औषध अनुसंधान के लिए अलग ऊतक स्नान-अनुप्रयोगों में चिकनी मांसपेशी समारोह के मापन

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Jespersen, B., Tykocki, N. R., Watts, S. W., Cobbett, P. J. Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research. J. Vis. Exp. (95), e52324, doi:10.3791/52324 (2015).

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Abstract

Introduction

औषध विज्ञान के अनुशासन में 150 से अधिक वर्षों के लिए पृथक ऊतक स्नान प्रणाली का इस्तेमाल किया गया है। इस प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा ऐसे उच्च रक्तचाप, दिल की विफलता, मधुमेह, जठरांत्र रोग, मूत्राशय जैसे रोगों या विकारों के साथ व्यक्तियों के लाखों लोगों का इलाज किया है कि चिकित्सा के आधार बनाने के लिए इस ज्ञान के साथ, रिसेप्टर्स और रिसेप्टर संकेत पारगमन चिह्नित करने के लिए दुनिया भर के वैज्ञानिकों की अनुमति दी है रोग, अस्थमा, और निगल विकारों, बस कुछ ही नाम के लिए। यह ऊतक एक ऊतक के रूप में कार्य करने के लिए अनुमति देता है के रूप में इस दिन के लिए, पृथक ऊतक स्नान, दवा के विकास और बुनियादी अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण पहलू बनी हुई है। इस जौव पाठ में, एक औपचारिक प्रोटोकॉल रिसेप्टर लक्षण वर्णन परमिट जो isometric संकुचन उपाय है कि एक पृथक ऊतक स्नान प्रयोग से डेटा का उपयोग एक दृश्य और आभासी प्रयोग प्रदर्शित करने के लिए साझा किया जाता है।

इस तकनीक का प्राथमिक लाभ ऊतक एक रह रही है वह यह है किशरीर के लिए प्रासंगिक है कि एक शारीरिक परिणाम (संकुचन या विश्राम) के साथ एक पूरी ऊतक के रूप में एन डी काम करता है। यह कदम (दवा-रिसेप्टर बातचीत, संकेत पारगमन, दूसरा दूत पीढ़ी, चिकनी पेशी excitability के में बदलने के लिए, और ऊतक समारोह में परिवर्तन) के एक संश्लेषण है। अन्य तकनीकों के इन चरणों में से प्रत्येक के अध्ययन (जैसे radioligand दवा आत्मीयता, दूसरा दूतों की माप के लिए बाध्यकारी) की अनुमति, पृथक ऊतक स्नान तकनीक इन सभी चरणों एक के एकीकरण के लिए अनुमति देता है। एक और लाभ यह ऊतक समारोह को बनाए रखना एक सेलुलर सेटिंग बनाम एक ऊतक में अधिक सार्थक कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण औषधीय चर की गणना है कि परमिट है; यह जांच की दवाओं के एक पूरे के रूप में शरीर में कैसे काम करेगा के करीब आता है।

Protocol

नोट: इस पत्र में वर्णित सभी प्रक्रियाओं मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा स्थापित दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाता है।

1. सिस्टम तैयारी और सेटअप

  1. 50 मिलीलीटर ऊतक स्नान करने के लिए उपयोग करता है कि एक ऊतक स्नान संकुचन प्रयोग के लिए आवश्यक राशि है जो एक शारीरिक नमक समाधान (पीएसएस), के 5 एल बनाओ; पीएसएस नुस्खा के लिए 2 टेबल देखें। आवश्यक ऊतक washes की संख्या से गुणा तो ऊतक स्नान की संख्या टाइम्स स्नान मात्रा बढ़ रही है और द्वारा कुल आवश्यक मात्रा की गणना।
    1. पी एस एस बनाने के लिए एक गाइड के रूप में 2 टेबल का प्रयोग करें। पानी की लगभग 4 एल में लवण भंग। नोट: एचपीएलसी - प्रकार मैं पानी की सिफारिश की है
    2. अंत समाधान 1.6 मिमी कैल्शियम है तो, समाधान के लिए (dihydrate नमक का उपयोग अगर 147 ग्राम / एल) 1 एम 2 CaCl समाधान के 8 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. 5 एल के लिए क्वांटम sufficit पी एस एस समाधान
    4. Recirculating गर्म पानी से स्नान पर बदल कर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए ऊतक स्नान प्रणाली पहले से गरम। महत्वपूर्ण कदम: प्रणाली के प्रत्येक घटक वे एक दूसरे से धारावाहिक में जुड़े हुए हैं, सुनिश्चित करें कि पानी तख्ताबंदीवाला है। प्रवाह की दिशा के लिए महत्वपूर्ण है - उच्चतम कांटेदार कनेक्शन में सबसे कम कांटेदार संबंध में और बाहर प्रत्येक घटक में है कि पानी बहता सुनिश्चित करते हैं।
    5. डाटा अधिग्रहण प्रणाली पर बारी। प्रयोग से पहले बल ट्रांसड्यूसर कम से कम 15 मिनट पर पावर तापमान संतुलित करने के लिए।
      नोट: अधिकांश बल ट्रांसड्यूसर तापमान में बदलाव के प्रति संवेदनशील हैं और शक्ति लागू करने के बाद शुरू में थर्मल बहाव दिखा रहे हैं कि तनाव गेज रोजगार।
    6. लॉन्च डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और डाटा अधिग्रहण प्रणाली के संबंध सुनिश्चित करते हैं। डेटा रिकॉर्डिंग को सक्षम करने के लिए निर्माण निर्देशों का पालन करें।
    7. बल ट्रांसड्यूसर ऊतक ऊतक स्नान में और डेटा रिकॉर्डिंग शुरू कर दिया है पहले रखा जाता है से पहले calibrated हैं सुनिश्चित करें; के लिएअंशांकन के लिए llow निर्माता निर्देश।
    8. एक 95% 2 हे / 5% सीओ 2 चिकित्सा ग्रेड गैस सिलेंडर के लिए ऊतक स्नान सिस्टम को जोड़ने और गैस लीक के लिए जाँच करें और उसके बाद सिस्टम पर दबाव।
    9. पी एस एस के साथ ऊतक स्नान जलाशयों को भरने और समाधान समय अधिकतम तापमान तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं। प्रधानमंत्री सिस्टम और सिस्टम और ट्यूबिंग के भीतर किसी भी हवाई बुलबुले को दूर।
    10. पी एस एस बफर oxygenates और प्रयोग के दौरान ऊतक स्नान में पेश किया जाएगा कि दवाओं वितरित करने के लिए ब्राउनियन गति प्रदान करता है जो लगातार समाधान वातन, यह सुनिश्चित करने के लिए ऊतक स्नान Aerators की जाँच करें। सुनिश्चित करें कि वातन / बुलबुले डेटा रिकॉर्डिंग को बाधित करेगा जो ऊतक आंदोलन का कारण नहीं है; आवश्यक के रूप में गैस के प्रवाह में कमी।
      नोट: ऊतक स्नान और डाटा अधिग्रहण प्रणाली अब प्रयोग शुरू करने के लिए तैयार हैं।

