차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 :

Developmental Biology

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Summary

배아 병아리 망막 세포 배양은 광 수용체 생물학의 연구에 유용한 도구를 구성한다. 우리는 이전에 배양 망막의 플라스미드 일렉트로 오보 EX에 기초한 효율적인 유전자 전달 기술을 개발했다. 이 기술은 상당히이 시스템에 대한 가능한 유전자 조작을하고, 현재 사용 가능한 프로토콜을 통해 형질 전환 효율을 증가시킨다.

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Vergara, M. N., Gutierrez, C., Canto-Soler, M. V. Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach. J. Vis. Exp. (105), e52002, doi:10.3791/52002 (2015).

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Abstract

배아 병아리 망막에서 파생 된 콘 광 수용체가 풍부한 문화 망막 신경 세포, 특히 광 수용체의 생물학을 공부하는 전세계 연구자를위한 필수적인 도구가되었다. 그들은 쉽게 약물 개발을위한 높은 처리량의 기술에 적용 할 수 있으므로이 시스템의 응용 프로그램은 기초​​ 연구를 넘어. 그러나 이러한 문화 망막 광 수용체의 유전자 조작은 시스템의 유용성에 중요한 제한 포즈, 매우 어려운 것으로 입증되었습니다. 우리는 최근에 개발 및 기타 현재 사용 가능한 프로토콜 (1)에 비해 5 배 이러한 문화 망막 세포의 형질 전환의 속도를 증가 플라스미드 전기 기술 비켜 전을 검증했다. 이 방법에서 병아리 배아 눈 RPE를 제거하고, 스테이지 (27)에서 적출하고, 망막 컵 플라스미드 - 함유 용액에 배치되어 쉽게 구성된 고객이나 전기 천공을 사용하여만든 전극. 망막은 해리 배양 표준 절차를 사용하고 있습니다. 이 기술은 일반적으로 감광체 인구의 25 %의 유전자 발현을 달성 플라스미드 기반의 RNAi 기술의 사용을 통해, 예를 들면, 과발현 연구뿐만 아니라 유전자 발현의 하향 조절에 적용될 수있다. 본 공보의 비디오 포맷은 망막 일차 배양에서의 유전자 기능 연구를 가능 분야의 연구자에이 기술이 용이하게 접근 할 수 있도록한다. 우리는 또한 성공적인 결과 및 재현성이 절차의 중요한 단계에 대한 자세한 설명을 포함하고있다.

Introduction

배아 병아리 망막에서 해리 된 세포 배양 널리 생존 2-9, 차별화 10-12, 신경 돌기의 파생물 (13) 등을 포함한 광 수용체 세포 생물학의 다양한 측면을 연구하는 데 사용되었다. 루벤 애들러와 공동 작업자에 의해 1980 년대에 개발하고 자신과 다른 그룹 (14-20)에 의해 완성이 시스템의 장점은, 동물 모델 (21)와 여자의 고유 특성에 있습니다. 심지어 배아 단계에서 병아리 눈의 큰 크기는, 문화에 대한 자료의 많은 양을 제공한다. 배아는 배양 일 (ED) 5 이용하여 수행 될 때 더욱이, - 6 망막, 55 -이 동물 감광체의 약 86 %이기 때문에 그들의 선조 세포의 80 %가 감광체 14,15,18,22,23으로 구별하고, 콘 (24)은,이 배양 물이 세포 유형에 집중 연구에 특히 적합하다.

