쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 Arborization의 평가

Neuroscience

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Das, D., Phillips, C., Lin, B., Mojabi, F., Akif Baktir, M., Dang, V., Ponnusamy, R., Salehi, A. Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52371, doi:10.3791/52371 (2015).

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Abstract

Introduction

시냅스의 수와 구조의 동적 변경은 개발, 노화의 특징, 그리고 수많은 신경 퇴행성 질환 1-3. 시냅스 정보를 수신하고 통합하는 신경 세포의 능력은 돌기 형태와 시냅스 연결의 동적 변경에 따라 달라집니다. 실제로 양의 상관 관계는인지 기능 4에 영향을 모두 돌기 척추 및 시냅스 번호 사이에 존재합니다. 따라서, 수지상 척추 수의 감소가 돌기 척추 정량에 큰 관심을 자극, 신경 장애 5-7의 숫자에인지 기능 장애와 관련 된 것은 놀라운 일이 아니다. 그럼에도 불구하고, 척추 밀도 정량화 수지상 트리 걸쳐 시냅스의 지형 및 분배에 관한 유용한 정보를 생성하지 못하는 시간 소모적이고 지루한 작업이 남아있다. 다행히, 염색 방법 (예를 들어, 골지체 - 콕스와 doublecortin (DCX)) 함께정교한 영상 기술로 현재 장벽을 극복하고 신뢰성 있고 신속하게 수지상 arborization의 고해상도 이미지를 생성하기 위해 이용 될 수있다. 골지 - 콕스 염색 방법은 모든 뉴런 8 수지상 arborization의 상태를 평가하기 위해 배치 될 수 있지만, DCX는 신경이 모두 발생 주어진 특히 치아 이랑 (dentate gyrus)과 뇌실 영역 (9), 중요한 고려 사항에 새로 태어난 뉴런에 라벨을 배포 할 수 있습니다 수명 (10, 11)에 걸쳐이 지역.

염색 후, 두 개의 촬상 방법은 수지상 특성을 평가하기 위해 배치되었다 : ⅰ) 실시간 영상 (RTI) 및 필드 영상 (EDFI)의 Ⅱ) 확장 깊이. RTI의 기술은 추적 및 개별 수지상 세그먼트와 가지를 따라 arborization의 길이와 순서를 정량화 평균을 제공한다. 그러므로 그것은 전체 면적과 각 수지상 트리가 차지하는 부피를 추정을 가능하게한다. 이상의 S를pecifically, RTI의 방법에서 사용자는 연속 세그먼트를 식별하고 추적 소프트웨어 뉴​​런 수지상 구조의 X, Y, Z 좌표를 수집로 반복적으로 초점을 다시 맞 춥니 및 3D에 수지상 구조의 궤도를 재구성한다. 비교적, EDFI 방법은, 합성 화상을 생성하는 전체의 z 축에 대한 정보를 제공함으로써 다소 두꺼운 조직 표본에서 수지상 밀도를 평가하기위한 비교적 간단하고 신속한 방법을 제공한다. 이를 위해, 사용자는 단면의 두께에 걸쳐 고해상도 비디오 파일을 기록하고, 화소에 초점이 완전히 상기 점을 식별하는 비디오 프레임들을 검색하는 소프트웨어를 사용한다. 계속해서, 포커싱 된 화소가 병합 및 고해상도, 복합 2D 화상으로 통합된다. 이 합성 이미지에 관계없이 z 축에서 자신의 위치에 초점 있던 모든 픽셀이 포함되어 있습니다. 이러한 2 차원 영상의 정성 및 정량 분석​​은 밀도를 결정하기 위해 후속 적으로 사용될 수있다수지상의 필드마다 분파.

마지막으로, 관심의 전체 영역에서의 분석 및 평가를위한 수지상 매우 높은 해상도의 이미지를 생성하는 파노라마 방법을 제시한다. 이 기술은 매우 고해상 비싼 디지털 카메라에 대한 액세스의 부족을 극복하기 위해 배치 될 수있다. 이 방법을 사용하면, 하나가 X 축 및 Y 축을 따라 다른 위치에 일련의 이미지를 캡쳐 한 후 자동으로 함께 스티칭 프리웨어를 사용 (예를 들어, 이미지 합성의 편집자). 특히,이 방법은 다소 넓은 영역에서 수지상 arborization의 정량적 평가를 위해 사용될 수있다.