    2. ऊतक तैयारी

    1. आदर्श रूप में, पशु से ऊतकों काटना तुरंत पहले उपयोग करने के लिए और मैं सीधे जगहNto पी एस एस।
      नोट: कुछ ऊतकों रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर पीएसएस में बचाया जा सकता है, लेकिन उचित नियंत्रण लंबे समय तक भंडारण के बाद ऊतक समारोह को मान्य करने के लिए किया जाना चाहिए; धारा 6 में देखते हैं।
    2. इस अभ्यास में ऊतकों के रूप में वक्ष महाधमनी का प्रयोग करें।
    3. संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार चूहे anesthetize और नीचे चूहे पृष्ठीय पक्ष जगह। एक पैर की अंगुली चुटकी और इस दर्दनाक उत्तेजना को पलटा प्रतिक्रिया के नुकसान के माध्यम से anesthetization की पुष्टि करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल एक intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से दिया pentobarbital के 70 मिलीग्राम / किग्रा का उपयोग करता है। कृंतक संज्ञाहरण के लिए संस्थागत दिशा निर्देशों भिन्न हो सकती है।
    4. रिब पिंजरे के तल पर डायाफ्राम के साथ कैंची के साथ एक चीरा बनाने के द्वारा एक वातिलवक्ष बनाएँ। फिर, उरोस्थि को ribcage के नीचे से चीरा जारी है और दोटूक करना।
    5. दूर काटना या स्पाइनल कॉलम के शीर्ष पर हैं कि उन अंगों को अलग जगह और स्पाइनल कॉलम के साथ सीधे निहित है जो महाधमनी, की स्थिति जानें।
      नोट: यह हैTEP महाधमनी बाहर काटना के लिए एक स्पष्ट काम अंतरिक्ष प्रदान करता है।
    6. महाधमनी के लिए सभी कनेक्शनों तोड़; और घेघा, फेफड़े, आदि से डायाफ्राम के स्तर पर रीढ़ की हड्डी को सीधा महाधमनी काटा।
    7. धीरे संदंश के साथ महाधमनी पकड़ और रीढ़ की हड्डी से महाधमनी काटना कैंची का उपयोग करें। दिल की दिशा में रीढ़ की हड्डी और काम करने के लिए आसन्न कम डायाफ्राम क्षेत्र में विच्छेदन शुरू करो। ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकता है, जो महाधमनी ऊतक, पर अतिरिक्त खींच नहीं करने के लिए एहतियात या टग लेने के लिए सुनिश्चित करें।
    8. इसके तत्काल बाद पीएसएस युक्त तैयार विच्छेदन डिश में महाधमनी जगह है।
      नोट: छल्ले में महाधमनी के विच्छेदन सबसे अच्छा एक काले रंग की Silastic नींव है कि एक विदारक पकवान में किया जाता है। इस विच्छेदन डिश में जबकि स्थिरता प्रदान करने, महाधमनी cannulate करने और डिश को बांधा जा इस्तेमाल किया जा सकता है कि तारों के उपयोग के लिए अनुमति देता है। काले रंग की पृष्ठभूमि विच्छेदन कि एड्स विपरीत प्रदान करता है। केयर endothel रूप cannulating तारों के उपयोग में लिया जाना चाहिएial सेल परत पोत के लुमेन के खिलाफ तार से अधिक रगड़ से हटाया जा सकता है।
    9. एक तार ले लो और एक छोर पर एक छोटे से 90 डिग्री कोण बनाने के लिए और गाइड तार लंगर Silastic नींव में कोणीय अंत धक्का। विच्छेदन डिश में पूरे महाधमनी रखें।
    10. संदंश के साथ गाइड तार के अंत पकड़ो, और फिर धीरे से महाधमनी के लुमेन में तार धागा।
    11. संदंश का प्रयोग करें और तार पर महाधमनी स्लाइड। गाइड तार के मुक्त अंत दिखाई नहीं देती, वक्र धीरे तार है और ऊतकों को स्थिर करने के लिए पकवान की Silastic नींव में मुक्त अंत जगह है।
    12. वक्ष महाधमनी सफेद और कुछ हद तक रेशेदार प्रकट होता है जब तक छोटे Vannas कैंची और संदंश का प्रयोग, आदि परिवाहकीय वसा ऊतकों और अन्य सभी बाहरी ऊतक, रक्त के थक्के, हटा दें।
    13. तार से साफ महाधमनी निकालें और चौड़ाई में लगभग 3-5 मिमी हैं कि छल्ले में महाधमनी कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करें।
    14. तिवारी की एक जोड़ी में से एक पर एक महाधमनी अंगूठी रखेंहुक पकड़े और धीरे हुक पर अंगूठी स्लाइड करने के लिए संदंश का उपयोग करके ssue हुक। दूसरा हुक के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं। उलझन नहीं है हुक सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखना; चित्रा 3 देखें।
    15. प्रत्येक हुक जुड़ी एक अलग रेशम सीवन है कि जाँच करें। दूसरी ओर बंधे बल transducer के लिए किया जाएगा कि एक 04/10 सेमी लंबा टुकड़ा सीवन है, जबकि एक हुक, एक गिलास या स्टेनलेस स्टील रॉड से लगाव के लिए अनुमति देता है कि रेशम का एक छोटा सा knotted लूप है कि जाँच करें; चित्रा 3 देखें।
      नोट: महाधमनी हुक करने के लिए सुरक्षित है, एक बार ऊतक ऊतक स्नान में रखा जा करने के लिए तैयार है; चित्रा 3 देखें।
    16. दोहराएँ दूसरे ऊतक स्नान कक्ष में एक दूसरे महाधमनी अंगूठी माउंट करने के लिए, 2.14-2.15 कदम।

