Beoordeling van Dendritische arborization in de gyrus dentatus van de hippocampus regio in Muizen

1VA Palo Alto Health Care System, 2Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine, 3Department of Physical Therapy, Arkansas State University
Published 3/31/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Das, D., Phillips, C., Lin, B., Mojabi, F., Akif Baktir, M., Dang, V., et al. Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52371, doi:10.3791/52371 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Dynamische wijzigingen in het aantal en de structuur van synapsen zijn kenmerken van ontwikkeling, veroudering, en talrijke neurodegeneratieve aandoeningen 1-3. Het vermogen van neuronen synaptische ontvangen en integreren afhankelijk dendritische morfologie en dynamische veranderingen in synaptische verbindingen. Inderdaad bestaat er een positieve correlatie tussen dendritische wervelkolom en synaps nummer, die zowel van invloed cognitieve functie 4. Het is dus niet verwonderlijk dat afnames in dendritische wervelkolom nummer zijn geassocieerd met cognitieve dysfunctie bij een aantal neurologische aandoeningen 5-7, gevraagd grote belangstelling dendritische wervelkolom kwantificering. Toch is de kwantificering van de wervelkolom dichtheid blijft een tijdrovende en vervelende taak die niet aan nuttige informatie over de topografie en de verdeling van synapsen over de dendritische boom te genereren. Gelukkig kleuringsmethoden (bijv, Golgi-Cox en doublecortin (DCX)), in samenhangmet geavanceerde beeldvormende technieken kunnen worden gebruikt om bestaande barrières te overwinnen en produceren van hoge-resolutie afbeeldingen van dendritische arborization op een betrouwbare en snelle wijze. Terwijl Golgi-Cox kleuring methode kan worden ingezet om de toestand van dendritische arborization in alle neuronen 8 beoordelen, kan DCX worden ingezet om pasgeboren neuronen label name in de dentate gyrus en subventriculaire zone 9, een belangrijke overweging omdat neurogenese plaatsvindt in beide deze regio's over de hele levensduur 10,11.

Volgende kleuring werden twee beeldvormende methoden ingezet om dendritische kenmerken te beoordelen: i) real-time beeldvorming (RTI) en ii) uitgebreid scherptediepte imaging (EDFI). De RTI-techniek zorgt voor een gemiddelde op te sporen en te kwantificeren de lengte en volgorde van arborization langs de individuele dendritische segmenten en takken. Zo maakt het mogelijk om de oppervlakte en het volume ingenomen door elk dendritische structuur schatten. Meer specifically in de RTI werkwijze de gebruiker identificeert continu de segmenten en nieuwe focus iteratief de neuron vindende software verzamelt de x, y en z coördinaten van de dendritische structuur en reconstrueert het traject van de dendritische structuur 3D. Relatief, de EDFI methode biedt een vrij eenvoudige en versnelde middelen voor het beoordelen van dendritische dichtheid in plaats van dikke weefselmonsters door het genereren van een samengesteld beeld, het verstrekken van informatie over de totale z-as. Om dit te doen, de gebruiker registreert high definition video bestanden over de dikte van de sectie en vervolgens maakt gebruik van software om de videobeelden te zoeken om punten te identificeren waarin een pixel is geheel in focus. Vervolgens worden de gerichte pixels samengevoegd en geïntegreerd in een afbeelding composiet 2D hoge-resolutie,. Dit samengestelde beeld bevat alle pixels die in-focus waren, ongeacht hun positie in de z-as. Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van deze 2D-beelden kunnen vervolgens worden gebruikt om de dichtheid te bepalenvan dendritische vertakking in elk veld.

Tot slot presenteren we een panoramisch methode voor het genereren van extreem hoge-resolutie beelden voor de analyse en beoordeling van dendrieten in een hele regio van belang. Deze techniek kan worden ingezet om het gebrek aan toegang tot zeer hoge resolutie en dure digitale camera overwinnen. Met deze methode legt men serie beelden op verschillende locaties langs de x- en y-as en dan automatisch steken ze samen met een freeware (bijv Image Composite Editor). Met name kan deze methode worden gebruikt voor de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van dendritische arborization in een tamelijk groot gebied.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen die door de Commissie voor Animal Research aan het Veterans Affairs Palo Alto Health Care System goedgekeurd.