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Protocol

참고 : 실험은 재향 군인 팔로 알토 보건 의료 시스템에서 동물 연구위원회의 승인을 윤리적 기준에 따라 수행되었다.

1. 골지 - 콕스 염색

  1. 뇌 적출 염색
    1. 1 일에 깊이 일어난 과다 출혈를 통해 안락사 전에 100 ㎎ / kg 케타민 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 (xylazine)와 쥐를 마취.
    2. 조심스럽게 두 개관을 제거하고 뇌를 해부.
      1. 제 소뇌의 상부에 만곡 시저를 배치, 두개골 위에 피부를 제거하고 부드럽게 후각 망울 향하는 방향으로 이동하는, 외측 지적 시저의 끝 중앙 고랑에 두 개관 평행 통해 잘라. 양쪽에이 과정을 반복합니다.
      2. 후각 전구쪽으로 선회하면서 두 개관을 들어 올려 끊다 수술 pincet을 사용합니다. 그런 다음, 거꾸로 두개골을 뒤집어 광학 통해 잘라 픽업을 사용하여신경과 뇌를 풉니 다. 마지막으로, 난원 매그넘의 수준에서 척수에서 뇌를 분리 픽업을 사용한다.
    3. 즉시 시판, 희석 골지 - 콕스 솔루션의 15 ml의 뇌를 체험. 실온에서 어두운 곳에서 캡핑 된 20 ㎖의 유리 병에서 골지체 용액 뇌 보관.
    4. 둘째 날, 천천히 솔루션을 부어 15 ml의 신선한 골지 - 콕스 솔루션으로 교체. 뇌가 들어있는 병을 요점을 되풀이하고 어둠 속에서 또 다른 구일에 대한 방해받지 둡니다.
  2. 단면 및 매립
    1. 11 일에, 탈수 DDH 2 O에서 제조 된 30 % 자당 용액에 머리를 놓으십시오. 12시간 후 새로 제조 한 30 % 자당과 솔루션을 변경합니다. 4 ° C에서 3 일간 30 % 자당 용액에 머리를 품어.
    2. 블레이드가 덮여 때까지 14 일에, 30 % 자당 용액에 vibratome의 저수지를 입력합니다. 1m에 속도를 설정합니다m / s의 0.95 mm의 진폭.
    3. 과도한 습기를 제거하고 coronally 잘라 면도날을 사용하여 소뇌를 제거 킴과 머리를시킨다.
    4. 단단히 superglue를 사용하여에 vibratome 플랫폼으로 전체 뇌를 탑재하고 2-4 분 동안 설정할 수 있습니다. 저수지에 부착 된 뇌와 플랫폼을 삽입하고 뇌의 정상에 블레이드를 조정합니다.
    5. 에 vibratome를 사용하여, 모든 3 뇌 후 블레이드를 변경 기억, 실온에서 150 μm의 두께 섹션으로 뇌 슬라이스.
    6. 작은 끝이 브러시를 사용하여 저수지에서 섹션을 들고 DDH 2 O.에서 만들어진 0.3 % 젤라틴을 포함하는 페트리 접시로 몰입 섹션을 배양 접시에 남아 있지만, 각각의 슬라이드에 0.5 ml의 0.3 % 젤라틴의 추가 확산 코트 superfrost + 슬라이드에 브러시를 사용합니다.
    7. 조심스럽게 페트리 접시에서 침지 된 부분을 선택하고 젤라틴 슬라이드에 배치합니다. 에 의해 뇌 부분의 방향을그들의 측면에 아닌 꼭대기에 그들을 감동.
    8. 약 10 분 후, 코팅은 조직이 완전히 건조 30 % 수크로오스 전에 섹션. 그 후 공기는 3 일간 슬라이드 랙에 어두운 곳에서 준비한 슬라이드를 건조.
    9. DDH 2를 사용 O. 배일 시판의 10 배 희석하여 현상액 7-10 분 동안 솔루션을 개발하는 슬라이드를 담가. DDH 2 O.에서 슬라이드 3 회 씻어
  3. 탈수
    1. 증류 DDH O.이 다시 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % 에탄올 용액을 준비
    2. 10 분 각각에 대해 점점 더 높은 에탄올 솔루션에 슬라이드를 만끽.
    3. 10 분마다 100 % 에탄올 용액을 3 번 슬라이드를 담근다.
    4. 그들이 커버 미끄러 때까지 최종 솔루션에 섹션을 유지, 5 분마다 100 %에 크실렌 3 회 연속 슬라이드를 만끽 해보세요.
    5. DPX (크실렌 디 -n- 부틸 프탈레이트) 매체를 장착 (AB의 충분한 양을 배치플라스틱 이전 피펫을 사용하여 각 슬라이드 아웃 1.5 mL)을 첨가 하였다. 조심스럽게 거품을 방지하기 위해 커버 슬립을 배치합니다.
    6. 공기 건조 커버 미끄러 뇌 섹션 수평으로 3 일 동안.