우리는 최근 develo의이PED는 ​​따라서 유전 missexpression 연구 1 촉진함으로써이 시스템의 유용성을 넓히고,이 배양 물에서 세포의 고효율 플라스미드 형질 감염을 허용하는 간단한 기술을 특징으로한다. 이 기술의 개발은 세포 자율 방식으로 유전자 기능 연구를 허용하도록 형질의 허용 가능한 수준을 제공 할 방법 과학 문헌에서 보이드로부터 비롯. 일차 배양 신경 세포를 형질 25,26 악명 하드 때문 부분이다. 이 목적을 위해 이전에 사용 가능한 가장 일반적으로 사용되는 기술 중 일부는 3-5 % 정도의 효율을 야기하고 상당한 독성을 발휘 27-32 예컨대 리포 펙션, 칼슘 포스페이트 - 매개 된 형질 전환과 같은 화학적 형질 전환 방법을 포함. 효소 리포터 플라스미드 시스템의 사용은 신호를 증폭하여 불량한 형질 감염 효율의 문제를 피할 수있다하더라도, 그들은하지셀 고유의 효과를 판별하고, 그 결과 전체를 대표하지 않을 작은 세포군에 기초한다. 병아리에서 널리 사용되는 또 다른 방법은, RCA 단자 바이러스 감염은 세포 증식에만 적용이 망막 일차 배양 시스템 (33), 따라서 적합하지 않다.

현재 프로토콜에서 배아 병아리 눈 단계 27 (ED 5), 망막 색소 상피 (RPE)를 제거하고, 망막 컵이 플라스미드를 함유 용액으로 가득 전기 챔버에 배치에서 적출 및 사용하여 전기 천공되는 주문 제작 표준 기술 (21)을 이용하여 망막 해리와 문화를 이어 전극. 이 절차를 최적화 한 결과의 생존과 분화 특성을 손상시키지 않고 지속적으로 배양 세포 단독 감광체 인구 내의 25 %의 총 수의 22 % 정도의 형질 전환 효율을 달성 할 수 있었다문화 1. 여기에서 우리는이 기술의 성공과 재현성을 보장하기 위해이 절차의 모든 중요한 단계를 요약 한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

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Protocol

이 작품에 설명 된 모든 절차는 존스 홉킨스 대학에서 동물 관리 및 사용위원회에서 권장하는 지침에 따라 수행 하였다.

미리 1 :기구, 시약 및 요리의 준비

  1. 계란의 준비 : 계란 배양기에서 5 일간 37.5 ℃, 상대 습도 60 %에서 수정 된 백색 레그혼 닭 알을 품어.
    참고 : 표준화 및 배아 발달을 동기화 도움이 될 수있는 능력을 흔들하지만, 락과 보육이 프로토콜의 결과에 대해 엄격하게 할 필요가 없습니다.
  2. 플라스미드 준비 :
    1. 필요에 따라 설계 플라스미드 (1,34의 RNAi 기술을 사용하여 예를 들어) 유전자 과발현 또는 하향 조절을 위해 구축. 가능한 한 구조에서 리포터 유전자 (예 : EGFP, RFP 또는 LacZ를 등)를 포함한다.
      참고 : 같은 거대 세포 바이러스와 같은 일부 일반적으로 사용되는 프로모터는, 시간이 지나면 침묵이 될 수 있습니다. CAG의 PROMOT어 (닭 베타 - 액틴 CMV 인핸서와 프로모터) 관심 35-37의 유전자를 효율적으로 장기 식을 제공하는 아주 좋은 대안이다.
    2. 멸균 PBS 1.5 μg의 / μL의 농도에서 플라스미드 솔루션을 준비합니다. 옵션 : 시간 ​​앞서 플라스미드 솔루션을 준비하고 냉동 사용할 준비가 될 때까지 저장할 수 있습니다.
      주 : 높은 플라스미드 농도를 사용하는 반면 낮은 농도는 플라스미드 트랜 스펙 션 효율을 낮추는 1, 효율의 현저한 증가를 초래하지 않는다.
  3. 전극 :
    1. 양극 사용을 위해 두꺼운 금 (특정 재료 / 장비의 표 참조) 전극을 냈습니다. 70 % 에탄올로 닦아.
      주 : 금 절연 노출 약 0.5 mm를두고 전극 스쳐, 전류의 누출을 최소화하는 것이 바람직하다. 절연 재료에 대한 정보는 특정 재료의 표에서 찾아 볼 수있다.
    2. 2.5 mm의 정사각형 B에서 음극을 확인(일반적으로 마이크로 피펫 끌어 당기는에서 사용) 4.5 mm 폭 황소 필라멘트. 집게의 도움으로, 사각형 상자를 취소하고 긴 스트립에 필라멘트를 펴. 그 후, 해부 현미경 및 가이드로자를 사용 하에서, 기지 3mm 긴 사각형 'U'자형으로 필라멘트를 구부리고 반대편 필라멘트의 나머지 길이 (도 1, 일측 2mm 높은 , C - D). 집게를 사용하여 96 %의 에탄올과 불꽃의 전극 소독 찍어. 그런 다음 전극의 긴 팔에 작은 악어 클립으로 전기 리드를 연결합니다.
  4. 전기 상공 회의소 설정 :
    1. 100mm 페트리 접시 사용하여 테이프 (그림 1E)에, 아래로, 평평한면을 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 관의 뚜껑을 절단 부착하여 전기 챔버를 준비합니다.
      참고 : 일하는 것이 비슷한 크기의 잘의 형태로 다른 컨테이너; 그러나 microcentrifuge 관 덮개는 쉽게 접근하고 멸균한다. 잘플라스미드 솔루션의 낭비가 발생하는 등의 병아리의 눈과 음극 전극을 수용 할 정도로 큰,하지만 너무 큰되지해야합니다.