1. Golgi-Cox kleuring

  1. Brain-extractie en vlekken
    1. Op de 1ste dag diep verdoven muizen met 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg xylazine voor euthanasie via leegbloeden.
    2. Verwijder voorzichtig de calvarium en ontleden van de hersenen.
      1. Verwijder eerst de huid op de bovenkant van de schedel, het plaatsen van een gebogen schaar bovenop het cerebellum en voorzichtig doorsnijden de calvarium evenwijdig aan de centrale sulcus met de punt van de schaar naar buiten gericht, in de richting naar de olfactorische knobbel. Herhaal deze taak op beide zijden.
      2. Gebruik een chirurgische pincet om de calvarium tillen, terwijl het draaien in de richting van de olfactorische bollen en breek het af. Vervolgens draait u de schedel ondersteboven en gebruik een pick door de optiek te snijdenzenuwen en draai de hersenen. Gebruik tenslotte pick naar de hersenen scheiden van het ruggenmerg ter hoogte van het foramen magnum.
    3. Onmiddellijk dompel de hersenen in 15 ml van commercieel verkrijgbare, onverdund Golgi-Cox oplossing. Bewaar de hersenen Golgi oplossing in een afgedekte, 20 ml glazen fles bij kamertemperatuur in het donker.
    4. Op de 2e dag, langzaam giet de oplossing en te vervangen door 15 ml vers Golgi-Cox oplossing. Sluit de fles met de hersenen en laat ongestoord voor nog eens 9 dagen in het donker.
  2. Snijden en inbedding
    1. Op de 11e dag, plaats de hersenen in 30% sucrose-oplossing, bereid in DDH 2 O voor uitdroging. Wijzig de oplossing met vers bereide 30% sucrose na 12 uur. Incubeer de hersenen in 30% sucrose-oplossing gedurende 3 dagen bij 4 ° C.
    2. Op de 14e dag, vul het reservoir van de vibratome met een 30% sucrose oplossing totdat het mes is bedekt. Zet de snelheid op 1 mm / s met een amplitude van 0,95 mm.
    3. Dep de hersenen met een Kimwipe om overtollig vocht te verwijderen en verwijder het cerebellum met behulp van een scheermesje coronaalwaarts snijden.
    4. Stevig monteren van de hele hersenen op de vibratome platform met behulp van superlijm en laat het voor 2-4 minuten in te stellen. Plaats het platform met de gehechte hersenen in het reservoir en stel het mes naar de top van de hersenen.
    5. De vibratome Snijd de hersenen in 150 urn dikke secties bij kamertemperatuur herinneren om het mes te veranderen na elke 3 hersenen.
    6. Insnijding van het reservoir met een kleine tip borstel en dompel deze in een petrischaaltje met 0,3% gelatine in DDH 2 O. Terwijl de secties blijven in de petrischaal, voeg 0,5 ml 0,3% gelatine op elke dia en gebruik een borstel om de vacht van de SuperFrost + dia verspreiden en.
    7. Zachtjes halen de ondergedompeld secties van de petrischaal en leg ze op de ontsloten glijbanen. Oriënteren de hersenen secties doorraken ze alleen op hun kant en niet op de toppen.
    8. Na ongeveer tien minuten, de vacht van de secties met 30% sucrose voordat het weefsel volledig droogt. Dan is het bereid dia's in een donkere plaats lucht drogen in een dia rek voor 3 dagen.
    9. Verdunnen in de handel verkrijgbare 10x ontwikkelen oplossing voor 1x gebruik van DDH 2 O. Dompel de objectglaasjes in ontwikkeloplossing 7-10 min. Spoel de glaasjes 3 keer in DDH 2 O.
  3. Uitdroging
    1. Bereid 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% en 95% ethanoloplossingen met gedestilleerd DDH 2 O.
    2. Dompel de objectglaasjes in steeds hogere ethanol oplossingen gedurende 10 minuten elk.
    3. Dompel de objectglaasjes in 100% ethanol oplossing 3 maal gedurende 10 minuten elke keer.
    4. Week de dia's in 100% xyleen 3 opeenvolgende keer gedurende 5 minuten elk, het bijhouden van de secties in de uiteindelijke oplossing tot ze-cover gleed.
    5. Plaats een royale hoeveelheid DPX (Di-n-butylftalaat in xyleen) montage medium (about 1-1,5 ml) op elke dia met behulp van een plastic overdracht pipet. Plaats voorzichtig dekglaasjes om luchtbellen te voorkomen.
    6. Lucht drogen deksel gleed-hersensecties horizontaal voor 3 dagen.