2. Doublecortin 염색

  1. 깊이 (1.1.1 참조) 동물을 마취.
  2. 인산 버퍼 (12)에 만든 갓 준비 4 % 파라 포름 알데히드와 심장 관류를 수행합니다.
  3. 흔들 통에 밤새 4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드의 45 ml의의 두뇌 (1.1.2 참조) 및 저장 압축을 풉니 다.
  4. 30 % 자당 용액에 머리를 전송하고 4 ℃에서 48 시간 동안 완전한 탈수 기다립니다. 자당에서 뇌를 제거하고 드라이 아이스에 배치 구리 블록에 직접 배치합니다.
  5. 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물과 블록을 작성하고 랜드 마크로서 후각 망울을 사용하여 뇌의 방향을 표시합니다.
  6. 저온 유지 장치를 사용하여 -20 ºC에서 70 미크론 두께 부분을 잘라 놓습니다동결 방지제 용액 (0.05 M 인산 나트륨 완충액에서 25 % 에틸렌 글리콜 25 % 글리세롤, pH를 7.4)에 -20 ℃에서 사용할 때까지 유지한다.
  7. 50 % 동결 방지제 50 % 메탄올 용액을 확인합니다. 이 용액에 0.5 % 과산화수소 (용적 / 용적)을 추가한다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션 부유 섹션.
  8. 조직 학적 오븐에 배치하여 30 ~ 40 분 TBS에서 37 ºC (TBS 버퍼)의 따뜻한 섹션.
  9. 면역 염색 전에 실온에서 45 분 동안 0.3 % 트리톤 3 % 정상 말 혈청 섹션을 인큐베이션. 0.3 % 트리톤 1 % 정상 말의 혈청 TBS 500 : 밤새 일을 희석 DCX 항체의 3 ㎖ 용액에 4 ºC에서 섹션을 품어.
  10. 다음 날은 TBS에서 섹션을 (10 분마다)를 연속 3 회 반복한다.
  11. 실온에서 2 시간 동안 (TBS 200 1) 바이오틴 말 방지 염소와 섹션을 품어. TBS에서 섹션을 (10 분마다)를 연속 3 회 반복한다.
  12. t을 품어실온에서 1.5 시간 동안 : ABC 라이트 (1,000 일)와 밑단.
  13. 2 O 2 DAB 10 mg을 1 M 트리스 - 염산 (PH 7.6) 15 ㎖에 용해 (3,3 "-Diaminobenzidine) 솔루션 중 하나 태블릿에 30 % H의 5 μl를 추가합니다. 5 분 동안이 솔루션에 즉시 섹션을 품어.
  14. 빙냉 TBS 실온에서 TBS에서 세척 한 다음에 세 번 세척하게하여 반응을 정지.
  15. 크실렌 맑은 에탄올 용액의 시리즈 (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, 5 분마다)를 이용하여 부분을 탈수하고, 단계 1.3에서와 같이 DPX를 사용하여 슬립 커버.