    स्नान में 3. ऊतक प्लेसमेंट

    1. इस प्रणाली में, ऊतक स्नान खुद को स्थिर कर रहे हैं कि ध्यान दें। इस समय, temperatur में आने के लिए समाधान गरम, वातित पी एस एस के साथ ऊतक स्नान को भरने की अनुमतिई।
    2. रेशम सीवन के साथ, स्टेनलेस स्टील रॉड पर खूंटी के लिए ऊतक तैयार करने पर हुक के एक टाई। ऊतक स्नान के चेंबर में यह अंत रखें। एक अंगूठी खड़ा करने के लिए रॉड कनेक्ट और बफर में डूबे ऊतक रखने के लिए पी एस एस के साथ भरा धुंधला डिश में दूसरे छोर जगह; चित्रा 3 देखें।
      1. ऊतक स्नान कक्ष में छड़ी और ऊतक प्लेस और ऊतक पूरी तरह से पीएसएस में डूब जाता है और रॉड सुरक्षित है सुनिश्चित करें; चित्रा 3 देखें।
      2. बल ट्रांसड्यूसर करने के लिए अन्य सीवन टाई और ऊतक और बल transducer के बीच सीवन में सुस्त छोड़ने के लिए सुनिश्चित करें।
        नोट: यह सुस्त माइक्रोमीटर का समायोजन करके हटा दिया जाएगा; चित्रा 3 देखें।
    3. दूसरा महाधमनी की अंगूठी और ऊतक स्नान कक्ष के लिए इन चरणों को दोहराएँ।

    4. निष्क्रिय तनाव की स्थापना

    नोट: प्रत्येक ऊतक चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं OPTIMA जवाब है, जिस पर एक लंबाई (लो) हैlly। प्रारंभिक प्रयोगों प्रत्येक व्यक्ति के ऊतक प्रकार के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए इस लंबाई की जांच की जा करने के लिए प्राप्त होता है, जो इष्टतम खींच तनाव निर्धारित करने के लिए। चूहे वक्ष महाधमनी 4 जी की एक इष्टतम निष्क्रिय खींच तनाव है।

    1. 2 जी के लिए तनाव बढ़ाने के लिए और पठार तक पहुँचने के लिए ऊतक के लिए प्रतीक्षा करने के लिए माइक्रोमीटर / रैक और पंख काटना का प्रयोग करें। पठार तक पहुँच जाता है एक बार, तनाव एक और 2 जी बढ़ाने के लिए और पठार के लिए ऊतक के लिए प्रतीक्षा करें।
      नोट: 2 जी की प्रारंभिक तनाव सेट और पठार तक पहुँच गया है के बाद महाधमनी के छल्ले में, ऊतक तो ~ 1.6 जी को आराम करना चाहिए। 2 जी की एक दूसरा आवेदन ~ करने के लिए ऊतक फिर आराम करेंगे और तनाव में कमी होगी, जिसमें से 3.6 ग्राम, ऊतक लाना होगा। इस प्रकार, कुल तनाव की 4 जी जोड़ा होने के बाद, सॉफ्टवेयर तनाव का लगभग 3.2 जी संकेत चाहिए।
    2. दूसरा महाधमनी की अंगूठी और ऊतक स्नान कक्ष के लिए इन चरणों को दोहराएँ।

    5. संतुलन एवं औषधि बनाना

    1. के लिए ऊतक संतुलित करनाऊतकों को निष्क्रिय तनाव लगाने के बाद 60 मिनट।
    2. संतुलन चरण के दौरान, ऊतक हर 15-20 मिनट धो लें। ऊतकों स्नान नाली और एक गरम जलाशय से पी एस एस के साथ पीएसएस की जगह।
      नोट: इस समय के दौरान, ऊतक निष्क्रिय तनाव के नुकसान ने संकेत दिया है, जो आराम करेंगे।
    3. इस समय के दौरान, तो दवा के स्टॉक का केवल एक छोटी मात्रा में वांछित एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, स्नान में वास्तविक एकाग्रता से कम से कम 1,000 गुना अधिक ध्यान केंद्रित करने की आवश्यकता है जो प्रयोग के लिए दवाओं, तैयार करते हैं।

