化学遗传相互作用的快速鉴定

Biology

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Dilworth, D., Nelson, C. J. Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (98), e52345, doi:10.3791/52345 (2015).

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Abstract

确定生物活性的化学物质的作用方式是感兴趣的范围广泛的学术,医药,和工业的科学家。 酿酒酵母,或出芽酵母,是一个模型真核生物的量的〜6000基因缺失突变体和亚效等位基因必需基因的完整集合突变体是市售的。突变体的这些集合可以被用来系统地检测化学基因的相互作用,必要基因容忍的化学物质。这个信息,反过来,报告了化合物的作用可能模式。在这里,我们描述了一个协议,用于快速识别在芽殖酵母化学基因的相互作用。我们证明使用化疗剂5-氟尿嘧啶(5-FU),其具有定义良好的作用机制的方法。我们的研究结果表明,都需要在5-FU的存在下,这是与以往的米一致增殖外来体和DNA修复酶的核TRAMP核糖核酸icroarray基于条形码化学遗传方法和5-FU的RNA和DNA代谢产生不利影响的认识。这些高通量筛选所需的验证方案也有所说明。

Introduction

的遗传工具,并在模式生物酿酒酵母可利用的资源已启用大规模功能基因组学的研究,它们共同提供了新的见解的基因如何充当网络来履行生物系统的要求。这些工具的基础是在酵母1,2-一套完整的所有开放读框的非必需基因缺失的协作创作。一个显着的观察是,只有约20%的酵母基因时,作为标准的实验室条件下培养单倍体所需的可行性。这凸显了一个细胞通过替代生物途径的利用率,减缓基因组扰动的能力。遗传突变体是可行的单独的,但致命的组合,信号连接或收敛平行生物途径和形式描述的生物学功能的基因相互作用网络。带有条件TE的发展必需基因的mperature敏感和亚效等位基因的等位基因的技术还没有被限制在非必需基因3,4的研究。这个概念已经在基因组规模已经应用产生偏见的遗传相互作用地图说明如何参与类似的细胞过程的基因聚集在一起5。

基因网络的化学扰动模拟基因缺失( 1)6。查询生长抑制化合物对缺失株的高密度阵列,用于超敏反应标识化学遗传相互作用信息, 所需要容忍化学应力的基因的列表。像遗传相互作用,化学文库的大规模的屏幕显示,与动作一起簇7的类似模式的化合物。因此,通过建立一个化合物的化学遗传相互作用轮廓的作用方式,可以通过将其与LAR比较推断GE规模合成的遗传和化学遗传相互作用数据集8,9。

大型化学遗传筛选,其中化合物的分数审问,已经由条码竞争测定进行。在这种方法中,缺失菌株的汇总收集于小体积的含有化学介质中生长集体几代。由于每个缺失突变窝藏一个独特的遗传条形码,个别突变体缺失菌株的池内的生存能力/生长被微阵列或高通量测序10跟踪。

通过监测生长在含有生物活性化合物的固体琼脂物理阵列突变体菌落大小推断健身也识别化学遗传相互作用11,12的有效方法。这种方法提供了一种具有成本效益的替代竞争为基础的筛选,非常适合用于测定化学品的小库。这里所概述是用于制造酿酒化学遗传相互作用的列表的简单方法酵母不依赖于分子生物学操作或基础设施它仅需要一个酵母删除集合,机器人或手动钉扎装置中,并自由可用的图像分析软件。