3. 시각화

  1. 섹션의 완전한 건조에 이어, 날카로운 블레이드와 슬라이드의 상단에 초과 DPX를 제거하고 현미경 스캐닝 스테이지에 배치합니다. 스캐닝 시스템은 스테이지, 조이스틱, 및 12 비트 컬러 카메라가 장착 된 현미경으로 구성된다.
  2. 프로그램을 시작합니다. 새로운 데이터 파일을 엽니 다.
  3. 장소임의의 장소에서 마우스 포인터를 클릭하면 화면상의 기준점. 이 프로그램 윈도우의 도구 패널에서 모든 아이콘이 활성화됩니다.
  4. 도구 모음에서 "조이스틱 무료"아이콘을 클릭 한 다음 첫 번째 섹션에서 해마의 치아 이랑의 위치를​​ 조이스틱을 사용합니다.
  5. 프로그램 창의 '도구'탭에서 "직렬 과장"을 선택합니다. 윈도우의 왼쪽 하단에 "새 절"아이콘을 클릭합니다. 이것은 "직렬 섹션 설정"창이 열립니다.
  6. 직렬 제 설정 창을 선택하고 해마 영역을 포함하는 섹션의 총 수를 입력합니다. 평가 간격을 선택합니다. 섹션 절단 두께 (DCX 70 μm의 골지 염색 섹션 150 μm의)를 입력합니다.
  7. 도구 모음에서 "프리 핸드 윤곽선 그리기"아이콘을 클릭하여 치아 이랑 (dentate gyrus) 영역을 추적을 시작합니다. 이가있는 과립 세포층 개요. </ 리>
  8. "확대"메뉴에서 "100 배"를 선택합니다. 섹션에 침지 기름 한 방울을 추가하고 100X에 목표를 전환합니다. 이러한 목표 아래 이가있는 과립 세포 기관과 수상 돌기를 찾습니다.
  9. 선택된 신경 세포에 초점 도구 모음에서 "신경 추적"아이콘을 클릭합니다. 이가있는 과립 전지 본체의 원주를 추적. 추적이 완료되면 바로 "마침 셀 바디"를 선택합니다.
  10. x, y 및 z 방향에서 수동 수지상 추적을 시작하고, 조이스틱 및 Z 모터 노브를 사용하여 각 지점을 따른다. 분기 또는 삼 분기 노드에서 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭시 드롭 다운 메뉴에서 해당 옵션을 선택합니다. 이러한 노드에서 발생하는 각 분기를 추적합니다. 각 지점의 끝에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 드롭 다운 메뉴에서 "종료"를 선택합니다.
  11. 프로그램 창의 화살표 키 아이콘을 사용하여 무작위로 다른 이가 과립 셀을 선택하고 대하여 descr와 동일한 절차를 따라단계 3.9-3.10에 ibed. 전체 추적을 저장합니다.
  12. 신경 추적 소프트웨어를 시작합니다.
  13. 실험 그룹의 첫 번째 마우스에서 첫 번째 NRX 데이터 파일을 엽니 다. 실험 집단의 두 번째 마우스의 NRX 파일을 추가합니다. 이 그룹의 모든 NRX 파일이 추가 될 때까지 계속합니다.
  14. 분석 탭에서 "팬에서 다이어그램"을 선택합니다. 이 팬에서 분석 창을 엽니 다. 마크 "수상 돌기"을 확인하고 쥐의이 그룹 (그림 1)에 대한 수상 돌기의 길이와 분기 패턴을 묘사 표시를 클릭합니다.

4. EDFI

참고 :이 방법은 각 필드의 급속 Z 축 통해 다수의 이미지를 기록하고 Z 축에 걸쳐 모든 화소가 포함 포커싱 2D 화상을 생성하는 것을 가능. 결과는 수집 된 이미지에서 모든 초점을 맞춘 픽셀을 포함하는 합성 이미지 될 것입니다.