    6. प्रारंभिक चैलेंज

    1. संतुलन अवधि के अंत में, ऊतक एक अंतिम समय धोने के डेटा को बचाने के लिए, और सभी आदानों-शून्य कर रहे हैं।
    2. ऊतक प्रतिक्रिया करता है जो करने के लिए (सक्रिय संकुचन का कारण होगा कि मिश्रित) एक agonist उठाओ।
      नोट: चूहे वक्ष महाधमनी में, धमनी चिकनी मांसपेशियों को सक्रिय रूप से की वजह से तंत्रिका वितरण करने के लिए एक अल्फा एड्रीनर्जिक रिसेप्टर agonist के लिए अनुबंध होगासहानुभूति तंत्रिका तंत्र द्वारा ऊतक। एक एड्रीनर्जिक एगोनिस्ट एड्रीनर्जिक एगोनिस्ट छूट के कारण यह देखते हुए कि आंतों के ऊतकों में उपयोगी नहीं होगा। इस मामले में इस तरह के एसीटाइलकोलीन (कोलीनर्जिक रिसेप्टर) के रूप में एक रिसेप्टर agonist इस्तेमाल किया जा सकता है। Phenylephrine और acetylcholine दोनों के लिए एक वैकल्पिक ऐसी पहली चुनौती के रूप में उच्च पोटेशियम (कश्मीर) के रूप में एक गैर रिसेप्टर agonist उपयोग करने के लिए है। चिकनी मांसपेशियों में, उच्च कश्मीर परोक्ष रूप से खुला कैल्शियम चैनल में चल रही है और इस तरह चिकनी पेशी अखंडता की एक सामान्य सूचकांक के रूप में देखा जाता है।
      1. ऊतक स्नान करने के लिए 10 -5 एम phenylephrine जोड़कर पहली चुनौती या जगा चुनौती को पूरा करें। 50 मिलीलीटर ऊतक स्नान में इस एकाग्रता को प्राप्त एक 10 -2 एम phenylephrine समाधान के 50 μl जोड़ें।
        नोट: पी एस एस के 50 मिलीलीटर में 50 μl अंतिम एकाग्रता स्टॉक की तुलना में 1,000x कम है तो, एक 1/1000 कमजोर पड़ने है, या 10 -5 एम ऊतक स्नान सी भीतर मात्रा और मात्रा के अनुरूप रखरखाव का ज्ञानhamber अंतिम दवा एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    3. डेटा की ढलान शून्य हो जाता है, ऊतक स्नान करने के लिए 10 -5 एम phenylephrine जोड़ें और शिखर और फिर पठार के संकुचन की अनुमति देते हैं। बाद के प्रयोगात्मक विश्लेषण सहायता करने के लिए प्रत्येक प्रयोगात्मक घटना को दर्ज करने के लिए सुनिश्चित करें।
    4. पठार के बाद, खाली करने के लिए और नए पी एस एस के साथ ऊतक स्नान कक्ष refilling द्वारा अच्छी तरह से एगोनिस्ट बाहर धो लो। के रूप में अच्छी तरह से इन घटनाओं को दर्ज करने के लिए सुनिश्चित करें।
      नोट: अंगूठे का एक नियम के स्नान में एगोनिस्ट की एकाग्रता प्रत्येक धोने के साथ 10 गुना कम हो जाता है। अधिक से अधिक 3-4 washes के लिए आवश्यक हो सकता है वापस नीचे अपने संतुलन आधारभूत टोन (तनाव) के लिए ऊतक लाने के लिए।
    5. आगे बढ़ने से पहले ~ 10 मिनट के लिए आधारभूत स्वर में ऊतक आराम करने दो।

    7. प्रयोग

    नोट: Prazosin, एक अल्फा एड्रीनर्जिक रिसेप्टर प्रतिपक्षी, एकाग्रता resp शिफ्ट करने के लिए ऊतक स्नान चैम्बर के लिए पेश किया जाएगाonse वक्र phenylephrine (पीई) के लिए; यह एक स्पष्ट विरोध है।

    1. एक स्नान करने के लिए, वाहन जोड़ (एच 2 ओ) में जो prazosin भंग कर दिया गया। किसी अन्य के लिए, prazosin की उचित एकाग्रता जोड़ें। इस उदाहरण में, एक 5 x 10 -9 एम या स्नान में एक 5 एनएम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए एक दूसरे के स्नान करने के लिए वाहन का 25 μl और prazosin के 10 -5 एम एकाग्रता के 25 μl जोड़ें।
      नोट: वाहन के अलावा इस उदाहरण में अनावश्यक लगता है जबकि vasoactive होने के लिए एक संभावित (जैसे, DMSO के, इथेनॉल, एसीटेट) है कि अन्य वाहनों का उपयोग कर रहा है, जब वह ऐसा करने के लिए आवश्यक है। यह vasoactive होने के लिए कुछ सबूत मौजूद है, भले ही इसी वाहन जोड़ें।
    2. स्नान में वाहन / prazosin छोड़ दो और 1 घंटे के लिए ऊतक धोने नहीं है।
      1. ऊतकों equilibrating कर रहे हैं, एगोनिस्ट (पीई) के कई सांद्रता तैयार करते हैं। जैसे, <कोई प्रतिक्रिया जानने सांद्रता (से सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला को शामिल करें/ अधिक से अधिक प्रतिक्रिया (पार कि सांद्रता के लिए उन्हें> 10 -9 एम पीई) जैसे, 10 -4 एम पीई)। एकाग्रता-प्रतिक्रिया घटता 10 -1 एम शेयर समाधान से पीई के छह अलग स्टॉक समाधान (10 -6 -10 -1 एम) धारावाहिक dilutions के माध्यम से कर सकते हैं, प्रकृति में लघुगणक रहे हैं। प्रत्येक एकाग्रता के लिए आवश्यक मात्रा सभी स्नान (यानी> 300 μl) के लिए आवश्यक ट्रिपल कुल मात्रा की तुलना में थोड़ा बड़ा है सुनिश्चित करें।
    3. तालिका 1 में वर्णित के रूप में, एगोनिस्ट जोड़ने के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: इस प्रयोग पीई के लिए एक संचयी एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न होगा; प्रत्येक चलना खाते में पहले से ही स्नान के लिए कहा पदार्थ की राशि लेता है। वे अब संकुचन में वृद्धि जब तक परिवर्धन पाए जाते हैं, या पूरे वक्र plateaued है।
      1. ऊतक दहलीज तक पहुँच जाता है जब तक व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक दवा एकाग्रता जोड़ें।
      2. कोई परिवर्तन नहीं होता है, में अगले एकाग्रता जोड़नेश्रृंखला; तालिका 2 देखें।
        नोट: ये परिवर्धन के समय इस्तेमाल किया एगोनिस्ट पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, norepinephrine और phenylephrine संकुचन तेजी से विकसित होता है, और मिनट के भीतर पठार चाहिए। इसके विपरीत, endothelin-एक संकुचन धीरे-धीरे विकसित और बंद करने के लिए 45 मिनट के लिए पठार नहीं हो सकता है। अन्य प्रयोग के रूप में लंबे समय तक, इस तरह के रूप में एक वक्र के निर्माण के बाद ऊतक पर किया जा सकता है के रूप में (1) पदार्थ washes के बाहर; और (2) यह ऊतक सामान्य सिकुड़ा व्यवहार करने के लिए देता है और पिछले stimulations से प्रभावित नहीं है कि प्रदर्शन किया जा सकता है।