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Protocol

注意:这个程序的一般工作流程是在图2列出。

1.测定生长抑制的剂量

  1. 酵母过夜培养的制备
    注:在本协议中所使用的酵母提取物,蛋白胨-葡萄糖培养基(YEPD)是一个标准的配方13。
    1. 条纹出BY4741( 的MATa HIS3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)细胞在YEPD琼脂平板孵育48小时,在30℃,或直至可见菌落形成。
    2. 接种5毫升YEPD液体介质中的无菌培养容器与单个菌落制备过夜培养物。隔夜孵育在30℃,连续旋转或晃动。培养通常由早上(〜2×10 8个细胞/ ml)达到饱和。
  2. 固体琼脂培养基制备含有不同的化学剂量
    1. 准备几个股票化学将在100倍所需的终浓度在适当溶剂中进行测试。
      注:有效浓度将取决于化学,并且必须凭经验确定。因此,建议最初测试了广阔的终浓度范围内, 从低μM到高的MM。
    2. 对于化学品的每种浓度进行测试,等分3毫升熔融YEPD琼脂到几个无菌培养管中。发生在55℃水浴,以防止凝固。
    3. 对于化学的各个浓度待测试添加30微升的100倍的化合物的熔融媒体,涡旋2-3秒,以混合,并且吸管1毫升成每对重复试验孔在12孔板中。一定要包括车辆只能控制。允许板过夜设定为室温。放弃任何额外介质。
  3. 传播电镀细胞
    1. 接种10毫升YEPD液体介质与2微升饱和酵母培养物,一夜之间成长为在步骤1中。1.2。
    2. 板25微升稀释酵母培养物每孔,均匀涂抹用无菌玻璃珠或杆,并允许板下火焰干燥。孵育板在30℃下48小时。
    3. 评价酵母在平板上生长(菌落两者总数和大小)。选择的化合物的亚致死浓度不通过大于10%的抑制生长15%来执行屏幕。

2.系统化学遗传屏幕

  1. 缺失突变体阵列的维护源板(DMA)和制备
    1. 有关从甘油股票构建缺失突变体阵列的详细说明请参考Baryshnikova 14。一旦缺失突变体已被排列,以每板384菌落的密度时,DMA可以在4℃保存数月。复制在含有作为必要的G418的200微克/毫升,以防止从菌落生长到每个YEPD琼脂等。
      注意:多个串行复制应该避免,以防止生长缓慢的品系的损失最小化和抑制的突变体的外观。这一点尤其重要,如果保持藏品的单倍体。
    2. 执行使用微生物排列机器人系统中的所有副本电镀步骤。另外,操纵阵列使用手动钉扎工具殖民地。
      注:酵母删除集合可从几个商业渠道单倍体和二倍体和通常运作为甘油储在96孔板中。
  2. 冷凝的缺失突变体阵列
    1. 制备250毫升含有G418的200微克/毫升YEPD琼脂介质。 G418的有效浓度可以变化,并且每批应凭经验测试。
    2. 通过倾倒50毫升含有每板的G418的200微克/毫升YEPD琼脂制备5 YEPD琼脂平板上。冷凝前阵做到这一天,让板冷却,在室温erature隔夜放在平坦的表面上。
      注:四板将需要采集在1536株密度,第五板倾作为额外。
    3. 除去含有以每板384菌落密度的突变体缺失集合16的培养皿,并允许达到室温(约1小时)。
    4. 擦拭用一个棘手的任务擦拭已形成于各板的盖子的任何冷凝。如果不这样做,可能会导致水滴沉积的阵列和阵列突变体的交叉污染上。
    5. 使用微生物阵牵制机器人,从384菌落每板(16培养皿)至1536菌落每盘(4培养皿)的密度凝聚DMA。执行此以便从板1引脚的1次菌落到行冷凝的阵列的第1列1,板2的1次菌落到行1列2,板3的第1次菌落到行2和列1,和板4的第一殖民地行2第2列。
    6. 孵育统一阵列在30℃下过夜。
    7. 检查阵列,以确保殖民地从源盘均匀传输。会有若干空白位置,故意掺入到所述阵列,其中作为指导,以确保在DMA已经凝结正确( 图4A)。
      注意:这些将是复制品镀源板​​在含有试验化合物的介质。单个源板可用于多种pinnings。也有不少机器人将有一个对冲的功能,这将确保酵母正在每次传输类似的数字。
  3. 副本板缺失突变体阵列
    1. 准备700毫升管制(车辆专用)和700毫升实验媒体(含化学品)的。这是足够用于进行一式三份的测定(每个条件12板,加上两个额外)。
    2. 倒入50毫升YEPD琼脂含测试化学或每盘的控制。允许板吨Ø在室温下冷却过夜平坦的表面上。
    3. 使用机器人复制品板,接种在DMA上三套含有化学品的试验确定浓度的板,以及三组含的车辆控制的板。孵育板在室温下搅拌24-48小时。

3.成像板和数据分析

  1. 从孵化器中删除板,并允许他们来室温(约1小时)之前的成像。这将防止凝结而成像板形成。
  2. 在24和48小时通过移除盖和放置面朝下放在平板扫描仪图像板。在至少300 dpi的分辨率捕捉图像。另外,使用数码相机拍摄的图像。如果这样做,地方板块面朝上放在一个黑暗的背景,取下盖子图像。
    注:板的文件格式和定位将取决于所使用的量化方案。 进行量化,用几个开源项目,包括Balony 15,SGAtools 16和ScreenMill 17的一个阵列殖民地大小的比较。

