本地化识别,切除脂肪小鼠油库,并

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Summary

由于肥胖等合并症之间的激烈负极连接,对脂肪的作用发挥的研究在疾病和整体健康是必要的。我们提出了一个协议,用于分离和脂肪仓库允许利用原位脂肪研究的切除和体外方法。

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Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J. Vis. Exp. (94), e52174, doi:10.3791/52174 (2014).

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Abstract

Introduction

脂肪做了一个显着的出现在媒体的聚光灯下,由于在过去几十年的20世纪肥胖的急剧增加。目前,肥胖的影响超过三分之一的成年人和在美国(美国)1儿童和青少年的17%。跨越各族,周围肥胖的统计研究表明,非西班牙裔黑人有肥胖(49.5%)的最高年龄调整率与墨西哥裔美国人(40.4%),所有西班牙裔(39.1%),和非比较西班牙裔白人(34.3%),2。肥胖的经济效应也为医疗保健系统日益受到关注。在2012年,据估计,每年的医疗照顾,肥胖在美国,2005年费用为190.2十亿,近21%的整体医疗支出预算。可悲的是,儿童肥胖,估计是负责单独$ 14十亿的直接医疗费用。在统计上,它被确定的平均医疗费用肥胖人士是2741美元高于去年比没有这种发病率3-5。

肥胖是用于各种诸如条件的主要危险因素:2型糖尿病,血脂异常,心血管疾病,癌症,肌肉骨骼疾病和慢性炎症。肥胖是深深依赖于代谢综合征等慢性疾病6-8的发病机制。随着肥胖等合并症之间的这种激烈的负极连接,科研集中注意力,以便更好地了解当前的流行和脂肪所扮演的多样和重要的角色。

从历史上看,脂肪组织被认为是无关紧要的,并仅仅看作是一个简单的填充组织。目前,脂肪已被证明在体内的功能中发挥许多重要作用:代谢,激素调节,炎症,保护和绝缘9。脂肪组织主要由脂肪细胞还含有周细胞,血管内皮细胞,单核细胞,巨噬细胞和多能干细胞8。脂肪组织是分布在整个身体中不同的仓库。主体仓库可以皮下发现,皮下,肌肉内,和本能10。脂肪库已被证明有仓库特定的代谢概况,从而衍生出一个仓库特定易感性肥胖及相关病症8。

传统上,脂肪组织已被分为两种主要类型:白色脂肪组织(WAT)和棕色脂肪组织(BAT);虽然最近的文献表明,第三组的派驻命名BRITE或米色脂肪11。脂肪组织已被证明具有不同的颜色,形态,代谢功能,生化特征和表达10的遗传模式。在WAT脂肪细胞有一个单一的,大的脂滴和线粒体的数量可变。 WAT在身体的皮下和内脏地方是显性找到。 WAT功能主要是作为能量储存和器官保护的部位。在BAT脂肪细胞有一个多房形态和丰富的线粒体。 BAT位于主要在颈部和胸部的大血管,以及肩胛12。 BAT主要功能是调节产热7能源花费的行为。 BRITE或米色脂肪已经显示的,共享一个类似的形态和表达BAT但已被发现是源自白色脂肪细胞11。

在这个手稿中描述的手术方法为研究人员提供的能力,分析不同效果的因素,如:环境,医药,和遗传学,对脂肪;以及有益或有害作用的脂肪起着病和总体健康状况。此外,提供了一种方法来鉴定和分离不同类型的脂肪组织,以以便更好地了解车厂之间的生化关系和差异。这可以在确定身体内的位置,功能,和类型的脂肪之间的关系提供帮助。该所述方法通过提供用于毛可视化,基因表达分析,蛋白质表达分析,组织学检查,以及初级细胞系的隔离体外研究实现这一目的。目前,有许多文章,提供深入了解不同脂肪库,以及它们的解剖位置的代谢行为;但不提供一个深入的方法,对如何具体定位,识别和隔离这些仓库。这种手术方法提供了精确的技术,其允许多个站的具有夹层和污染的最小量相比较,以设计用于一个或两个仓库13-14的分离方法更为隔离。

该协议的目的是提供精确的方法对不同类型的多个解剖位置脂肪库的鉴定和分离。

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Protocol

注:所有动物的程序都与辛辛那提大学的机构动物护理和使用委员会(IACUC),并按照该指南实验动物的护理和使用来自美国国立卫生研究院(NIH出版号的审批进行,85-23,1996年修订)。