    8. डेटा विश्लेषण

    1. पहले और एक हस्तक्षेप के तुरंत बाद डेटा को बचाने के लिए सुनिश्चित करें (उदाहरण के लिए, जगा या पूर्ण वक्र)।
    2. ढूँढें और डेटा विश्लेषण में सहायता करेगा जो प्रत्येक ऊतक स्नान कक्ष / इनपुट चैनल के लिए ऊतक आधारभूत निर्धारित किया है।
    3. आधारभूत सेट हो जाने के बाद, प्रत्येक एकाग्रता के लिए अधिक से अधिक प्रतिक्रिया मिल जाए, और चान को रिकॉर्डआधारभूत से जीई। क्रमिक रूप से सांद्रता में से प्रत्येक के माध्यम से कदम और आधारभूत परिवर्तन रिकॉर्ड है।
    4. जिसके परिणामस्वरूप डेटा ग्राफ। किसी भी रेखांकन कार्यक्रम में यह मत करो।
      नोट: ग्राफ़ पैड चश्मे pharmacologists के लिए तैयार है, और इस यहाँ प्रस्तुत प्रयोग के प्रकार के लिए आदर्श है।

Representative Results

Agonism के संदर्भ में, एक दिया ऊतक में एक agonist के रिश्तेदार प्रभावकारिता (ई मैक्स) और शक्ति (ईसी 50) की गणना की जाती है और एक ही ऊतक 1 में अन्य एगोनिस्ट की प्रतिक्रियाओं की तुलना में किया जा सकता है। हमारे प्रयोग में चूहे वक्ष महाधमनी वाहन या पूर्व (चित्रा 1) ऊतक स्नान करने के लिए α 1 एड्रीनर्जिक एगोनिस्ट phenylephrine जोड़ने और संकुचन पैदा करने के लिए एक घंटे के लिए α 1 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर प्रतिपक्षी prazosin (5 एनएम) के साथ या तो incubated किया गया था।

चित्रा 2 प्रस्तुत चित्रा 1 के परिणामों को संशोधित। हरी प्रतिक्रियाओं पीई द्वारा हासिल की अधिकतम संकुचन प्रतिक्रिया है कि कारण है कि मैक्स, साढ़े अधिकतम संकुचन जैसे चिह्नित और फिर पीई एकाग्रता के साथ संबद्ध के रूप में चिह्नित चिह्नित किया है। इन मूल्यों की पहचान करना एक आधा अधिकतम (50%) प्रतिक्रिया या चुनाव आयोग को प्राप्त होता है कि एक agonist के प्रभावी एकाग्रता की पहचान है 50 मूल्यों की वक्र ढाले और गणना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का उपयोग करता है कि इस example.Computer सॉफ्टवेयर में donegraphically था।

सृजन और इन परिणामों की व्याख्या में, यह एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र बनाने के लिए एगोनिस्ट के दोनों कम और उच्च सांद्रता का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। पर्याप्त अंक एक स्थिर आधारभूत और अधिकतम पठार को दिखाने के लिए बिना, चुनाव आयोग 50 और ई मैक्स ही अनुमान लगाया जा सकता है। यह इस उदाहरण में रेखांकन किया गया था। Sigmoidal घटता के लिए रसद कार्यों का उपयोग करता है कि कम्प्यूटर सॉफ्टवेयर चुनाव आयोग 50 मूल्यों की वक्र ढाले और गणना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

चित्रा 1
चित्रा 1:। ऊतक स्नान योजनाबद्ध कार्टून दोहरी दीवार में रखा गया ऊतक के एक अंगूठी का प्रतिनिधित्व करने, पानी तख्ताबंदीवाला ऊतक बावें। बफर प्रवाह और बहिर्वाह चैंबर के आधार में एकीकृत एक 3-तरह गिलास पानी निकलने की टोंटी द्वारा विनियमित रहे हैं। 2 हे / सीओ 2 पी एस एस या गैस के रिसाव को रोकने के लिए एक गैसकेट के साथ बंद है कि एक जलवाहक के माध्यम से bubbled है। रिसर्कुलेशन इनपुट उचित पुनःपरिसंचरण को बनाए रखने और तापमान disregulation का कारण होता है कि हवा जेब के गठन को रोकने के लिए उत्पादन के नीचे है।

चित्रा 2
चित्रा 2:। चूहा छाती रोगों महाधमनी + अन्तःस्तर आंकड़ा ऊपर के चार अलग-अलग प्रयोगों (विभिन्न जानवरों और विभिन्न रंगों द्वारा प्रतिनिधित्व के रूप में अलग सेट अप पर विभिन्न जांचकर्ताओं द्वारा किया जाता है) एक पीई प्रेरित संकुचन शिफ्ट करने के लिए prazosin की क्षमता का परीक्षण करने के लिए दर्शाया गया है। Prazosin (5 एनएम) स्पष्ट रूप से एक समानांतर फैशन में पीई प्रेरित संकुचन वक्र दाहिनी ओर स्थानांतरित कर दिया।


चित्रा 3: चूहा छाती रोगों महाधमनी + अन्तःस्तर ग्राफिकल अनुपस्थिति (वाहन) में पीई के लिए चुनाव आयोग 50 मूल्यों के आकलन और प्रतिपक्षी की उपस्थिति (prazosin)।। ग्रीन लाइन (समूह सी) केवल चिह्नित है।

