분리 및 설치류 대동맥 절제; 심혈관 질환의 연구에 다목적 기술

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Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease. J. Vis. Exp. (93), e52172, doi:10.3791/52172 (2014).

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Abstract

Introduction

대동맥 산소화 된 혈액과 신체의 다른 부분들과 유사한 몸체 공급 심혈관 기능의 중추적 인 역할을하는 질병에 민감하다. 일반 대동맥 질환 다이어트, 흡연, 앉아있는 생활 습관 하나를 포함하여 유전 적, 환경 적 요인의 결과이다 죽상 동맥 경화증과 동맥류를 포함한다. 죽상 경화증은 전형적 만성 고지혈증이있는 환자에서 발견 대동맥 벽 칼슘 및 지질 계 플라크의 침착이다. 궁극적 동맥류 파열로 이어질 수 대직 다음 대동맥과 용기 벽의 박막화의 구성 부품의 분해에 의해 특징 지어진다.

동물 모델은 질병과 잠재적 치료 효과의 메커니즘을 연구하는 데 중요한 도구입니다. 심혈관 연구에 사용 된 일반적인 동물 모델은, 구체적으로는 혈관 및 대사 장애를 조사 조회예컨대 아포지 단백질 E 유전자 녹아웃 및 저밀도 지단백질 수용체 유전자 녹아웃 마우스 (4)와 같은 지질 수준을 변경할 수있는 유전자 변형 마우스를 포함한다. 질병 및 치료의 효능을 평가하는 메커니즘 방법 중 대부분은 대동맥의 분리 및 절제를 포함한다.

대동맥 지역화 및 격리되면, 형태 계측 학적 분석은 동맥류의 존재하에, 일반적으로 직경 5 이상, 50 % 증가로 정의 된 바와 같이 결정될 수있다. 계내 분석 필요가 완료된 후, 대동맥을 적출 추가 분석 할 수있다. 절개 된 대동맥 단백질 및 / 또는 유전자 발현 분석법 또는 분자 연구를 수행 할 수있는 냉동 플래시 4 % 파라 포름 알데히드를 사용하여 고정 이상, 매립 단면 조직 학적 분석을 위해 염색. 대동맥의 조직 학적 분석은 구조 저하, 플라크 형성하고, 백혈구의 침투와 같은 대동맥 질환의 공통적 인 특징을 보여줄 수있는 <SUP> 6,7. 또한 대동맥 절개이어서 관내 연구 (7)의 다양한 사용될 수 내피 및 평활근 세포를 포함한 일차 세포주를 분리 할 수있다.

현재, 대동맥 질환이 심도있는 특성을 제공 할뿐만 아니라 추가로 심혈관 질환을 연구하는 도구와 연구자를 제공 할 다른 방법이 없습니다. 자기 공명 영상, 컴퓨터 단층 촬영과 같은 초음파 이미징을 그러나 이것은 작은 동물 어렵고 적절한 기술 취득 장치 8 비싸 형태학 대동맥을 평가하는 가장 가까운 방법이다. 불멸화 세포주는하지만이 세포의 인공 자연 세포 생존 구간 및 아폽토시스 9 효과를 연구에 제한되는 질병의 치료 효능의 잠재적 기전을 조사하기 위해 구입할 수있다.

의 전반적인 목표이 원고는 심혈관 질환의 조사에 쥐의 대동맥의 무균 분리 및 절단을 입증하는 것입니다.

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Protocol

모든 동물의 절차는, 신시내티 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회와 국립 보건원 (National Institutes of Health)에서 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서에 따라 승인 (NIH 공개 제 85-23으로 수행 하였다 ) 1996 개정.