1.安乐死和消毒鼠标

  1. 鼠标放置在含有异氟醚的supratheraputic剂量的Dropbox,并允许吸气效果。一旦老鼠被安乐死,从包装盒中取出。
  2. 与颈部脱臼安乐死的第二个手段。
  3. 由清洁的动物用70%乙醇消毒鼠标的外表面上。

2.识别和三种不同脂肪仓库隔离

  1. 棕色脂肪组织(BAT)隔离:
    1. 确保毛皮是由酒精清洗湿通过表皮和真皮Laye的削减,以帮助RS。
    2. 将鼠标在其对表背仰卧位。
    3. 抢皮肤正下方用钳子,电梯隔膜和切割用剪刀。
    4. 切割横向围绕鼠标的圆周以露出腹膜。
    5. 由脱套鼠标的上半部分显示蝴蝶形的BAT仓库。保持较低的附属物和腹部,一手提拉肌肤,迈向头。
    6. 定向鼠标,以便它被定位俯卧在桌子上。要小心,不要污染暴露车厂的头发。
    7. 洁净手术器械和改变一双崭新的手套。
    8. 找到肩胛和相应的库。小心取出任何肤浅的白色脂肪之上蝴蝶,然后解剖的肩胛间棕色脂肪的蝴蝶。小心避免与棕色脂肪密切相关的肌肉。
      注意:使用解剖显微镜,建议去除W的海特脂肪,以及在从肩胛褐色脂肪的分离。
    9. 去除脂肪库,并转移到2 ml离心管。
    10. 如果RNA或蛋白质要被提取出来,冻结由浸没在液氮中,并存储所述组织在-80℃下。冻结的样品时,为了防止恶化。如果培养,涵盖DMEF-12组织和冰上设置,直到所有的样品采集文化(补充信息)。
  2. 皮下脂肪组织(SQ)的隔离,一个白色脂肪组织得宝(WAT):
    1. 穿上一双崭新的手套作为脂肪仓库之间没有交叉不纯物。
    2. 露出腹股沟,三角SQ库由去手套革底部鼠标的一半。用于保持上附肢和胸部,一手拉动皮肤向下朝向脚用另一只手。
    3. 定位鼠标在仰卧位时注意不要污染暴露车厂的头发。
    4. 清洁surgica升仪器和改变一双崭新的手套。
    5. 仔细剖析的SQ脂肪的三角形。要小心,不要污染样品肌肉,脂肪的邻国,乳腺或切割任何船只和污染的血液样本。
      注意:使用解剖显微镜,建议如果边界不清晰。
    6. 去除脂肪仓库和转让〜2毫升离心管。
    7. 如果RNA或蛋白质要被提取出来,冻结由浸没在液氮中,并存储所述组织在-80℃下。冻结的样品时,为了防止恶化。
    8. 对于染色,固定或嵌入在十月如果培养,涵盖DMEF-12组织和冰上设置,直到所有的样品采集文化(补充信息)。
  3. 隔离性腺脂肪内脏脂肪组织(VAT)和白色脂肪组织(WAT)车厂:
    1. 穿上一双崭新的手套作为脂肪仓库之间没有交叉不纯物。
    2. 脊髓损伤ssors,切开腹膜横向,正下方​​的隔膜。从隔膜到直肠中间剪开腹膜冠,露出腹部器官。
    3. 定位睾丸或卵巢,并确定所连接的白色脂肪组织,称为附睾脂肪在雄性或性腺脂肪在女性。
    4. 洁净手术器械和改变一双崭新的手套
    5. 仔细剖析从睾丸,附睾和输精管附睾两种脂肪库。或者,如果女性,小心地从卵巢解剖两种性腺脂肪垫。
    6. 去除脂肪库,并将它们传送至2 ml离心管中。
    7. 如果RNA或蛋白质要被提取出来,冻结由浸没在液氮中,并存储所述组织在-80℃下。冻结的样品时,为了防止恶化。
    8. 对于染色,固定或嵌入在十月如果培养,涵盖DMEF-12组织和冰上设置,直到所有的样品采集文化(补充信息)。

    3.隔离血管周围脂肪组织(PVAT)