2. 예 비켜 Electroporation에 절차

  1. 악기의 제조 :
    1. 마이크로 해부 도구를 소독을 찍기로 (달걀 껍질을 열고 배아, 망막 색소 상피를 제거 뒤몽 핀셋을 꽂아 미세 팁 2 쌍을 떠서위한 큰 곡선 몰 로니 집게 2 쌍을 본 한 쌍은 제거 렌즈와 유리체 위해 집게를 톱니) 96 % 에탄올과 불타는에 팁. 70 % 에탄올에 담근 잎사귀를 사용하여 청소 해부 범위. 37 ° C의 물을 욕조에 멸균 칼슘 마그네슘 무료 행크의 균형 소금 솔루션 (CMF-HBSS)의 병을 따뜻하게. 따뜻한 CMF-HBSS 전체 3/4에 100mm 멸균 배양 접시를 채우십시오.
    2. 다른 깨끗한 해부 현미경으로 전기 챔버를 놓고 플라스미드 솔루션의 120 μL로 입력합니다. , 전기 장치에 전극을 연결하고반드시 맞춤형 전극을 음극에 연결하고 금은 양극에 전극을 밀고있다.
  2. 배아 컬렉션 :
    1. 70 % 에탄올에 젖은 잎사귀와 껍질을 닦아 계란을 청소합니다. 문화에 오염을 운반 방지하기 위해 프로토콜의 나머지 부분에 걸쳐 멸균 절차를 유지한다. 큰 곡선 몰 로니의 집게를 사용하여 조심스럽게 부드럽게 (공기 실 이상) 달걀의 둥근 끝을 두드리고 다음 그립과 쉘 부분을 잡아 당겨 달걀 껍질에 구멍을 엽니 다.
    2. 집게의 또 다른 한 쌍은 세포막을 제거하고 달걀에서 그것을 떠서하여 배아를 수집로 (조심 배아를 손상하지 말 것). CMF-HBSS와 함께 접시에 넣습니다.
      주 : 2.4.4에 규정 된 전기에 대한 망막 컵의 수를 얻기 위해 필요한만큼 모아서 배아
    3. 중요한 단계 : 햄버거와 해밀턴 (38)에 따라 배아를 스테이지.
      참고 : 최적의 효율 배아를 얻으려면단계 27 (그림 2A)에 있어야합니다.
    4. 몰 로니의 집게를 사용 잘린 배아를 안락사.
  3. 망막 컵을 가져 오기 :
    1. 미세 뒤몽 핀셋을 사용하여 조심스럽게 눈을 명백히하다 새로운 CMF-HBSS 접시에 전송할 수 있습니다.
    2. 시신경 유두에 가까운 각각의 눈의 후방 부분에서 시작, 2 개의 미세 뒤몽 핀셋을 사용하여, 신경에 손상을주지에 RPE는 신중 해부 신경 망막과 망막 색소 상피 조심스럽게 사이에 핀셋의 각 쌍 중 하나 팁을 소개합니다 망막 (그림 2B).
      참고 : RPE 도움이 될 것 용액에서 칼슘과 마그네슘 2+의 부족은 더 쉽게 신경 망막에서 분리합니다.
  4. 전기 :
    1. 15 볼트, 50 밀리 초 지속 시간 950 밀리 초 간격의 5 제곱 펄스를 제공하기 위해 electroporator의 매개 변수를 설정합니다. 장소 'U'는 전기 챔버 (마이크로 원심 뚜껑 채우기 내부에 음극 모양플라스미드 함유 용액 120 μL)와 ED.
    2. 사용 만곡 듀 핀셋 (아닌 떠서 누름) 일렉트로 포 레이션 챔버 한 망막 컵을 전송하고, 상기 전극의 아래쪽 및 위쪽으로 향하게 렌즈쪽으로 망막의 후방 부와, 'U'형상의 전극 내부에서 배치 ( 그림 2D).
    3. 그 다음 렌즈로, 눈의 앞쪽 부분을 터치하고 electroporator의 발 페달이 전기 펄스를 제공하는 사용하도록 양극을 놓습니다.