1. 마우스를 준비

  1. 마취의 supratherapeutic 복용량에 동물을 노출시켜 안락사, 이소 플루 란은 효과를 흡입. 유해 자극으로 발가락 핀치를 통해 주 안락사를 확인합니다. 안락사, 다이아 프램 절단의 보조 방법은, 곧 단계에서 발생합니다. 다른 방법도 사용할 부여 안락사 수득 될 수있다.
  2. Sanitizie 수분의 포인트에 70 % 에탄올로, 초기 상처가 될 것이다 복부, 함께 모피를 분사하여 마우스의 외부 표면은되도록 모피 에탄올 젖은이며 느슨한 / 마른 머리카락은 입력하지 지역.
  3. 쉬르에 마우스를 배치합니다상부 및 하부 부속와 앙와위에서 학적 보드 바깥쪽으로 확장.
  4. 수술 테이프를 사용하여 보드에 대한 보안 부속.

심장 및 대동맥 2. 분리

  1. 마우스를 적절하게 배치 한 후, 찾아 흉골의 칼 모양의 과정에 불과 열등한 복부 피부를 분리하기 위해 집게를 사용합니다.
  2. 똑바로 피부를 들어 올려 긴장을 만들고 복막 및​​ 흉강의 열등한 부분의 우수한 부분을 노출, 표피를 제거하기 위해 가위를 사용합니다.
  3. 칼 모양의 과정을 들어 올리고 subcostal 여백 따라 처리 단지 열등한 측면 절개하여 복강을 입력합니다.
  4. 심장이나 주요 혈관을 괴롭히다하지 확인되고, 다이어프램을 통과, 흉강들로 해부하다.
  5. 흉곽의 앞쪽 부분을 제거하는 단계 2.3 두개쪽으로에서 만든 횡 절개를 확장 할 수 있습니다. 면필요에 무딘 절개를 이용하여 전방 흉벽에서 심장 무료.
  6. 물질을 흡수하는 멸균 거즈를 사용하여 외부 피와 유체의 흉강을 청소합니다. 지역이 더 눈에 보이는되면, 더 나은 심장과 대동맥을 노출 폐를 제거합니다.

심장 및 대동맥 3. 관류

참고 :이 단계 그래서 그냥 전에해야, 혈액을 심장 천자를 통해을 구하십시오.

  1. 살균 얼음 차가운 1X 인산 완충 용액 (PBS)의 10 ㎖로 10 CC 주사기를 가득 채운 후 주사기에 25 게이지 바늘을 연결합니다.
  2. 조심스럽게 심장의 좌심실에 바늘을 삽입합니다.
  3. 관류에서 압력 상승을 완화하기 우심방을 잘라. 3 분 - 2 위에 마우스로 주사기의 내용을 관류.
  4. 관류 액을 흡수 우심방에서 개막식에서 멸균 거즈를 사용합니다.

대동맥 4. 분리 및 절제

  1. PE 완료되면rfusion, 흉강 내 시야를 흐리게 남아있는 액체를 흡수하는 멸균 거즈를 사용합니다.
  2. 치골 상부 지역에 절개를 확장, 복부 벽을 통해 꼬리 쪽 절단하여 위장 내용을 노출. 양자 아래로 고정 또는 절제 할 수 있습니다 피부 플랩을 만들 낮은 사지를 향해 더 절개를 확장합니다.
  3. 더 나은 대동맥을 시각화 간, 췌장, 위, 비장, 창자의 로브를 제거합니다. 대동맥은 신장 동맥의 가지에서 피상적으로, perirenal 지역 근처 해부 할 때주의하십시오.
    참고 : 정확한에서이 단계를 수행하고 위장관 오염에 대한 성향을 증가 세균이 풍부으로 방법을 진학.
  4. 1X PBS와 지역을 씻어 멸균 거즈로 흡수에 의해 모든 유체를 제거합니다.
  5. 멸균 microscissors과 microforceps를 사용하여 척추의 등쪽과 복부 식도에서 대동맥을 구분합니다.그것은 무딘 해부 및 이에 대한 해부 현미경을 이용를 사용하는 것이 가장 좋은 방법입니다.
    참고 : 대동맥을 분리에서 장골 분기에 꼬리 쪽 시작하고 꼬리 쪽 해부 경동맥과 완두 동맥에서 두개쪽으로 두개쪽으로 청소 및 공동의 등면에서 대동맥을 분리 이동하거나 시작합니다. 어느 방법이 적절한 지와 연구자의 편안함에 달려있다.
  6. 대동맥 벽의 일부를 제거하지 않도록 확인되는 미세 microscissors를 사용하여 혈관 주위 지방 조직을 제거합니다. 이것은 대동맥 평활근 세포를 배양 할 때 섬유 아세포 오염 가능성을 최소화하는 것이 필수적이다.