नमक मेगावॉट (छ / तिल) 5 लीटर अंतिम मिमी
(ग्राम)
NaCl 58.45 37.99 130
KCl 74.56 1.75 4.7
KH2PO4 136.1 0.8 1.18
MgSO4• 7H20 246.5 1.45 1.17
NaHCO3 84.21 6.25 14.9
डेक्सट्रोज 180.16 5 5.5
EDTA 380 0.05 0.03

तालिका 1: सामान्य शारीरिक नमक समाधान (पीएसएस) पकाने की विधि इस प्रयोग में इस्तेमाल किया बाइकार्बोनेट बफर पीएसएस की सामग्री।। सभी लवण की आणविक वजन और वांछित एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए DH 2 ओ के 5 एल में जोड़ा राशि शामिल हैं।

स्नान में एकाग्रता एगोनिस्ट के अलावा स्नान करने के लिए बनाया
1 एक्स 10 -9 एम 50 मिलीलीटर 1 एक्स 10 -6 एम
3 एक्स 10 -9 एम 100 मिलीलीटर 1 एक्स 10-6 एम
1 एक्स 10 -8 एम 35 मिलीलीटर 1 एक्स 10 -5 एम
3 एक्स 10 -8 एम 100 मिलीलीटर 1 एक्स 10 -5
1 एक्स 10 -7 एम 35 मिलीलीटर 1 एक्स 10 -4 एम
3 एक्स 10 -7 एम 100 मिलीलीटर 1 एक्स 10 -4 एम
1 एक्स 10 -6 एम 35 मिलीलीटर 1 एक्स 10 -3 एम
3 एक्स 10 -6 एम 100 मिलीलीटर 1 एक्स 10 -3 एम
1 एक्स 10 -5 एम 35 मिलीलीटर 1 एक्स 10 -2 एम
3 एक्स 10 -5 एम 100 मिलीलीटर 1 एक्स 10 -2 एम
1 एक्स 10 -4 एम 35 मिलीलीटर 1 एक्स 10 -1 एम

तालिका 2:। ऊतक स्नान संयोजी Agonist सांद्रता एगोनिस्ट की राशि समर्थक के लिए प्रत्येक स्नान करने के लिए जोड़ा जा करने के लिएperly संचयी एकाग्रता-प्रतिक्रिया घटता का निर्माण। वांछित स्नान एकाग्रता एगोनिस्ट की सांद्रता बढ़ाने की अनुक्रमिक मात्रा के अलावा के माध्यम से हासिल की है। इसके अतिरिक्त प्रत्येक खाते में स्नान में पहले से ही मौजूद एगोनिस्ट की एकाग्रता लेता है। इस एगोनिस्ट की एक भी एकाग्रता बढ़ती मात्रा का उपयोग करने से नतीजा होगा कि ऊतक स्नान में मात्रा में वृद्धि को कम से कम करने के लिए किया जाता है।

Discussion

एक अनुसंधान उपकरण के रूप में Isometric बल के मापन 150 साल पुराना है, लेकिन यह सिकुड़ा ऊतकों 2 में रिसेप्टर लक्षण वर्णन के लिए आद्य तकनीक होना जारी है। इस तकनीक की शक्ति को अपनी सादगी और बहुमुखी प्रतिभा में है: एक विरोधी की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एक agonist की सांद्रता में वृद्धि से हासिल की प्रतिक्रियाएं रिकॉर्डिंग से, जानकारी के असंख्य करने के लिए प्रत्येक दवा के औषधीय विशेषताओं और रिसेप्टर के बारे में प्राप्त किया जा सकता है, जो यह 3-5 बांधता है। इस प्रकार के प्रयोगों का भी इस्तेमाल किया विरोधी के गैर-प्रतिस्पर्धात्मक प्रकृति बनाम प्रतियोगी के बारे में जानकारी है, साथ ही रिसेप्टर विविधता और गैर विशिष्ट दवा प्रभाव 6-8 जुटाने। इस प्रकार, इस पृथक ऊतक स्नान प्रयोग करने के लिए सरल क्रमपरिवर्तन के साथ, एगोनिस्ट प्रेरित मांसपेशियों में संकुचन कि मध्यस्थता रिसेप्टर्स की एक अपेक्षाकृत पूरा औषधीय प्रोफाइल उत्पन्न किया जा सकता है।

Agonism के संदर्भ में, वेंएक दिया ऊतक में एक agonist के ई रिश्तेदार प्रभावकारिता (ई मैक्स) और शक्ति (ईसी 50) एक ही ऊतक 1 में अन्य एगोनिस्ट की प्रतिक्रियाओं की तुलना में गणना की जा सकती है। हमारे प्रयोग में चूहे वक्ष महाधमनी वाहन या पूर्व संकुचन ऊतक स्नान करने के लिए α 1 एड्रीनर्जिक एगोनिस्ट phenylephrine जोड़ने और पैदा करने के लिए एक घंटे के लिए α 1 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर प्रतिपक्षी prazosin (5 एनएम) के साथ या तो incubated किया गया था। संशोधित परिणाम 2 प्रस्तुत चित्रा हरे रंग की प्रतिक्रियाएं मैक्स के रूप में चिह्नित पीई द्वारा हासिल की अधिकतम संकुचन के साथ चिह्नित किया गया है चित्रा 1 की।, साढ़े अधिकतम संकुचन जैसे चिह्नित और फिर प्रतिक्रिया है कि कारण है कि पीई एकाग्रता के साथ जुड़े। इन मूल्यों की पहचान करना एक आधा अधिकतम (50%) प्रतिक्रिया या चुनाव आयोग 50 मूल्य प्राप्त होता है कि एक agonist के प्रभावी एकाग्रता की पहचान है।