    4. CMF-HBSS로 새로운 배양 접시에 전기 천공 망막 컵을 전송하고 나머지 망막 컵의 각각 전기의 절차를 반복합니다.
      주 : 6 망막 컵까지는 형질 전환 효율이 크게 감소하지 않고 동일한 플라스미드 용액으로 전기 천공 할 수있다.
    5. 본의 톱니 포셉으로 그들을 그립 부드럽게 T를 통해 당겨 각 일렉트로 망막 컵의 렌즈와 유리체를 제거곡선 뒤몽 핀셋의 다시 제자리에 눈을 유지하면서 그는 개방 학생.
    6. 표준 절차에 따라 일렉트릭 망막 세포의 분리 및 배양을 진행합니다.
      참고 : 병아리 망막 세포의 분리 및 문화에 대한 자세한 프로토콜의 벌 가라과 칸토 - 솔러, 2012 년 추가 파일 4 (21)을 참조하십시오이 프로토콜에서 세포가 폴리 오르니 틴 코팅 6 웰 플레이트 또는 35 낮은 밀도에서 씨앗을 품고있다. -mm 요리 (6 × 10 5 세포 / 35mm 직경의 우물 또는 접시). 사용 된 배지는 페니실린 / 글루타민, 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 100 μg의 / ㎖에서 리놀산-BSA (199)와 매체이다. 문화는 5 % CO 2와 가습 37 ° C 배양기에서 유지된다. 이 과정을 사용하여 - 5 6 × 106 세포는 일반적으로 각 단계마다 27 일렉트로 눈을 얻을 수있다.
      참고 : 이상적으로, 더 이상 3 시간이 배아 수집 및 세포 도금 사이를 통과한다, 좋은 세포 생존을 보장하기 위해스트레스를 최소화 할 수 있습니다. 관찰과 추가 분석을 위해 일반적인 타이밍이 시점에서 세포가 좋은 형태 학적 및 분자 차별화를 달성 생존이 여전히 높기 때문에, 문화 4 일 후에입니다.

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Representative Results

여기에서 우리는 다음 해리 세포 배양을위한 탈핵 병아리 망막 컵에 플라스미드 형질에 대한 간단한 프로토콜을 제시한다. 형질 사용자 정의 전극 (- 2 그림 1)을 쉽게 만들 수 사용 전기에 의해 달성된다. 이 프로토콜에 기재된 파라미터는 20 % 내지 27 (도 3d) (22 %의 평균) 레인지에 형질 전환 효율을 얻기 위해 최적화되었다. 위에서 언급 한 이유로, 이러한 결과는 문화 4 일 후에 정량화, 알 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 형질 전환 효율은 전체 세포 집단 내에서 유전자를 발현하는 세포의 백분율을 말한다. 만 감광체 인구가 고려되는 경우, 형질 전환 효율은 25 %의 평균 (도 3d)으로 증가한다. 이러한 유형의 배양 물은 주로 감광체를 연구하는 데 사용되기 때문에, 이것은 중요한 특징이다.

electroporat 된 세포 배양 이 기술을 사용 에드 DIC 조명, 세포 생존 특성 및 visinin (널리 사용되는 광 수용체의 마커) 및 PAX6 1 분자 마커의 발현에 따라 그 형태에 자신의 비 일렉트로 대응에서 구별 할 수 없다.