  1. 디지털 캠에 ​​현미경을 연결시대. 현미경에 연결된 스캔 무대에서 첫 번째 섹션을 배치하고 10 배 목표로 전환합니다. 관심의 영역으로 무대를 이동합니다.
  2. 비디오 캡처 프로그램을 시작합니다.
  3. 녹음 버튼을 누릅니다. 즉시 녹화 버튼을 누르면 같이, 4 초 총 부의 상단에서 하단으로 이동 매크로 포커스 노브를 사용. 결과 비디오 파일을 저장합니다.
  4. 파일을 열고 파일 압축 형식으로 저장하여 비 압축 형식으로 AVI 비디오 파일을 변환 ImageJ에 프리웨어를 사용한다.
  5. 이미지 분석 프로그램을 시작하고 AVI 파일을 엽니 다. "프로세스"메뉴로 가서 "필드의 확장 깊이"을 클릭합니다. 해당 비디오 파일을 선택합니다. "출력"옵션에서 "복합 베스트 초점 이미지 생성"을 선택합니다.
  6. "집중 분석"옵션에서 "표준화 된 조명"과 "최대 지역 대비"옵션을 선택합니다. 그런 다음, "Cre 호텔을 선택"먹었다. 결과 이미지는 z 축에 걸쳐 모든 화소 포커스 (도 2)를 나타낸다.
  7. 결과 이미지를 저장합니다.

5. 매우 높은 해상도 이미지를 생성

주 :이 방법은 사용자가 자동​​으로이 자동화 방식으로 저배율과 고배율 고해상도 이미지에서 매우 높은 해상도의 이미지를 생성 할 수있다.

  1. 현미경에 연결된 스캔 무대에서 첫 번째 섹션을 놓습니다. 현미경은 디지털 카메라에 접속된다. 관심의 영역으로 무대를 이동합니다.
  2. 화상 취득 프로그램을 시작한다.
  3. 10 배 목표를 사용하여 획득하고 10 % 이상 중복을 가지고 확인하는 관심 영역에서 높은 해상도 (3116 X 4076) 이미지를 저장합니다.
  4. 실행 이미지 합성 편집기는 이미지를 스티치합니다.
  5. 파일 (File) 메뉴로 이동하고, "새 파노라마"을 클릭합니다. 이미지 세인트 된 폴더를 선택OR 연산. 같은 지역하고 "확인"에 속하는 이미지를 선택합니다.
  6. 보도는 "수출 디스크에"버튼을 누르면 이미지를 저장합니다. 이 이미지는 분석 및 / 또는 데모 (도 3)에 사용될 수있는 관심 영역의 매우 높은 해상도의 화상을 나타낸다.

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Representative Results

현존 및 새로 태어난 이가 과립 세포로부터 발생 arborization의 범위는 골지체 콕스 - 또는 DCX 염색법 (도 1)를 사용하여 야생형 마우스에서 분석 하였다. DCX 양성 세포 수지상 세그먼트는 13-36 미크론 긴 것으로 밝혀졌다. 수지상 길이의 정규 분포 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 테스트하여 테스트 하였다 (D = 0.1217, P <0.01, Liliefors의 p <0.001;도 4 및도 5).

arborization 순서 당 세그먼트 길이의 분석에서 가장 긴 세그먼트 arborization (38.38 + 1.45 μm의) 제의 순서로 나타났다. 비슷한 패턴은 표면 (111.98 + 3.93 평방 미크론) 및 볼륨 (27.93 + 1.03 입방 μm의)에 대한 발견되었다. 이러한 세그먼트에 의해 점유 된 세그먼트의 길이와 면적 및 / 또는 부피 사이의 선형 관계는 또한 시험 하였다. 두 표면 (P = 0.001, R2 = 0.873) 및 볼륨 (P = 0.001, R = 0.621 2) C각 수지상 세그먼트의 길이에 따라 크게 orrelated.

그림 1
도 1 :. 여기서 팬 다이어그램 해마 이가 과립 세포 수지상 길이를 평가하기 위해 사용 된 이러한 시각화 툴 수지상 길이 또는 다른 치료법이 유전형 효과를 비교하는데 사용될 수있다. 측정 단위는 μm의 것이다.