4.验证屏

注:在这个阶段,几个酵母突变体的缺失将比分为过敏感兴趣的化学品。这些化学遗传相互作用必须接下来在两个方面进行验证。第一敏感菌株的身份应通过PCR来确认。二,化学敏感度必须独立评分。下面概述是一个简要的协议用于进行斑点试验,以验证应变超敏反应,在酵母中的生物学共同的技术。

  1. 条纹出所需的(过敏性)从酵母缺失突变体集合到含有G418的200微克/毫升YEPD琼脂上。孵育在30℃,直至菌落形成。通过诊断性PCR验证菌株的基因型与根据引制造商的协议。
  2. 接种将5ml YEPD液体每个菌株的孵育过夜,在30℃下用旋转或摇动。
  3. 测量OD 600和冲淡每个菌株以OD 600 = 1在无菌的dh 2 O.这些是目前的标准化的酵母培养物。
  4. 分配100μl的归一化的野生型酵母(BY4741)培养至A1孔96孔板。分配100μl的附加多达七个品系到孔B1-H1。
  5. 使用多通道移液器通过A6-H6免除90微升无菌的dh 2 O的水井A2-H2。最后,准备了一系列1:10稀释归酵母培养的。开始由串联吹打10微升塔1至第2列与多通道移液器,并继续在96孔板直到6稀释液制成( 10 0到10 -5)。
  6. 使用多通道传输2-5微升稀释的酵母培养物中的网格移液器到含有化学和车辆控制YEPD固体培养基。孵育板在适当温度下24-48小时。
  7. 检查板和比较选择的突变体,以化学(相对于BY4741控制)的灵敏度。在24和图像板48小时如在步骤3.2。
    注意:虽然几种过敏反应菌株与相关基因本体或功能的识别借给信心到屏幕的有效性,一种过敏反应缺失菌株用含有该基因的野生型拷贝的质粒的转化是必需的正式建立一个基因删除的利息(而不是隐藏第二位点突变)导致药物的敏感性。

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Representative Results

作为这种方法的一个验证我们进行化疗剂5-氟尿嘧啶(5-FU),按照以上概述的协议的一个代表性化学遗传相互作用屏幕。 5-FU是已知破坏胸苷酸合成酶,以及DNA和RNA代谢18。 5-FU的化学遗传相互作用是很好的研究,并已研究了通过使用两个杂合和纯合缺失集合8,19酵母条形码微阵列技术。在这里,我们表明,类似的结果可以通过突变菌落大小比较定量来获得。

应当注意的是,执行对画面利用非必需单倍体基因缺失集合。也可以使用二倍体菌株,温度敏感突变体,和亚效等位基因等位基因,使夹杂的必需基因的突变体进行这种类型的屏幕。一个优势利用单倍体删除集合增高药sensitiv性靶途径,给予的完全不存在的基因产物。然而,有两个显著缺点是必需基因超敏反应无法查询,并且单倍体集合是容易被在多个传输量选择为自发抑制突变。这可能导致收集的劣化。因此,有一种内在的权衡阵列和敏感性药物效果的完整性和广度之间。这必须考虑到的最合适的突变体集合中选择基于期望的应用程序。

首先,在屏幕中使用的5-FU的适当的亚致死浓度被确定为10μM的由上增加5-FU的浓度生长BY4741( 的MATa HIS3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)细胞和目视评价酵母集落生长( 图3A)。或者,类似的结果可以通过生长叶来获得AST在微量滴定板中的液体培养及频繁的监测用酶标仪( 图3B)的培养物的光密度,如所概述的先前组10,20。

使用歌手转子,所述酵母的DMA以每板密度1536的菌落复制在含有10μM的5-FU或二甲基亚砜(DMSO)对照( 图4A)的介质。这些板孵育24小时,在室温下,并成象在平板扫描仪。使用Balony图像分析引擎15进行菌落大小测量两个实验组和对照板的每个突变。该Balony软件计算菌落的实验阵列相对于对照的大小比率。用户能够设置一个比率阈值,如果在执行所述屏幕至少一式三份的p值将被分配给每一个突变体。在我们的代表屏幕突变体表现为≤0.8的比例分别考虑ED是命中。菌落量化的结果可以用图形绘制的尺寸比为每个菌落在y轴和基因缺失下令在x轴数组位置( 图4B)或比率( 图4C)被呈现。