그림 1
전극 1. 만들기도. (A - D) 음극 정사각형 'U'형상으로 포셉 먼저 곧게되는 사각형 상자 필라멘트 (A), (B), 그리고, 굴곡부에서 이루어진다 (C - D). 애노드 두꺼운 금 전극 (D)를 스쳐; 팁 노출. (E) 일렉트로 설정의 0.5 mm를 떠나, 양극 전극 주위의 절연을 알 수 있습니다. 삽입 된 박스 영역의 높은 배율을 보여줍니다.페이지 "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
Electroporation에 대한 망막 컵 그림 2. 준비. RPE는 조심스럽게 날카로운 뒤몽 핀셋을 사용하여 탈핵 눈에서 제거 햄버거와 해밀턴 배아 단계 27 (B)에서 () 병아리 배아. (C) 오른쪽에있는 망막 컵 RPE없는 및 전기에 대한 준비가되어 있습니다. (D ) 캐소드 전극은 플라스미드 용액으로 채워진 1.5 ㎖의 microcentrifuge 관 뚜껑에서 만든 전기 챔버 내부에 위치한다. 망막 컵 신중 위를 향 음극으로 전송되고, 양극 전극은 렌즈 옆에, 상단에 배치됩니다. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의.

그림 3
후 배양 된 세포에 형질 전환 유전자 발현의 그림 3. 효율성 일렉트로 (A - C). 망막 컵이 해리, 4 일간 배양, GFP 발현 플라스미드로 전기 천공 하였다. 형광 현미경은 DAPI 염색 핵 (A) 및 GFP 발현 망막 세포 (B)를 나타낸다. 안티 Visinin 항체 염색 (C) 시각 세포를 식별하기 위해 수행 하였다. (D) 그래프는 전체 세포 집단 (포지티브 DAPI) 사이 또는 감광체 중에서 발현 세포 GFP의 백분율로 표시되는 전기 오보 전 달성 형질 전환 효율을 나타내는 특히 인구 (Visinin 긍정적). 결과는 5 독립적 인 실험의 SEM ± 평균을 나타냅니다. 규모 바 (A - C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 프로토콜의 성공을위한 가장 중요한 단계는 배아의 적절한 단계를 선택하는 것입니다. 이전의 출판물에서, 배아 단계의 범위는 일반적으로 배양 또는 배아 일의 일 (ED)에 의해 정의 된, 이러한 문화에 대한 주어진다; 따라서 보통 ED 6 배아 ED 5를 사용하여 동등한 결과를 얻을 수 있다고 가정한다. 그러나 우리는 전술 한 바와 같이 단계 (27) (ED 5)에 형질 전환 효율, 전체 세포 인구의 약 22 %가 될 것입니다 것으로 나타났습니다; 아직 효율이 단계를 단계 29에서 28 배아 (ED 5.5) 및 12 % (ED 6)을 사용하는 경우 16 %로 감소 1.합니다 다른 중요한 단계는 공정 전반에 걸쳐 무균 조건을 유지 포함한다; 필요한 손재주를 획득하는 해부 및 전기 중 망막의 손상을 방지하기 위해; 세포 도금 시간 배아 컬렉션으로부터 긴 시간 간격을 피.

또 다른 중요한 고려 사항은 좋은 형질 efficien을 보장하기 위해CIES는 플라스미드 - 함유 용액의 농도 : 1.5 μg의 추천 / μL 우리 효율의 저하를 초래하지 않았다 시험 최저 농도이다. 망막 컵 그 용액에 목욕 것을 고려할 때,이 농도는 플라스미드 재료의 많은 양으로 변환한다. (예 microcentrifuge 관 덮개 등)를 수용 할 눈 작은 크기 웰을 사용하여이 문제를 최소화 할 수있다. 또한, 몇몇의 눈은 동일한 용액을 이용하여 전기 천공 할 수있다; 같은 플라스미드 용액에 연속적으로 6 망막 컵까지 electroporating 때 우리는 효율의 감소를 보지 못했지만, 더 많은 가능성이 수행 될 수 있지만, 우리는 그 후 효율의 차이를 입증 할 수 없습니다.