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Representative Results

절차가 완료되면, 여전히 (그림 1A)에 부착 된 신장 동맥 흉부 및 복강으로 내려 심장에서 발생하는 손상 대동맥이 될 것입니다. 여기에서, 대동맥이 복부 대 동맥류 (그림 1B1C)의 연구에서 진단이다 형태 학적 변화를 정량화하기 위해 현장에서 이미징 할 수있다. 그 후, 대동맥, 제거 고정 및 조직 학적 변화를보고 염색 할 수있다. 대동맥 일반적인 공통 얼룩이 마톡 실린 및 에오신 염색 (도 2a 및도 2b)이다. 또한, 대동맥의 구조적 무결성 질적 엘라스틴 밴드 (그림 2C2D)를보고 Verhoff 반 Geison 염색을 사용하여 정량화 할 수있다. 대신 조직 학적 분석을 얻기의, 깜박일 수 있습니다 연구자 후속 단백질과 리보 핵산의 expre의 대동맥을 동결ssion. 조사자에 대한 마지막 옵션은 일차 전지 격리를 획득하기 위해 대동맥을 사용하는 것이다. 이러한 세포 배양 (도 3a)에서 성장 및 생존 연구 (도 3B) 및 단백질 현지화 (도 3C)를 포함한 체외 다양한 연구에 사용될 수있다.

그림 1
쥐의 대동맥의 현장 대표 이미지에서 그림 1. (A) 심장과 신장을 포함하여 대동맥의 분리 후 정상 마우스 해부학의 묘사를. (B) 일반 그대로 쥐의 복부 대동맥의 이미지를 확대했습니다. (C) 부신에서 동맥류와 병에 걸린 복부 대동맥의 이미지 확대 지역. 일의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림입니다.

그림 2
쥐의 대동맥 2. 조직 학적 분석을 그림. 20 배 배율 (A) 건강 부신 대동맥의 정상 헤 마톡 실린 및 에오신 얼룩의 대표 이미지입니다. (B) 20 배 배율에서 헤 마톡 실린 및 에오신 염색 후 교내 혈전 동맥류 부신 대동맥의 대표 이미지입니다. (C)의 대표 이미지 10 배 배율에서 정상 부신 대동맥의 탄력 밴드를 강조 Verhoff 반 Geison 얼룩. (D) 선화과 엘라스틴 밴드와 농축의 striating에 의해 언급 부신 대동맥 개발 질병의 탄력 밴드를 강조 Verhoff 반 Geison 얼룩의 대표 이미지 외막 층의. 제발 CLI이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 CK.

그림 3
그림 3. 주요 대동맥 근육 세포는 대동맥에서 배양. (A) 복부 대동맥으로부터 수득 20X 배율에서 배양 주 대동맥 근세포의 대표 화상. (B)로부터 얻어지는 20X 배율로 H 2 O (2)의 500 μM을 처리 한 후 트립 판 블루 배제 분석법 중 주 대동맥 근세포의 대표 화상 복부 대동맥. (C) 복부 대동맥에서 차 분리 대동맥 평활근 세포에서 알파 액틴에 대한 면역 조직 화학 염색의 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

저자는 어떤 승인이 없습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Med-Vet International #RXISO-250
70% ethanol Fisher 07-678-001
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P5368-10PAK
Surgical tape 3M 1527-1
Sterile gauze Dukal Corporations 1312
25 gauge needle BD 305122
10 ml syringe BD 309604

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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