合成生病/屏幕识别致命的突变体可以根据功能描述通过对基因本体论(GO)的分析进行分组。有对S.名单GO分析几个公开可用的工具酵母基因;包括Funspec 21,DAVID生物信息学数据库22,23,和酵母基因组数据库(SGD)围棋术语查找24。基因缺失是具有小于或等于0.8,在5-FU的屏幕的比率被用作Funspec输入列表。 Funspec接受系统性或普通酵母菌基因名称列表,并输出基因本体,功能分类,定位,蛋白复合物的摘要以及OT被富集在该列表她的有用的分类。执行的代表性屏幕显示本体的富集用于RNA新陈代谢,包括tRNA的摆动,尿苷修饰和RNA监视机械,以及响应于DNA损伤( 表1)。这些结果与以前的研究已经显示5-FU的处理导致聚腺苷酸化非编码RNA,其通过核TRF / Rrp6 /空气/ Mtr4聚腺苷酸化(TRAMP)外来体25进行处理的积累。因此,这些发现与先前的化学遗传筛选协议和5-FU的生物活性8,19的公知的机构。

如同所有的高通量功能基因组学的方法,有必要验证结果。为了验证化学遗传相互作用的酵母突变体首先应的PCR验证与引物的靶基因的启动子和KANMX中断暗盒内退火。选择菌株有效的ATION是表现出强烈的表型和功能组提供了一个很好的起点有点武断,但优先突变。接下来,过敏的化学用点滴试验,用于测量酵母突变体健身的常用方法证实。为此,酵母菌株的系列稀释在含有适当的化学剂量,以及作为对照的媒体发现在一个网格。作为一个例子,我们确认5-FU与流浪汉复杂的air1trf5突变的化学遗传相互作用( 图5)。这些基因编码的流浪汉核切体的组成部分。我们注意到,rrp6应变,缺乏核心流浪汉3'-5'外切酶活性,失去了在我们实验室的高密度DMA集合。上获得新鲜rrp6突变体,我们证实rrp6和 5-FU也显示一个化学遗传相互作用,确定该TRAMP活性是必需的,以容忍的5-FU。这说明该大型删除收藏的完整性可能会受损随着时间的推移,使正确的DMA维护和应变验证的关键。

我们的屏幕还确定了一些DNA修复酶(包括RAD50,RAD52MRE11),5-FU敏感的突变体。菌落大小的得分表明这些突变体的相对适合于10μM的5-FU为0.7,0.65,和0.42与野生型相比。基于我们确证斑点测定( 图5),这些值是一个低估可能是由于健身测量通过菌落大小的得分的有限的动态范围。这突出了第二个原因,独立确认串行斑点相互作用:一些化学遗传相互作用的大小可以在原始数据的分析低估。我们的研究结果表明,与〜4800株单倍体删除集合进行,一式三份增长为基础的化学遗传屏幕,提供了足够的甲阶酚醛树脂 ution自信地分离特定的化学基因的相互作用。

图1
图1:该导致过敏的化学扰动化学遗传相互作用的示意图基因缺失允许通过化学靶向生物过程的识别。 (A)收敛的途径可以通过基因缺失(geneA)或化学(geneB)被打乱。单独,这些细胞损伤可以是由于在生物学通路的固有冗余可以容忍的。然而,在组合细胞活力受到损害导致在任一合成生病或致死表型。 (B)基因(geneC)减轻化学诱导的压力也导致过敏,并指出通过化学处理破坏生物途径的关键缺失。 jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:流程化学遗传筛选 (A) 测定亚抑制剂量父母的酵母菌株生长至稳定期,稀释1:5000,以及扩频铺在含有增加的化学剂量固体YEPD培养基。被选择用于筛选对DMA具有不大于10〜15%的生长抑制的最高浓度。 (B)系统的化学遗传屏幕:使用高通量阵列寄托机器人S.酵母 DMA是副本镀上含有化学试验的适当浓度的媒体。板在室温下孵育24-48小时,成像,和相对菌落大小决定。REF =“htt​​ps://www.jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig2highres.jpg”目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3:。测定亚抑菌浓度(A)含5 fluouracil固体介质BY4741细胞的生长。饱和BY4741培养稀释1:5000和铺在5-氟尿嘧啶的浓度增加。在含5-氟尿嘧啶的液体介质(B)的生长BY4741细胞的曲线。 〜4×10 4个细胞沉积在一式三份测定每10分钟22小时增加了5-FU和消耗臭氧层物质的浓度。