    1. 孤立的心:
      1. 莱鼠标在与向外扩展上下附属物仰卧位。
      2. 安全附属物使用医用胶带。
      3. 之后将鼠标上面列出,通过在剑突与钳提起制造紧张。水平切割通过隔膜,暴露胸腔的下部。
      4. 同时维持张力,通过在剑突抬起,通过胸腔切开优朝向头部,只是到胸骨的一侧。
      5. 拿起左肋只是次于锁骨,并沿着锁骨下长度切出朝向两个方向的腋下。胸腔和它的内容(心脏,肺 )现在应该清楚可见。
      6. 通过使用无菌GA清洁胸外来​​血液和液体腔UZE吸收流体。如果收集器官或容器一定要喷出大量(补充信息)。
      7. 一旦该区域被清除的液体,切支气管和血管连接以消除肺部,从而更好的暴露的心脏。
    2. 本地化和主动脉切除血管周围脂肪组织(PVAT):
      1. 删除以下机关更好地识别主动脉的下部分:肝,胃,脾,胰,肠和结肠癌。
      2. 首先从识别胃和食管。切开食管的胃食管结合部,以释放从身体的腹部。
      3. 其次,确定肠子和周围的肠系膜。切割表面通过肠系膜,因为它位于非常接近主动脉的肾部分,然后“运行肠”。
      4. 切结肠释放尽量靠近直肠越好。因此,释放的胃,肠和结肠的鼠标。
      5. 回复通过在附着肠系膜血管和切割移动胃,肠,结肠,胰腺和脾脏。胰腺和脾脏应该是免费的胃,小肠和结肠。
      6. 通过削减通过肝静脉和肠系膜连接取出肝脏,删除所有叶。
      7. 剪去内脏层和脂肪包围的肾脏。离开附加到主动脉体内肾脏作为地理标记主动脉的不同部分。
      8. 冲洗用无菌1X PBS面积和吸收删除所有流体用无菌纱布。
      9. 用微型剪刀和微型镊子,从它的背侧连接到脊椎和其腹侧附着到食道分离主动脉。
      10. 按照和分离主动脉降主动脉的长度从原点的心脏在髂骨地区分叉隔离主动脉。
      11. 识别并隔离锁骨下血管。隔离这些船只从脖子到主动脉根部,以更好地暴露在心脏主动脉结和根。
      12. 取出胸腺然后切头臂动脉,左颈总动脉和左锁骨下动脉,使心脏的运动。
      13. 用解剖显微镜的帮助下,查看围绕主动脉的血管周围脂肪组织(PVAT)层。
      14. 采取非常谨慎,不捏或挤压PVAT,轻轻一拉PVAT方式,从微型钳主动脉。轻轻切PVAT的附接至与起始于胸部区域刚好优于其中隔膜位于微型剪刀主动脉。
        注:解剖镜下建议。
      15. 重复此过程主动脉的整个长度,在下腹主动脉区域,它位于正好优于主动脉血管的髂分叉精加工。
      16. 如果主动脉弓PVAT需要,用同样的方法从较小的c取出PVATurvature拱。
      17. 将PVAT样品分为2 ml离心管(S)。
      18. 如果RNA或蛋白质要被提取出来,冻结由浸没在液氮中,并存储所述组织在-80℃下。冻结的样品时,为了防止恶化。如果培养,涵盖DMEF-12组织和冰上设置,直到所有的样品采集文化(补充信息)。
        注意:如果有兴趣全面脂肪车厂分析更多的脂肪车厂考虑包括:腹膜后,肠系膜,大网膜,心包及腘。

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Representative Results

识别和腹股沟皮下脂肪,肩胛间褐色脂肪,内脏附睾脂肪( 图1),以及主动脉弓血管周围脂肪,胸主动脉脂肪,肾上主动脉脂肪和下腹主动脉脂肪的本地化( 图2),使用取得了成功所描述的手术方法。 BAT和WAT样品之间的组织学检查和分化采用HE染色(H&E)染色( 图3)进行了积极评价。脂联素(ADIPOQ),过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ),的RNA水平的细胞死亡诱导DFFA样效应子A(CIDEA),和其他脂肪特异性标记测定了所有上述分离并切仓库的分析(数据未显示)。

皮下脂肪细胞和血管周围脂肪细胞的原代细胞系进行培养,并从前脂肪细胞分化 s到脂肪细胞成功地为微阵列分析。转化为脂肪细胞的培养的前体脂肪细胞被证实与油红O染色( 图4)。成功的分离,培养和脂肪细胞的分化被用于在体外研究中实现的,而蛋白质的活性被成功测量。矩阵metaloprotease-2(MMP2)的酶活性测定在治疗组与对照相比。 MMP2的活性通过酶谱分析( 图5)测量的原位在主血管周围脂肪细胞系。

图1
图中C57BL / 6雄性小鼠的脂肪车厂1.解剖位置。 (A)肩胛间棕色脂肪脂肪的仓库。(B)腹股沟皮下脂肪脂肪的仓库。(C)内脏脂肪附睾脂肪库。w.jove.com/files/ftp_upload/52174/52174fig1highres.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图2
图PVAT车厂在C57BL / 6雄性小鼠2解剖位置。 (A)主动脉弓血管周围脂肪仓库。(B)胸主动脉血管周围脂肪仓库。(C)肾上主动脉血管周围脂肪仓库。(D)下腹主动脉血管周围脂肪车厂。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
BAT和WAT脂肪的图3. H&E染色。 (A)H 8,多聚甲醛的E染色固定,石蜡包埋C57BL / 6雄性小鼠WAT脂肪在40倍放大倍率的样品(B)H&E固定多聚甲醛的染色,石蜡包埋C57BL / 6雄性小鼠BAT的在40倍放大倍率的样品。 请点击这里查看这个数字的放大版本。

图4
图中培养的前脂肪细胞PVAT和脂肪细胞4.油红O染色。培养主动脉血管周围脂肪前体细胞(A)油红O染色,在分化的放大倍数20X相衬基线。(B)的培养主动脉血管周围脂肪细胞后第5天的差异在20倍放大倍率相差油红O染色。ES / ftp_upload / 52174 / 52174fig3highres.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5.酶谱分化的脂肪细胞,分离出血管周围脂肪组织 ,表现出了降低的活性MMP2处理后释放的相比,未经处理(对照)细胞,* p <0.01与对照相比。

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Discussion

肥胖可能导致大的宿主疾病发病率和该脂肪起着尚不完全清楚的作用的充分理解;因此继续研究在脂肪的字段是必要的。动物模型,特别是小鼠模型非常适合在疾病和潜在的药物治疗试验的进展最初的研究。在使用这些模型,精确的隔离和脂肪车厂切除脂肪影响了疾病的病理研究中的一个非常重要和必要的工具。

在关于脂肪库目前的文献,有文献关于代谢行为和脂肪仓库之间的变化,以及它们的解剖位置相当量。不过,也有少数提供了一个深入的方法,对如何具体定位,识别和隔离这些仓库。基于对当前隔离脂肪的方法的审查,有协议吨的一小部分帽提供有关如何隔离一个或两个仓库在一个时间的方法。然而,精确的技术,其允许多个站与解剖和污染的最小量,以及地址学习收集的样本的各种方法的隔离是独特的,以该协议13-14。

在该方法中,有几个步骤是非常重要的样品的分离和纯度。清洁工具,手套和表面经常清除头发和污染物是必要的步骤,以避免车厂污染。当切割皮肤横向围绕鼠标以暴露腹膜为脱套的圆周上,这是至关重要的,以避免切割太深。切割腹膜会使脱套非常困难,并会提高潜在的样品的污染。当切除SQ脂肪库是至关重要切除任何广告之前识别车厂的三角边界ipose。此外,细心的削减应避免肌肉和邻近血管,腺体和脂肪。这将防止从备用脂肪,腺组织,肌肉或血液样品的污染。

的主要限制隔离和脂肪库,在该方法及其它类似方法的切除可以在某些仓库的界限的限定中找到。由于仓库的定义不清的边界,如皮下油库,隔离来自相邻脂肪缺乏少量的污染可能是具有挑战性的。另一个限制可以保证足够的组织被收集用于补充实验中相关的血管站被发现。这种限制有时需要样品池,虽然这依赖于隔离的部位,并与动物有关的饮食。

后脂肪仓库被隔离,它们可用于多种分析方法。脂肪可使用d表示分子研究,例如蛋白质表达,酶活性和基因表达分析。此外,一个可以隔离脂肪细胞用于体外研究的初级细胞系。永生化细胞系也可用于体外研究,但是不死细胞不是可信的一次分离的细胞系。最后,该脂肪可以固定或冷冻在十月用于组织学检查,以确定白细胞浸润,蛋白质定位,以及脂肪细胞的形态学特征。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Med-Vet International #RXISO-250
70% Ethanol Fisher 07-678-001
DMEF-12 Sigma Aldrich D-6421 Warm in waterbath before putting on tissue.
2 ml Microcentrifuge tubes Midsci MCT-200-C-S
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P5368-10PAK

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References

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