2. doublecortin kleuring

  1. Diep verdoven (zie stap 1.1.1) de dieren.
  2. Voer cardiale perfusie met vers bereide 4% paraformaldehyde in fosfaatbuffer 12.
  3. Extraheer de hersenen (zie 1.1.2) en bewaar in 45 ml 4% paraformaldehyde bij 4 ° C geïncubeerd op een schommelende shaker
  4. Breng de hersenen tot 30% sucrose-oplossing en wacht volledige dehydratie gedurende 48 uur bij 4 ° C. Verwijder de hersenen uit sucrose en leg ze direct op koperen blokken geplaatst op droog ijs.
  5. Vul het blok met optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding en markeer de oriëntatie van de hersenen met behulp van de bulbus olfactorius als landmark.
  6. Met behulp van een cryostaat, gesneden 70 micron-dikke secties bij -20 ºC en plaats zein cryobeschermingsmiddeloplossing (25% ethyleenglycol, 25% glycerol, in 0,05 M natriumfosfaatbuffer, pH 7,4) en bewaar bij -20 ° C tot gebruik.
  7. Voeg een oplossing van 50% cryoprotectant en 50% methanol. Aan deze oplossing wordt 0,5% waterstofperoxide (vol / vol). Incubeer drijvende secties gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Warm secties 37 ° C in TBS (Tris-gebufferde zoutoplossing) gedurende 30-40 min door ze in een histologische oven.
  9. Incubeer de secties met 0,3% triton en 3% normaal paardenserum gedurende 45 min bij kamertemperatuur voorafgaand aan immunokleuring. Incubeer de secties bij 4 ° C overnacht in 3 ml oplossing van het DCX antilichaam 1: 500 verdund in TBS met 0,3% Triton en 1% normaal paardenserum.
  10. De volgende dag was de secties 3 keer achter elkaar in TBS (10 min elk).
  11. Incubeer secties met gebiotinyleerd paard anti-geit (1: 200 in TBS) gedurende twee uur bij kamertemperatuur geroerd. Was de secties 3 keer achter elkaar in TBS (10 min elk).
  12. Incubeer tboord met ABC Lite (1: 1.000) gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  13. Voeg 5 ul van 30% H 2 O 2 een tablet van 10 mg DAB (3,3 "-Diaminobenzidine) oplossing opgelost in 15 ml van 1 M Tris-HCl (pH 7,6). Incubeer de secties onmiddellijk in deze oplossing gedurende 5 min.
  14. Beëindig de reactie door wassen met ijskoude TBS driemaal, gevolgd door een wassen in TBS bij kamertemperatuur.
  15. Uitdrogen secties met behulp van een reeks van ethanol oplossingen (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 min elk), duidelijk in xyleen, en bedek vervolgens slip met behulp van DPX zoals in stap 1.3.

