afficher l'efficacité de la variation considérable de l'anesthésie ainsi que d'une grande sensibilité envers respiration induite par la dépression 15,16. Comme la veine jugulaire chez le cobaye n'est ni visible ni palpable toute réduction de stase / dilatation veineuse peut augmenter les difficultés d'échantillonnage, donc il est généralement recommandé d'éviter agents vaso-constriction en anesthésie-mélanges. . Outre, les effets connus des agents de anesthésier spécifiques qui peuvent interférer avec la collecte de données souhaitent, par exemple des effets cardio-vasculaires et / ou l'augmentation des niveaux de glucose dans le sang suivantes α 2 - actions agonistes chez les rongeurs doivent être évaluées 16,17. L'utilisation de l'anesthésie par inhalation, comme l'isoflurane peut également être une option, mais comme l'intubation chez le cobaye est un soin très difficile doivent être prises pour éviter les interférences par l'inhalation masque avec la position tête / cou, comme cela peut complicmangé inutilement la procédure. Généralisé l'anesthésie par exemple., Par inhalation est également nécessaire pour ponction cardiaque qui peut fournir un volume d'échantillon plus important. Cependant, ponction cardiaque est une procédure terminal et donc pas applicable pour un échantillonnage répété et ne sera pas décrit plus avant.

Les effets négatifs potentiels tels que l'hémorragie, ecchymoses, la thrombose, l'infection et la cicatrisation peuvent survenir après ponction d'une veine. Dans notre expérience, le cochon de Guinée ne présente pas un risque accru de telles complications indésirables par rapport à d'autres modèles de rongeurs à condition que la procédure se fait comme décrit dans le manuscrit en cours. Comme la veine jugulaire ne peut pas être visualisée à partir de la surface extérieure, il est très important pour soulager la stase avant de retirer l'aiguille et pour fournir une hémostase suffisante pour minimiser le risque d'hémorragie péri-veineux et les ecchymoses. En cas d'effets indésirables, le traitement doit toujours être recherchée du vétéri responsablenaire. Pour des raisons de bien-être bonne et de la science des animaux, les considérations graves doivent être remis à l'effet combiné de volume de l'échantillon et de la fréquence et le choix de la technique d'échantillonnage. Toutes les techniques de prélèvement sanguin décrites ont été soigneusement testés et demandé répétée in vivo prélèvement de sang dans les études au sein de notre centre de recherche.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à divulguer. Toutes les procédures ont été approuvées par la Loi sur l'expérimentation animale du Danemark, qui est en accord avec le Conseil de l'Europe Convention STE 123.

Acknowledgments

Nous reconnaissons l'aide habile de Annie B. Kristensen, Elisabeth V. Andersen, Belinda B. Bringtoft et les gardiens d'animaux au Département de médecine expérimentale, Frederiksberg Campus, Faculté de la santé et des sciences médicales de l'Université de Copenhague, Danemark. Jacob Lønholdt est remercié pour son excellente assistance technique pour filmer les procédures. Cette étude a été financée en partie par le Centre LIFEPHARM pour pharmacologie in vivo et de l'Université de Copenhague.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Electric shaver Wella (Contura), Denmark 273207 Alternative product may be used. Multiple suppliers
Syringes  B.Braun-Omnifix-F, Germany 9161406V Alternative product may be used. Multiple suppliers
Needles BD Microlance, Spain 301156 Alternative product may be used. Multiple suppliers
Microvette collection tube  Sarstedt, D-51588Nümbrecht, Germany 201,288,100 Alternative product may be used. Multiple suppliers
Accu-Check analyzer Roche A/S Diagnostics, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Heparin 5000 IE/ml LEO Pharma, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Anesthesia Zoletil 50, Chemvet, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Anesthesia Narcoxyl vet 20 mg/ml, Intervet, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Anesthesia Torbugesic vet 10 mg/ml, Scanvet, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Neutral eye ointment Alternative product may be used. Multiple suppliers
Gauze or a cotton swab  Alternative product may be used. Multiple suppliers
Disinfectant (70% alcohol) Alternative product may be used. Multiple suppliers

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