Beoordeling van Dendritische arborization in de gyrus dentatus van de hippocampus regio in Muizen
Summary
We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.
Abstract
Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.
Introduction
Dynamische wijzigingen in het aantal en de structuur van synapsen zijn kenmerken van ontwikkeling, veroudering, en talrijke neurodegeneratieve aandoeningen 1-3. Het vermogen van neuronen synaptische ontvangen en integreren afhankelijk dendritische morfologie en dynamische veranderingen in synaptische verbindingen. Inderdaad bestaat er een positieve correlatie tussen dendritische wervelkolom en synaps nummer, die zowel van invloed cognitieve functie 4. Het is dus niet verwonderlijk dat afnames in dendritische wervelkolom nummer zijn geassocieerd met cognitieve dysfunctie bij een aantal neurologische aandoeningen 5-7, gevraagd grote belangstelling dendritische wervelkolom kwantificering. Toch is de kwantificering van de wervelkolom dichtheid blijft een tijdrovende en vervelende taak die niet aan nuttige informatie over de topografie en de verdeling van synapsen over de dendritische boom te genereren. Gelukkig kleuringsmethoden (bijv, Golgi-Cox en doublecortin (DCX)), in samenhangmet geavanceerde beeldvormende technieken kunnen worden gebruikt om bestaande barrières te overwinnen en produceren van hoge-resolutie afbeeldingen van dendritische arborization op een betrouwbare en snelle wijze. Terwijl Golgi-Cox kleuring methode kan worden ingezet om de toestand van dendritische arborization in alle neuronen 8 beoordelen, kan DCX worden ingezet om pasgeboren neuronen label name in de dentate gyrus en subventriculaire zone 9, een belangrijke overweging omdat neurogenese plaatsvindt in beide deze regio's over de hele levensduur 10,11.
Volgende kleuring werden twee beeldvormende methoden ingezet om dendritische kenmerken te beoordelen: i) real-time beeldvorming (RTI) en ii) uitgebreid scherptediepte imaging (EDFI). De RTI-techniek zorgt voor een gemiddelde op te sporen en te kwantificeren de lengte en volgorde van arborization langs de individuele dendritische segmenten en takken. Zo maakt het mogelijk om de oppervlakte en het volume ingenomen door elk dendritische structuur schatten. Meer specifically in de RTI werkwijze de gebruiker identificeert continu de segmenten en nieuwe focus iteratief de neuron vindende software verzamelt de x, y en z coördinaten van de dendritische structuur en reconstrueert het traject van de dendritische structuur 3D. Relatief, de EDFI methode biedt een vrij eenvoudige en versnelde middelen voor het beoordelen van dendritische dichtheid in plaats van dikke weefselmonsters door het genereren van een samengesteld beeld, het verstrekken van informatie over de totale z-as. Om dit te doen, de gebruiker registreert high definition video bestanden over de dikte van de sectie en vervolgens maakt gebruik van software om de videobeelden te zoeken om punten te identificeren waarin een pixel is geheel in focus. Vervolgens worden de gerichte pixels samengevoegd en geïntegreerd in een afbeelding composiet 2D hoge-resolutie,. Dit samengestelde beeld bevat alle pixels die in-focus waren, ongeacht hun positie in de z-as. Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van deze 2D-beelden kunnen vervolgens worden gebruikt om de dichtheid te bepalenvan dendritische vertakking in elk veld.
Tot slot presenteren we een panoramisch methode voor het genereren van extreem hoge-resolutie beelden voor de analyse en beoordeling van dendrieten in een hele regio van belang. Deze techniek kan worden ingezet om het gebrek aan toegang tot zeer hoge resolutie en dure digitale camera overwinnen. Met deze methode legt men serie beelden op verschillende locaties langs de x- en y-as en dan automatisch steken ze samen met een freeware (bijv Image Composite Editor). Met name kan deze methode worden gebruikt voor de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van dendritische arborization in een tamelijk groot gebied.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier werden twee methoden beschreven te kwantificeren van de omvang van dendritische arborization in volwassen en pasgeboren neuronen met behulp van conventionele kleuringsmethoden in combinatie met RTI en EDFI. De acquisitie van hoge resolutie beelden van neuronen biedt een zeer nuttige methode voor het testen van de schadelijke effecten van neurodegeneratieve aandoeningen en, op zijn beurt, een middel voor therapeutische strategieën die hippocampale neuronen doelsoorten.