图4
图4:5-化学遗传筛选氟尿嘧啶(A)S.酵母缺失突变体阵列上复制YEPD琼脂含有10μM的5-FU(右)和DMSO对照(左)。 (B)化学遗传筛选结果:突变体对10μM5-FU的相对增长相比,DMSO控制下令阵列的位置。突变体对10μM5-FU(C)相对增长相比,DMSO控制下令菌落大小比。对≤0.8比率阈值显示两个图形。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5:化学遗传相互作用的验证 。对生长在DMSO控制(A)的几个分离的突变株系列稀释,10μM5-FU( (MMS℃)。

GO类别 P值 确定的基因(点击) #命中 在GO类别基因总数#
tRNA的摆动尿苷修改[GO:0002098] 2.24×10 -6 SIT4 NCS6 URM1 KTI12 IKI3 TUM1 ELP3 7 24
转录,DNA依赖[GO:0006351] 1.69×10 -5 PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 RPA14 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 MET18 CTK2 RPB4 SWI3 RPA12 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 32 540
翻译[GO:0006412] 4.28×10 -5 RPL19B RPS11B FES1 RPS9B RPL31A RPL24A RPL7A RPS25A RPL26B RPL11B RPL27A RPL34B RPL14A TEF4 RPS29A RPL6A AEP1 RPS16A MRP7 RPS19B RPS19A RPS7A 22 318
tRNA的摆动位置尿苷硫醇[GO:0002143] 1.88×10 -4 NCS6 URM1 TUM1 3
转录调控,DNA依赖[GO:0006355] 4.98×10 -4 PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 SWI3 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 27 507
蛋白质urmylation [GO:0032447] 6.33×10 -4 NCS6 URM1 URE2 3 7
从核反应中的mRNA出口热应力[GO:0031990] 2.04×10 -3 RPB4 NUP120 NUP133 3 10
核多聚腺苷酸依赖CUT分解代谢过程[GO:0071039] 2.04×10 -3 AIR1 TRF5 MPP6 3 10
色氨酸代谢过程[GO:0006568] 2.15×10 -3 TRP5 TRP3 2 3
早期的内吞体高尔基运输[GO:0034498] 2.75×10 -3 ENT5 TCA17 RCY1 3 11
核糖体小亚基的生物合成[GO:0042274] 3.63×10 -3 SAC3 LTV1 RPS19B RPS19A 4 24
染色质修饰[GO:0016568] 3.64×10 -3 LDB7 HIR1 SPT7 NGG1 SPT3 SDS3 ASH1 SGF11ELP3 9 114
ATP的代谢过程[GO:0046034] 4.23×10 -3 VMA2 VMA1 2 4
空泡质子传输V型ATP酶复杂装配[GO:0070072] 4.23×10 -3 VMA21 VPH2 2 4
染色体定位[GO:0050000] 4.23×10 -3 NUP120 NUP133 2 4
mRNA的运输[GO:0051028] 4.59×10 -3 DHH1 SAC3 LOC1 KAP114 NUP120 NUP133 6 58
空泡酸化[GO:0007035] 4.89×10 -3 VMA2 VMA1 VMA5 VPH2 4 26
rRNA的出口从细胞核[GO:0006407] 5.63×10 <SUP> -3 NUP120 NUP133 RPS19B RPS19A 4 27
内吞作用[GO:0006897] 6.57×10 -3 SLA1 EDE1 CDC50 ART5 RCY1 VPS1 END3 7 82
mRNA的3'端处理的细胞核mRNA监视[GO:0071031] 6.92×10 -3 AIR1 MPP6 2
非编码RNA多聚腺苷酸[GO:0043629] 6.92×10 -3 AIR1 TRF5 2
核多聚腺苷酸依赖的snoRNA分解代谢过程[GO:0071036] 6.92×10 -3 AIR1 TRF5 2
核多聚腺苷酸依赖性小核RNA代谢过程[GO:0071037] 6.92×10 -3 AIR1 TRF5 2
色氨酸生物合成过程[GO:0000162] 6.92×10 -3 TRP5 TRP3 2
蛋白插入ER膜[GO:0045048] 6.92×10 -3 GET1 GET4 2
mRNA的稳定性[GO:0048255] 6.92×10 -3 ATP25 IGO1 2
DNA损伤反应的刺激[GO:0006974] 7.05×10 -3 MUS81 R​​AD2 MET18 CTK2 RPB4 GRR1 DEF1 MMS22 RAD52 RAD50 MRE11 RMI1 12 197
“>#命中
GO类别 P值 确定的基因(点击) 在GO类别基因总数#
核多聚腺苷酸依赖性rRNA的分解代谢过程[GO:0071035] 8.46×10 -3 AIR1 TRF5 MPP6 3 16