3. Visualisatie

  1. Na volledige droging van de secties, verwijder overtollig DPX op de top van de dia's met een scherp mes, en leg ze op de scan fase van de microscoop. Het systeem bestaat uit een microscoop uitgerust met scannende platform, joystick, en een kleur 12-bit camera.
  2. Start het programma. Open een nieuw bestand.
  3. Plaatseen referentiepunt op het scherm door te klikken met de muis op elke plaats. Dit zal alle pictogrammen van het instrument panel van programmavenster te activeren.
  4. Klik op het pictogram "Joystick gratis" op de werkbalk en gebruik dan de joystick om de dentate gyrus van de hippocampus vinden in het eerste deel.
  5. In het tabblad "Extra" van het programmavenster, selecteer "Serial Section Manager". Klik op het icoontje "Nieuwe sectie" op de linker benedenhoek van het venster. Dit zal het venster "Serial Sectie Setup" te openen.
  6. Selecteer de Serial venster Sectie Setup en voer vervolgens het totaal aantal secties die hippocampus regio's bevatten. Selecteer de evaluatie interval. Voer de sectie cut dikte (70 micrometer voor DCX en 150 pm voor Golgi-gekleurde coupes).
  7. Start het opsporen van de gyrus dentatus regio door te klikken op het pictogram "Freehand Contour Tekening" in de werkbalk. Schets de dentate granulaire cellaag. </ Li>
  8. Selecteer "100X" uit het menu "Vergroting". Voeg een druppel immersie olie op het onderdeel en schakel de doelstelling om 100X. Zoek de dentate korrel cellichamen en dendrieten kader van deze doelstelling.
  9. Focus op een geselecteerde neuron en klik op het icoon "Neuron Tracing" op de werkbalk. Teken de omtrek van de dentate korrel cel lichaam. Wanneer u klaar bent tracing, klik met de rechtermuisknop op "Finish Cell Body" te selecteren.
  10. Start het opsporen van de dendrieten handmatig in x, y en z-richtingen en volg elke tak met de joystick en de z-motor draaien. Bij een splitsing of trifurcation knooppunt, selecteert u de desbetreffende optie in het dropdown-menu op de rechtermuisknop klikken. Trace elk van de takken die voortvloeien uit deze knooppunten. Aan het eind van elke tak klik met de rechtermuisknop en selecteer "Ending" uit het dropdown menu.
  11. Met behulp van de pijltjestoets iconen in de software venster selecteert willekeurig ander dentate korrel cel en volgt u dezelfde procedure als described in stap 3,9-3,10. Sla het gehele tracing.
  12. Start de neuronale tracing software.
  13. Open de eerste NRX databestand van de eerste muis van de experimentele groep. Voeg de NRX-bestand van de tweede muis van de experimentele groep. Ga door tot alle NRX bestanden van deze groep worden toegevoegd.
  14. Selecteer op het tabblad Analysis "Fan In-diagram". Dit opent de ventilator in-analyse venster. Vinkje "dendrieten" en klik op Display, die de lengtes en vertakking patronen van dendrieten toont voor deze groep muizen (figuur 1).

4. EDFI

Opmerking: deze methode kan de gebruiker snel opnemen van een groot aantal beelden door de z-as van elk veld en het genereren van een 2D afbeelding die alle pixels gerichte gehele z-as bevat. Het resultaat zal een samengesteld beeld dat alle gerichte pixels van verzamelde beelden bevat zijn.

  1. Sluit de microscoop op een digitale camtijdperk. Plaats de secties voor het eerst op het scannen podium verbonden met de microscoop en dan overschakelen naar een 10X objectief. Verplaats het podium om het gebied van belang.
  2. Start een video-capturing programma.
  3. Druk op de opnameknop. Zodra de opnameknop drukt de macro scherpstelknop om van boven naar beneden van de sectie voor een totaal van 4 sec. Sla het resulterende videobestand.
  4. Gebruik ImageJ freeware om de AVI video bestanden te converteren naar een niet-gecomprimeerd formaat door het openen van het bestand en ze op te slaan in ongecomprimeerd bestandsformaat.
  5. Start een beeldanalyse programma en open het AVI-bestand. Ga naar het menu "Actie" en klik op "Extended Depth of Field". Selecteer het bijbehorende videobestand. In "Output" opties, selecteer "Genereer Composite Best-Focus Image".
  6. In "Focus Analysis" opties, selecteer "genormaliseerde Verlichting" en "Max Local Contrast" opties. Selecteer vervolgens "Creat ". Het resulterende beeld vertegenwoordigt alle gerichte pixels gehele z-as (figuur 2).
  7. Sla het resulterende beeld.

5. Het genereren van Extreem-beelden met hoge resolutie

OPMERKING: Deze methode kan de gebruiker automatisch genereren van lage vergroting en extreem hoge-resolutie beelden van sterk vergrotende-beelden met hoge resolutie op een geautomatiseerde manier.