दुर्भाग्य से, एगोनिस्ट निर्भर पैरामीटर का उपयोगरिसेप्टर बाध्यकारी विशेषताओं 9 जटिल हो सकता है निर्धारित करने के लिए अकेला है। लगातार प्रतिपक्षी हदबंदी (पी बी) के -log 10 और दाढ़ प्रतिपक्षी के -log 10: आदर्श रूप में, रिसेप्टर विरोधी का उपयोग करते हुए अतिरिक्त प्रयोगों एक दवा और एक रिसेप्टर के बीच बातचीत को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि दो महत्वपूर्ण मापदंडों की गणना के लिए अनुमति देते हैं आवश्यक एकाग्रता एकाग्रता-प्रतिक्रिया की अवस्था में दो गुना दाहिनी ओर शिफ्ट (PA 2) 10 बटोर लिए। कश्मीर बी और देहात दो लाभ वे एगोनिस्ट स्वतंत्र मान रहे हैं, और यहां तक कि विभिन्न ऊतकों 11 के बीच लगातार बने हुए हैं कि इस तथ्य से उनकी उपयोगिता दोनों। कहीं और गणना 50 मूल्यों चित्रा 2 में डेटा से, पी बी निम्न समीकरण का उपयोग कर की गणना की जा सकती है और चुनाव आयोग के आधार पर:

= 2 एक्स 10 -8 एम prazosin के अभाव में चुनाव आयोग 50
पूर्व में चुनाव आयोग 50prazosin की भावना = 7 एक्स 10 -6 एम

निम्न समीकरण में कश्मीर बी के लिए हल:
लॉग इन करें (डॉ -1) = [बी] लॉग इन - कश्मीर बी लॉग इन करें
जहाँ:
[बी] प्रतिपक्षी एकाग्रता =, या 5 एक्स 10 -9 एम लॉग इन करें (5 एक्स 10 -9 एम) = -8.3
डॉ = अनुपस्थिति में प्रतिपक्षी / चुनाव आयोग 50 की उपस्थिति में चुनाव आयोग 50 मूल्य की खुराक अनुपात। एक दाहिनी ओर बदलाव है, तो यह मान एक से अधिक हो जाएगा। इस प्रकार:
डॉ = 7 एक्स 10 -6 एम / 2 एक्स 10 -8 एम या 700 एक्स 10 -8 एम / 2 एक्स 10 -8 एम = 700/2 = 350
[बी] और डॉ के लिए प्रतिस्थापन:
कश्मीर बी लॉग इन करें - = -8 (350-1) लॉग इन करें
2.54 = -8 - केबी लॉग इन करें
पी बी = 10.54

Prazosin एक α 1 एड्रीनर्जिक recept के साथ सूचना का आदान प्रदान जब prazosin के लिए यह मान प्राप्त मूल्यों के अनुरूप हैphenylephrine को संकुचन मध्यस्थता एड्रीनर्जिक रिसेप्टर α 1 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर सुझाव है कि या 12,13,।

कई कदम इन प्रयोगों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं। ऊतकों ऊतक व्यवहार्यता के नुकसान को रोकने के लिए विच्छेदन के बाद पीएसएस में ही रहना चाहिए। किसी भी Isometric पेशी तैयारी निष्क्रिय तनाव 14,15 के खिलाफ अधिक से अधिक बल उत्पन्न करता है कि एक इष्टतम लंबाई-तनाव संबंध नहीं है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोग के लिए, इष्टतम निष्क्रिय तनाव पहले से ऊतकों को निष्क्रिय तनाव की 0.5 ग्राम का संक्षेप में जोड़ने के वेतन वृद्धि द्वारा निर्धारित किया गया था। ऊतक स्वर के बिना शुरू करना चाहिए और उसके बाद संतुलन के 30 मिनट के बाद, ऊतक सक्रिय स्वर उत्पन्न जो KCl (80 मिमी) की एक अधिकतम एकाग्रता के साथ चुनौती दी गई थी। फिर, ऊतक धोया और आधारभूत टोन करने के लिए वापस जाने के लिए अनुमति दी गई थी। आधारभूत पर 15 मिनट के बाद, निष्क्रिय तनाव का एक और 0.5 ग्राम रखा गया था और इस प्रक्रिया का एक पठार तक दोहरायासक्रिय तनाव अतिरिक्त निष्क्रिय तनाव के साथ हासिल की थी। प्रारंभिक प्रयोगों में, निष्क्रिय तनाव की 4 जी कुल महाधमनी के छल्ले में अधिक से अधिक सक्रिय तनाव पीढ़ी को प्राप्त करने के लिए निर्धारित किया गया था, और इस तरह के तनाव के इस कुल राशि पूर्व संतुलन करने के छल्ले पर रख दिया गया है। Procedurally, यह पूर्व निष्क्रिय तनाव आवेदन शून्य करने के लिए सबसे अच्छा है, लेकिन प्रयोग से पहले किसी भी समय किया जा सकता है। प्रयोग या विच्छेदन में किसी भी बिंदु पर, ऊतकों खींच ओवर-, नकारात्मक ऊतक व्यवहार्यता और प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित करेगा। इस कदम के अत्यधिक खिंचाव के उच्चतम संभावना है, के रूप में स्नान में ऊतकों रखकर जब यह सबसे जरूरी है। संख्या और अवधि में पर्याप्त धोने, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रभाव के लिए आवश्यक है। एक दूसरी चुनौती भी जल्द ही ऊतकों आधारभूत तनाव में लौट आए हैं एक प्रारंभिक चुनौती के बाद, या उससे पहले, न्यायपालिका प्रतिक्रियाओं में परिणाम होगा। प्रतिवर्ती गरम / अवरोधकों का अध्ययन करते हैं, तो ऊतकों inhibi के रूप में, इसके अलावा agonist करने से पहले धोया नहीं किया जाना चाहिएटो एकाग्रता कम हो जाएगा।