表1:基因本体论(GO)的5-氟尿嘧啶敏感突变体的表征。

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Discussion

这里列出的是产生化学遗传相互作用的配置文件的方法。该方法是简单的:通过比较在对化学品的存在和不存在完整基因缺失集合各菌株的菌落的大小,要容忍化学损伤所需的所有基因被识别。所得敏感菌株的列表的注释富集分析然后可以用于提供洞察行动的化学物质的模式。虽然该协议已被优化的芽殖酵母,它也可以适用于与其他阵列微生物缺失的集合,如大肠杆菌使用大肠杆菌庆应大学集合,它已成功地用于探测数百蜂窝扰动26,27。

化学遗传谱在酵母和其它生物是公认的。这些研究大部分都依赖于该量化通过微阵列分析或高通量汇集色曲缺失突变体的竞争试验接近开关就是嵌入式独特的基因条码。这种方法已经被证明是成功生产大型化工库强大的化学基因图谱。此处描述的方法提供了用于更小的数字测试化合物的化学遗传分析的有用的替代方案。该试验提供了一个简单的读数比的高通量测序或微阵列分析更低的成本高昂和从序列偏压不会受到影响。而作为概述的协议要求的机器人工具菌落操作,这样的系统正变得更便宜,并且交替的协议可以被调整为与手动钉扎工具,其例子已列入的材料清单的使用。

要注意的这种方法和化学遗传谱在一般的限制是重要的。首先,该化合物必须有生存能力的效果在芽殖酵母,或正在使用的特定生物。虽然许多基本生物过程和功能是公保守之间真核生物有机体特异性化学遗传相互作用可以广泛地变化,也将化学品的摄取到细胞中。还应当指出的是几个缺失株已被发现是对多种药物治疗8敏感。这些包括涉及药物流出,液泡功能,和膜完整性的基因。相对于直接和动作的间接方式作出结论时考虑到多重耐药性是很重要的。

利用单倍体删除集合,在酵母中的化学遗传分析的常用方法进行此处描述的画面。现在有可用的行动化合物的模式的确定进一步的援助酵母突变体的多个集合。这不仅包括完整的纯合和杂合二倍体缺​​失集合,但也有条件温度敏感必需基因的突变体,所述DecreASED丰度mRNA的扰动(DAMP)的酵母突变体文库,和合成的组蛋白H3和H4的突变体集合,它可以被用来研究后生基于分子疗法3,4,28,由于工具的不可思议的深度可用,则易于的方法,以及所需要的基础设施有限,这种方法提供了一个可访问的格式,以相对于访问丰富的功能的信息的化学化合物的作用机制。

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Acknowledgments

研究在CJN实验室由NSERC,加拿大癌症协会研究所(CCSRI),以及加拿大乳腺癌基金会(BC-育空分公司)工作的资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast Extract BioBasic G0961 For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v)
Tyrptone Powder BD Biosciences 211820 For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v)
Dextrose Anachemia 31096-380 For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) — do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving.
Agar A Bio Basic FB0010 For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v)
G418 A.G. Scientific Inc. G-1033 Prepare 1,000x stock at 200 mg/ml in dH2O and filter sterilize. 
12-well plate Greiner Bio One 655180
5 ml culture tubes Evergreen Scientific 222-2376-080
10 cm Petri Dish VWR 25384-302
ROTOR HDA Singer Instruments  ROT-001 high-throughput microbial array pinning robot
PLUSPLATE© Petri Dish Singer Instruments  PLU-001 Box of 200 dishes
384 Short-Pin RePad Singer Instruments  RP-MP-384 Box of 1,000 pads
1536 Short-Pin RePad Singer Instruments  RP-MP-1536 Box of 1,000 pads
Alternative Pinning Tools:
Fully Automated Robtic Systems S&P robotics http://www.sprobotics.com Several automated colony handling robitic and imagining systems available.
Manual Pinning Tools V&P Scientific http://www.vp-scientific.com Handheld replication tools and accessories. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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