이전에 출판 된 프로토콜은 일반적으로 배양 이러한 유형의 유전자 전달의 낮은 효율을 제공하고, 따라서 그들은 종종 L 세포에 효소 반응의 생성물을 측정하는 기술에 의존해야만감도를 증가시키기 위해 ysate. 이러한 접근은 세포 형 차별 항상 큰 세포 집단의 동작을 반영하지 않을 수도 관측 결과에 대한 책임되는 세포의 낮은 숫자의 수에 의존하지 않는 단점이있다. 저효율의 문제를 회피하는 다른 방법은 종래의 눈 적출술 및 배양, 생체 내에서 유전자 형질 전환을 수행하는 것이다. 이것은 실용적인 접근법이지만 플라스미드 전기 및 RCA 단자 바이러스 감염 (병아리 공통 유전자 전달 벡터) 모두는 일반적으로 초기 발달 단계에서 수행되어야 할 필요가 없기 때문에 보통 사이의 시간 지연을 만들어, 특정 실험 패러다임에 적용 할 수있다 형질과 문화. 그 시간 지연 동안 세포 외 미세 환경뿐만 아니라 세포 내 인자 모두의 효과에 노출되기 때문 특급의 해석에 중요한 의미를 갖는, 중요한 고려erimental 결과. 대조적으로, 전기 천공 방법 오보 EX 달성 유전자 전달 효율의 실질적인 증가는 셀 고유 방식으로 유전자 기능 연구를 허용한다. 자동화 높은 처리량 세포 분석 (1)와 함께 사용하면 또한이 높은 형질 속도의 장점은 더욱 증가 될 수있다.

이 기술의 개발의 초기 단계에서, 우리는 다른 조건을 달성 전기의 효율을 평가하기 위해 24 시간 동안 배양 RPE-없는 아이 컵 일렉트로 유지 하였다. 우리는 시간의 긴 기간 동안 배양 그들을 시도하지 않았지만, 우리의 경험은 본 명세서에 기술 된 프로토콜은 또한 적절한 장기 이식편의 배양 조건은 사용되는 제공된, 망막의 Organotypic 이식편에 의존 연구에 적용 할 수 있음을 나타낸다.

마지막으로, 일의 적용을 확대 할 수있을 것이다다른 동물 모델에 전기 방식 비켜 예이다. 이 프로토콜을 이용하여 생후 1 일 또는 4에서 마우스 눈의 경험 형질 예를 들어 이식편 배양 질적 좋은 결과를 산출하지만, 해리 된 세포 배양이 시도 될 때 형질 전환 효율은 다른 기술과 동일한 6 %,의 순서였다. 따라서,이 동물 모델이 다른 프로토콜 간단한 대안이 될 수 있지만, 높은 효율이 요구되는 경우에 특정 시스템에 대해 최적화 될 필요가있을 것이다. 참고로, 상기 한 바와 같이, 전기 천공시의 배아 단계에서 얻어진 병아리 고효율 결과에 키, 그래서 다른 모델에 기술을 적용 할 때,이 파라미터는주의 깊게 고려되어야한다.

강력한 도구가 생체 내 연구에서 보완 결론적으로, 전기 천공 법 오보 EX는 N을 제공 체외 망막 시스템의 적용 범위를 확장 할 수망막 연구 EW 가능성.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 Electro Square Porator BTX/ Harvard Apparatus 45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip BTX/ Harvard Apparatus 45-0115 model 512 Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing Vention Medical custom made Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide Sutter Instrument Company FB245B Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco - Life Technologies 14175-095
Moloney forceps Roboz RS-8254 Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45 Roboz RS-5058 Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1x2 teeth Roboz RS-5172 Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75" Length; 0.3 mm Tip Width

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References

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