  1. Plaats de eerste gedeelten van het scannende platform aangesloten op de microscoop. De microscoop is verbonden met een digitale camera. Verplaats het podium om het gebied van belang.
  2. Start een beeld acquisitie programma.
  3. Gebruik een 10X objectief en het verwerven en op te slaan met een hoge resolutie (4076 x 3116) beelden uit de regio van belang ervoor te zorgen dat ten minste 10% overlap hebben.
  4. Run Image Composite Editor om afbeeldingen te stikken.
  5. Ga naar het menu Bestand en klik op "New Panorama". Selecteer de map waarin de beelden zijn stORed. Selecteer de beelden die behoren tot dezelfde regio en druk op "ok".
  6. Druk op "Exporteren naar schijf" knop en sla de afbeelding op. Dit beeld vertegenwoordigt een extreem hoge-resolutie afbeelding van het gebied van belang dat kan worden gebruikt voor analyse en / of demonstratie (figuur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De omvang van arborization gevolg van bestaande en pasgeboren dentate granule cellen werd geanalyseerd wildtype muizen met behulp van Golgi-Cox of DCX kleuring (figuur 1). Dendritische segmenten van DCX-positieve cellen bleken 13-36 micrometer lang. De normale verdeling van dendritische lengte werd getest met Kolmogorov-Smirnov-test (D = 0,1217, p <0.01, Liliefors p <0,001; Figuren 4 en 5).

In de analyse van de lengte van de segmenten per bestelling van arborization, werden de langste segmenten in de eerste bestelling van arborization (38.38 + 1.45 pm). Vergelijkbare patronen werden gevonden voor het oppervlak (111,98 + 3,93 vierkante micron) en volume (27,93 + 1,03 kubieke micrometer). De lineaire correlatie tussen de lengte van segmenten en het oppervlak en / of volume ingenomen door deze segmenten werden ook getest. Beide oppervlak (p = 0.001, r2 = 0,873) en volume (p = 0.001, r2 = 0,621) csignificant orrelated met de lengte van elk dendritische segment.

Figuur 1
Figuur 1:. Hier Fan schema werd gebruikt om de dendritische lengte van dentale granule cellen in de hippocampus cijfer visualisatie tool kan worden gebruikt om de effecten van verschillende therapeutische interventies of genotypes op dendritische lengte vergelijken. De meeteenheden urn is.

Figuur 2
Figuur 2: Visualisatie van dendritische arborization zonder (A) en met EDFI (B) methoden. De traditionele methode om de beste focus vliegtuig vergeleken met EDFI (gegevens niet getoond) en vonden significant hogere waarden van dendritische regio via EDFI methode (p = 0,02). Schaalbalk= 100 urn.

Figuur 3
Figuur 3:. Een hoge-resolutie afbeelding van de hippocampus regio in een muis Deze afbeelding extreem hoge resolutie wordt automatisch opgebouwd uit stikken 10 (4076 x 3116) -pixel afbeeldingen. Schaal blote = 100 micrometer.

Figuur 4
Figuur 4:. De kwantificering van lengte en volume ingenomen door dendrieten in verschillende ordes van vertakking De maximale lengte en volume werden in de volgorde 1 bereikt.

Figuur 5
Figuur 5:. Histogram van dendritische lengte van dentale granule cellen De meeste dendritische segmenten DCX-gekleurd dendrieten waren 13-26 in lengte. De rode stippellijn geeft normale verdeling van de gepresenteerde gegevens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier werden twee methoden beschreven te kwantificeren van de omvang van dendritische arborization in volwassen en pasgeboren neuronen met behulp van conventionele kleuringsmethoden in combinatie met RTI en EDFI. De acquisitie van hoge resolutie beelden van neuronen biedt een zeer nuttige methode voor het testen van de schadelijke effecten van neurodegeneratieve aandoeningen en, op zijn beurt, een middel voor therapeutische strategieën die hippocampale neuronen doelsoorten.

Terwijl de RTI methode werd gebruikt om vangen grondig gegevens over de omvang van arborization en topografie, niet EDFI methode om informatie met betrekking tot de complexiteit van individuele segmenten of bomen zorgen. Niettemin, de voordelen van de EDFI werkwijze liggen in het feit dat het niet de aankoop van dure apparatuur vereist en minder tijdrovend.