그림 2
그림 2 : (A)없이 수지상 arborization의 시각화 및 EDFI (B) 방법에. 최적의 포커스 평면을 찾는 방법은 전통적인 EDFI과 비교 하​​였다 (데이터는 도시하지 않음) EDFI 법 (p = 0.02)를 사용하여 수지상 영역의 상당히 높은 값을 발견했다. 스케일 바= 100 μm의.

그림 3
그림 3 :. 마우스의 해마 영역의 고해상도 이미지를이 매우 높은 해상도 이미지가 자동으로 10 (4076 X 3116) -pixel 이미지를 바느질로 구성된다. 베어 = 100 μm의 크기를 조절합니다.

그림 4
그림 4 :. 분기의 다른 순서의 수상 돌기가 차지하는 길이와 볼륨의 정량은 최대 길이와 볼륨 순서 1에서 달성했다.

그림 5
그림 5 :. D의 수지상 세그먼트의 이가있는 과립 세포의 수지상 길이의 히스토그램 대부분CX-스테인드 수상 돌기의 길이는 13-26이었다. 붉은 점선은 제시된 데이터 정규 분포를 나타낸다.

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Discussion

여기서 두 가지 방법 RTI와 EDFI와 함께 기존의 염색 방법을 사용하여 성숙하고 새로 태어난 뉴런의 수상 돌기 arborization의 정도를 정량화하는 기술되었다. 뉴런의 고해상도 영상의 획득은 차례로, 해마의 신경 세포를 표적 치료 전략을 평가하는 수단을 제공하며, 신경 퇴행성 장애의 해로운 영향을 테스트하기 위해 매우 유용한 방법을 제공한다.

RTI의 방법은 심층 데이터 arborization 지형의 범위에 속하는 캡처하기 위해 이용되었지만, EDFI 방법은 개인 세그먼트 또는 나무의 복잡도에 관한 정보를 제공하지 못한다. 그럼에도 불구하고, EDFI 방법의 장점은 고가의 하드웨어의 구입을 요구하지 않으며, 시간이 덜 소모되고 있다는 사실에 놓여.

이미지 분석 프로그램이 비디오 파일에서 EDFI을 수행하는 데 사용 하였다. 높은 해상도와 빠른에 갖는 액세스카메라는 각 필드의 두께에 걸쳐 많은 수의 화상을 수집 할 수 있으며 진정한 x, y 및 z 치수를 나타내는 이미지를 생성한다. EDFI 방법의 단점은 하나 이상의 화소 (동일한 x 및 y) z 축에 걸쳐 서로 다른 평면에서 초점이있을 수 있다는 사실에 관한 것이다. 방법은 정확히 2 차원 영상에서의 3D 정보의 범위를 나타내는 이들 화소에 서로 다른 색을 할당 구상된다. 그것은 EDFI 방법은 또한 셀룰러 프로필 (예, 시냅스, 미세 아교 세포, 성상 세포)의 분석에 이용 될 수 있음을 주목해야한다. 또한,이 방법은 제 7의 두께에 걸쳐 소교 분포의 정도를 분석하는데 사용될 수있다. 여기에 설명하는 두 가지 방법은 상보적인 방식으로 사용될 수있다. RTI의 방법은 패턴을 분기의 지형에 대한 정확한 정보를 제공하는 반면, EDFI는 우리의의 영역에서 수상 돌기의 밀도를 평가하기보다는 간단하고 신속한 방법을 제공합니다관심 대상. 특히 EDFI으로 취득 할 수있다 부의 두께 EDFI의 경계는 현미경의 광학 목표 포커스와 조합 현미경 Z 스테이지 초점 범위와 매우 가변적 지시한다.

본원에 기재된 방법은 전위가 여러 상황에서 배치되어야한다. EDFI가 소교 활성화 (7)을 정량화하는 데 사용 된 반면,이 연구에서 우리는 수지상 arborization 사전 및 사후 개입의 변화를 평가하는 수단을 제공했다. 따라서,이 기술은 최종 목표 다중 층에서 발견 될 수있는 작은 프로파일의 변화를 평가하는 것을 특징으로하는 응용 프로그램 의무이다.