Terwijl de RTI me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the LuMind Foundation, Research Down Syndrome, and the Alzheimer’s Association (AS). CP was partially supported by a faculty development grant from the College of Nursing and Health Professions at Arkansas State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modified Golgi-cox staining solution | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 1x Developing Solution (Stock 10x) | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 30% Sucrose, | Sigma | CAS # 57-50-1 | make fresh in ddH2O |
| 0.3% Gelatin | Sigma | CAS # 9000-70-8 | NA |
| Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) | Sigma | CAS 603-003-00-5 | NA |
| Xylene | Sigma | CAS # 1330-20-7 | NA |
| DPX Medium | EMS | #13510 | NA |
| Superfrost (+) white | Electron Microscopy Sciences | 71869-10 | NA |
| Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) | VWR | #4811-703 | NA |
| DCX Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8066 | 4 C |
| DAB | Sigma | CAS Number 91-95-2 | -20 |
| OCT | Tissue-tek | 4583 | NA |
| Tris | Sigma | CAS Number 77-86-1 | NA |
| ABC Lite | Vector | PK4000 | NA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Digital Camera | Nikon | DS-Ri1 | |
| 12 bit Camera | QImaging | 01 MBF2000RF-CLR-12 | |
| Neurolucida System | MBF Bioscience | V.10 | |
| Image Composite Editor | Microsoft | 1.4.4.0 | |
| NIS Elements | Nikon | F 3.0 | |
| Image Pro Plus | Mediacy | Versin 7.00 |
References
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 383-388 (2012).
- Isaac, J. T. The synapse: center stage for many brain diseases. The Journal of Physiology. 587 (4), 727-729 (2009).
- Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. C. Synapses and Alzheimer’s disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , a005777 (2012).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
- Huttenlocher, P. R. Dendritic development in neocortex of children with mental defect and infantile spasms. Neurology. 24 (3), 203-210 (1974).
- Marin-Padilla, M. Double origin of the pericellular baskets of the pyramidal cells of the human motor cortex: a Golgi study. Brain Res. 38 (1), 1-12 (1972).
- Dang, V., et al. Formoterol, a long-acting β2 adrenergic agonist, improves cognitive function and promotes dendritic complexity in a mouse model of Down syndrome. Biol Psychiatry. 75 (3), 179-188 (2014).
- Dobrović, B., Curić, G., Petanjek, Z., Heffer, M. Dendritic morphology and spine density is not altered in motor cortex and dentate granular cells in mice lacking the ganglioside biosynthetic gene B4galnt1 A quantitative Golgi cox study. Coll Antropol. 35 (Suppl 1), 25-30 (2011).
- Dijkmans, T. F., van Hooijdonk, L. W., Fitzsimons, C. P., Vreugdenhil, E. The doublecortin gene family and disorders of neuronal structure. Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 10 (1), 32-46 (2010).
- Guerra, E., Pignatelli, J., Nieto-Estévez, V., Vicario-Abejón, C. Transcriptional regulation of olfactory bulb neurogenesis. Anat Rec. 296 (9), 1364-1382 (2013).
- Imayoshi, I., Shimojo, H., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Genetic visualization of notch signaling in mammalian neurogenesis. Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2045-2057 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), 3564-3510 (2012).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Juraska, J. M. Sex differences in developmental plasticity in the visual cortex and hippocampal dentate gyrus. Prog Brain Res. 61, 205-214 (1984).
- Gao, X., Deng, P., Zao, C. X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury causes acute dendritic and synaptic degeneration in the hippocampal dentate gyrus. PLoS One. 6 (9), e24566 (2011).
- Zhang, L., Hernández, V. S., Estrada, F. S., Luján, R. Hippocampal CA field neurogenesis after pilocarpine insult: The hippocampal fissure as a neurogenic niche. J Chem Neuroanat. 56, 45-57 (2014).
- Merz, K., Lie, D. C. Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice. PLoS One. 8 (5), e62693 (2013).
- Hussaini, S. M., et al. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. (78), (2013).