Een beeldanalyse programma werd gebruikt om EDFI presteren in videobestanden. Die toegang hebben tot hoge resolutie en snellecamera maakt het verzamelen van een groot aantal beelden over de dikte van elk veld genereert beelden die de x, y en z dimensies echt vertegenwoordigen. Een nadeel van de EDFI werkwijze betrekking op het feit dat er meer dan één pixel (dezelfde x en y) zich in verschillende vlakken gehele z-as kan zijn. Een werkwijze wordt beoogd verschillende toewijzen aan deze pixels die precies de omvang van 3D profielen in 2D beelden. Opgemerkt zij dat de EDFI werkwijze ook kan worden gebruikt voor de analyse van cellulaire profielen (bijvoorbeeld synapsen, microglia en astrocyten). Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor het analyseren van de mate van microgliale verdeling door de dikte van een sectie 7. De twee methoden hier beschreven kan worden toegepast op complementaire wijze. Terwijl de RTI methode geeft nauwkeurige informatie over de topografie van vertakkende patroon, de EDFI geeft ons een vrij eenvoudige en versnelde methode om de dichtheid van dendrieten beoordelen in een gebied van inlangstelling. Met name de dikte van de profielen die kunnen worden verkregen met EDFI sterk variëren als het bereik van z focus op de microscoop podium in combinatie met het optische focus van de microscoop doelstellingen bepalen de grenzen van EDFI.

De hierin beschreven werkwijzen hebben het potentieel in meerdere contexten worden ingezet. In deze studie op voorwaarde dat we een middel om veranderingen in de dendritische arborization vooraf en na de interventie te evalueren, terwijl EDFI werd gebruikt om microglia activering 7 kwantificeren. Dus deze techniek is ontvankelijk voor elke toepassing waarbij het uiteindelijke doel is om bij kleine profielen die gevonden kunnen worden in meerdere lagen beoordelen.

Tenslotte kunnen deze technieken geen toegang overwinnen zeer hoge resolutie en dure digitale camera. In essentie is een methode over hoe om seriële beelden op verschillende punten van de locaties vast te leggen binnen een monster en vervolgens steek ze samen met behulp van een freeware, uiteindelijk yieldin getoondg hoge resolutie beelden op een wijze die veel betrouwbaarder en snel dan conventionele werkwijzen.

Kritische stappen

Golgi kleuring

De hoeveelheden Golgi en oplossingen worden op 4 ° C voor opslag en toch de kleuring en incubatie protocollen vereisen de oplossing te worden gebruikt bij kamertemperatuur. Koelen van het Golgi en ontwikkelen van oplossingen op ijs of in de koelkast negatief effect op de kwaliteit van de dendritische vlekken. Bovendien moet worden opgemerkt dat wij snelgroeiende Golgi oplossingen gebruikt. Hoewel de exacte samenstelling van het Golgi-Cox oplossing die in deze studie is merkgebonden, er meerdere bronnen die lijst gedetailleerd protocol dat kan worden gebruikt voor het uitvoeren van Golgi-Cox kleuring 13. Echter, zal het gebruik van andere Golgi-oplossingen aanzienlijk veranderen kleuring looptijden en wijzigingen voor deze stappen moet dienovereenkomstig worden gemaakt. Ook hebben we samen met anderen hebben onsed 150 pm dikke secties om DGC neuronen te analyseren 14,15 als het erover eens is dat het snijden van delen van deze dikte coronaalwaarts en parallel aan de dentate korrel cel arborizations minimaliseert het risico van het snijden van dendritische takken.

DCX vlekken

De DCX kleuringsprotocol vereist expliciet aandacht besteed aan de temperatuur. Als de oplossing tot 37 ° C verwarmen gedurende de voorincubatie- periode aanzienlijk afbreuk kleuring en leiden tot verlies van dendritische visualisatie. Bovendien is aandacht voor snijdikte gerechtvaardigd. In deze studie gebruikten we 70 micrometer dikke secties om de maximale omvang van DGCs dendritische arborization vangen. In onze ervaring, het gebruik van 0,3% triton is noodzakelijk omdat het aanzienlijk vergemakkelijkt penetratie van het antilichaam over de dikte van de zwevende gedeelten. Inderdaad, hebben eerdere studies gebruikt Triton te dringen 70 micrometer dik 16 of zelfs dikker (120 micrometer) 17delen als label DGC dendrieten. Zie Hussaini voor volledige details van DCX kleuring 18.