पृथक ऊतक स्नान assays के लिए उल्लेखनीय फायदे और नुकसान कर रहे हैं।

नुकसान: टिश्यूज हुक पर छल्ले के सर्जिकल हटाने या नियुक्ति के दौरान नुकसान के विभिन्न डिग्री अनुभव हो सकता है। Endothelial सेल महाधमनी अंगूठी की अंदरूनी परत के बाद से इस सेल परत को नुकसान नहीं इतनी के रूप में, देखभाल के हुक पर अंगूठी की नियुक्ति पर लिया जाना चाहिए। ऊतकों भी वे ऊतक स्नान में सक्षम हैं, जिसमें समय के अलग अलग लंबाई हो सकता है, और यह निर्धारित किया है; नहीं सभी ऊतकों में ही हैं। इन पंक्तियों के साथ, ऊतकों समय नियंत्रण हर प्रयोग के लिए एक आवश्यक नियंत्रण बन ऐसी है कि दिन भर में उनकी जवाबदेही में बदल सकता है। इस का एक अच्छा उदाहरण एक ठेठ 8 घंटा प्रयोग के दौरान 100% से सिकुड़ना अधिकतम में सुधार गिनी पिग श्वासनली है। पानी में खराब घुलनशील हैं कि ड्रग्स पीएसएस में बाहर वेग सकता है। अंत में, संचयी एकएन डी एगोनिस्ट को रिसेप्टर desensitization उत्पन्न होती है तो एक agonist विभिन्न परिणामों में परिणाम सकता है कि एक दवा की गैर-संचयी परिवर्धन; एंजियोटेनसिन द्वितीय तेजी tachyphylaxis से पता चलता है जो एक ऐसी दवा है।

लाभ: ऊतक स्नान प्रयोगों का प्राथमिक लाभ में से एक यह वास्तविक समय है कि है; यह करेंगी और तेजी से निष्कर्ष बनाने के लिए और एक प्रयोग के दौरान अगले कदम है, साथ ही निवारण योजना बना सकते हैं के रूप में एक प्रयोग देख सकते हैं। एक प्रयोग करने के लिए एक दिन लेता है। कई ऊतकों को आम तौर पर एक जानवर अपने स्वयं के नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं कि इस तरह के एक जानवर से तैयार किया जा सकता है, और है कि एक प्रयोग करने के लिए शक्ति कहते हैं। दवा के लिए ऊतक का एक अपेक्षाकृत शुद्ध प्रतिक्रिया परीक्षण करने के लिए इतनी के रूप में एक भी अन्य कारकों से ऊतक अलग कर सकते हैं। इस तरह के ऊतक स्नान प्रणाली के रूप में इन विट्रो प्रयोगों में भी एक vivo में प्रयोग की तुलना में दवा की एक छोटी राशि के उपयोग की अनुमति देते हैं।

इस के साथ साथ वर्णित बुनियादी प्रयोगात्मक डिजाइन किया जा सकता हैबड़े पैमाने पर अतिरिक्त पैरामीटर की रिकॉर्डिंग या अन्य बाहरी उत्तेजनाओं की शुरूआत के लिए अनुमति देने के लिए संशोधित। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोड के अलावा innervating नसों 16,17 के बिजली के क्षेत्र उत्तेजना के लिए अनुमति देते हैं। थर्मल या पीएच जांच के अलावा के साथ, सिकुड़ा प्रतिक्रियाओं पर तापमान और पीएच का प्रभाव भी 18,19 मापा जा सकता है। इसी तरह, ऑक्सीजन आंशिक रूप से या हाइपोक्सिया प्रेरित प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए 2 एन के साथ पूरा में प्रतिस्थापित किया जा सकता है। इसके अलावा, इस वीडियो में इस्तेमाल किया Isometric सिकुड़ना माप का एक ही मूल सिद्धांतों intracellular कैल्शियम 20 में Isometric तनाव विकास और परिवर्तन के सहवर्ती माप की अनुमति प्रणालियों को विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सिस्टम है कि तेजी से एक प्रतिक्रिया के दौरान एक ऊतक के नमूने जमा कर सकते मौजूद बाद से संकेत पारगमन भी आसानी से अध्ययन किया है, एक संकेत पारगमन मार्ग प्रणाली की गतिविधि को biochemically सत्यापित किया जा सकता है कि इस तरह।

क्षेत्रों में काम की भिन्नताऐसा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ipment के भारी है। इस पूरी प्रणाली, निर्माण या स्वचालित या तो हाथ, कई अलग अलग कंपनियों से खरीदा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया ऊतक स्नान और ऊतक धारकों एक घर में मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी मशीन की दुकानें द्वारा हाथ से उड़ा (ऊतक स्नान) और हाथ का निर्माण (धारकों) थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LabChart Software ADInstruments 7.2
PowerLab (4 channel)  ADInstruments ML760
QuadBridge (4 channel) ADInstruments ML112 ML112
Grass Adapter Cable ADInstruments MLAC11 MLAC11
Grass Force-displacement Transducer Grass Instrument Co FT03 FT03
Grass Transducer Cable Grass Instrument Co TAC-7 REV-1
BNC to BNC Cable ADInstruments MLAC01
IsoTemp 2100 Fisher Scientific IC-2100
Tissue Bath Multiple Sources 
Physiological Salt Solution PSS
Braided Silk Suture Harvard Apparatus 51-7615 SP104
Ring Stand Humboldt MFG Co H-2122 7
Dissecting Dishes Handmade with Silicone
Tygon Tubing VWR Scientific 63010-100 R-3603
Hose Clamps Cole-Parmer Instrument Co 06832-08 SNP-8
50 ml Muscle Bath Eberhartglass Blowing Custom
250 ml Warming Chambers Eberhartglass Blowing Custom
Gas Dispersion Tube Ace Glass 7202-06 7202-02
Micrometer
Custom Stands
Three-prong Clamps VWR International Talon
S-connector VWR International Talon
Tissue Hooks Hand Made in House Custom
Tissue Dissection
Leica Stereomicroscope MZ6 Leica 10447254
Stereomaster Microscope Fiber-optic Light Source Fisher Scientific 12562-36 12562-36
Culture Petri Dish Pyrex 7740 Glass
Sylgard Silicone Elastomer Dow Corning Sylgard 170 Kit
Vannas Scissors George Tiemann & Co 160-150 160-150
Splinter & Fixation Forceps George Tiemann & Co 160-55 160-55

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References

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