마지막으로, 이들 기술은 매우 고가의 고해상도 디지털 카메라에 대한 액세스의 부족을 극복 할 수있다. 본질적으로, 방법은 함께 궁극적 프리웨어를 사용 yieldin 검체 내 위치의 다른 지점에서 일련의 이미지를 캡처하고이를 스티치 방법에 나타내었다훨씬 더 안정적이고 신속한 종래의 방법보다 g 방식으로 고해상도 이미지.

중요한 단계

골지 염색

스톡 골지 개당 현상액은 염색 배양 프로토콜이 용액을 실온에서 이용 될 필요 아직 저장 4 ℃에서 유지되고있다. 골지 냉각 얼음이나 냉장고에 솔루션을 개발하는 것은 악영향을 수상 염색의 품질에 영향을 미칩니다. 또한, 우리가 빠른 현상 골지체 솔루션을 사용하는 것을 주목해야한다. 본 연구에 사용 된 골지 콕스 - 용액의 정확한 조성은 독점적이지만, 다수의 소스 - 골지 콕스 13 염색을 수행하는 데 사용할 수있는 프로토콜의 세부 사항이 목록이있다. 그러나, 다른 골지 - 용액의 사용은 현저하게 이루어져야 따라서 이러한 단계에 대한 기간 및 변형 염색 변경할 것이다. 또한, 우리는 함께 다른 사람들과 우리가그것은 일반적으로 두께 coronally 및 이가 과립 세포 arborizations 평행 섹션을 절단하는 수지상 분기 절단의 위험을 최소화한다는 합의 된 바와 같이 두께가 150 μm ED 섹션 DGC 뉴런에게 14,15 분석.

DCX 염색

DCX 염색 프로토콜은 온도에 명시주의가 필요합니다. 예비 배양 기간 동안 37 ° C에 대한 해결책을 가열하지 않으면 크게 염색 손상 및 수지상 시각화의 손실이 발생할 것입니다. 또한, 단면 두께에 관심을 보증합니다. 이 연구에서 우리는 DGCs 수지상 arborization의 최대 범위를 캡처하는 70 μm의 두께 섹션을 사용했다. 따라서 매우 부동 부분의 두께에 걸쳐 항체의 침투를 용이하게 우리의 경험에 의하면, 0.3 % 트리톤의 사용은 필수적이다. 사실, 이전의 연구는 70 μm의 두께 (16)을 관통하는 트리톤을 사용하고 심지어 두꺼운 (120 μm의) 17섹션과 라벨 DGC 덴 드라이트 (dendrite). DCX 18 염색의 자세한 내용에 대한 Hussaini를 참조하십시오.

마지막으로, 대안 오픈 소스 프로그램 (예 flNeuronTool 또는 Simple_Neurite_Tracer)는 X, Y, Z 방향에서 스테이지의 움직임을 기록 할 수있는 능력과 함께 존재한다는 것을 유의해야한다. 이러한 프로그램들이만큼 주사 단계와 통신하는 것이 가능하게되므로 수지상 추적에 사용될 수있다.

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Disclosures

이 기사에 대한 출판 비용은 MBF 바이오 사이언스가 후원한다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Modified Golgi-cox staining solution  Weill Cornell Medical College NA store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x) Weill Cornell Medical College NA store at 4°C till use
30% Sucrose, Sigma CAS # 57-50-1 make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin Sigma CAS # 9000-70-8 NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) Sigma CAS 603-003-00-5 NA
Xylene Sigma CAS # 1330-20-7 NA
DPX Medium EMS  #13510 NA
Superfrost (+) white Electron Microscopy Sciences 71869-10 NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) VWR  #4811-703 NA
DCX Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-8066 4 C
DAB Sigma CAS Number 91-95-2   -20
OCT Tissue-tek 4583 NA
Tris Sigma CAS Number 77-86-1   NA
ABC Lite Vector PK4000 NA
Microscope Nikon Eclipse 80i
Digital Camera Nikon DS-Ri1
12 bit Camera  QImaging  01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System MBF Bioscience V.10
Image Composite Editor Microsoft 1.4.4.0
NIS Elements Nikon F 3.0
Image Pro Plus Mediacy Versin 7.00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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