Tenslotte moet worden opgemerkt dat alternatieve open source programma (bijv flNeuronTool of Simple_Neurite_Tracer) bestaan ​​met de mogelijkheid om de beweging van de stand van x, y en z-richtingen opnemen. Dergelijke programma's kunnen worden gebruikt voor dendritische opsporen zolang zij in staat te communiceren met het scannende platform.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Publicatie vergoedingen voor dit artikel worden gesponsord door MBF Bioscience.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Modified Golgi-cox staining solution  Weill Cornell Medical College NA store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x) Weill Cornell Medical College NA store at 4°C till use
30% Sucrose, Sigma CAS # 57-50-1 make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin Sigma CAS # 9000-70-8 NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) Sigma CAS 603-003-00-5 NA
Xylene Sigma CAS # 1330-20-7 NA
DPX Medium EMS  #13510 NA
Superfrost (+) white Electron Microscopy Sciences 71869-10 NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) VWR  #4811-703 NA
DCX Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-8066 4 C
DAB Sigma CAS Number 91-95-2   -20
OCT Tissue-tek 4583 NA
Tris Sigma CAS Number 77-86-1   NA
ABC Lite Vector PK4000 NA
Microscope Nikon Eclipse 80i
Digital Camera Nikon DS-Ri1
12 bit Camera  QImaging  01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System MBF Bioscience V.10
Image Composite Editor Microsoft 1.4.4.0
NIS Elements Nikon F 3.0
Image Pro Plus Mediacy Versin 7.00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 22, (3), 383-388 (2012).
  2. Isaac, J. T. The synapse: center stage for many brain diseases. The Journal of Physiology. 587, (4), 727-729 (2009).
  3. Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. C. Synapses and Alzheimer’s disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. a005777 (2012).
  4. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
  5. Huttenlocher, P. R. Dendritic development in neocortex of children with mental defect and infantile spasms. Neurology. 24, (3), 203-210 (1974).
  6. Marin-Padilla, M. Double origin of the pericellular baskets of the pyramidal cells of the human motor cortex: a Golgi study. Brain Res. 38, (1), 1-12 (1972).
  7. Dang, V., et al. Formoterol, a long-acting β2 adrenergic agonist, improves cognitive function and promotes dendritic complexity in a mouse model of Down syndrome. Biol Psychiatry. 75, (3), 179-188 (2014).
  8. Dobrović, B., Curić, G., Petanjek, Z., Heffer, M. Dendritic morphology and spine density is not altered in motor cortex and dentate granular cells in mice lacking the ganglioside biosynthetic gene B4galnt1 A quantitative Golgi cox study. Coll Antropol. 35, (Suppl 1), 25-30 (2011).
  9. Dijkmans, T. F., van Hooijdonk, L. W., Fitzsimons, C. P., Vreugdenhil, E. The doublecortin gene family and disorders of neuronal structure. Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 10, (1), 32-46 (2010).
  10. Guerra, E., Pignatelli, J., Nieto-Estévez, V., Vicario-Abejón, C. Transcriptional regulation of olfactory bulb neurogenesis. Anat Rec. 296, (9), 1364-1382 (2013).
  11. Imayoshi, I., Shimojo, H., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Genetic visualization of notch signaling in mammalian neurogenesis. Cell Mol Life Sci. 70, (12), 2045-2057 (2013).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), 3564-3510 (2012).
  13. Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
  14. Juraska, J. M. Sex differences in developmental plasticity in the visual cortex and hippocampal dentate gyrus. Prog Brain Res. 61, 205-214 (1984).
  15. Gao, X., Deng, P., Zao, C. X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury causes acute dendritic and synaptic degeneration in the hippocampal dentate gyrus. PLoS One. 6, (9), e24566 (2011).
  16. Zhang, L., Hernández, V. S., Estrada, F. S., Luján, R. Hippocampal CA field neurogenesis after pilocarpine insult: The hippocampal fissure as a neurogenic niche. J Chem Neuroanat. 56, 45-57 (2014).
  17. Merz, K., Lie, D. C. Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice. PLoS One. 8, (5), e62693 (2013).
  18. Hussaini, S. M., et al. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. (78), (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats