Ein Multi-Nachweistest für Malaria tragenden Mücken

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Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C. C., Malvick, J., Lanzaro, G. C. A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes. J. Vis. Exp. (96), e52385, doi:10.3791/52385 (2015).

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Abstract

Die Anopheles gambiae Artenkomplex umfasst die wichtigsten Malariatragenden Mücken in Afrika. Da diese Arten solcher medizinischer Bedeutung, werden mehrere Merkmale in der Regel mit Hilfe molekularer Tests in epidemiologischen Studien zu helfen aus. Diese Eigenschaften umfassen Artbestimmung, Insektizidresistenz, Parasiteninfektion Status und Wirtspräferenz. Seit Populationen der Anopheles gambiae komplexe morphologisch nicht zu unterscheiden ist eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) traditionell genutzt, um Arten zu identifizieren. Sobald die Arten bekannt ist, werden mehrere Downstream-Tests routinemäßig durchgeführt, um weitere Eigenschaften zu erklären. Zum Beispiel Mutationen KDR in einer para-Gen bekannt Resistenz gegen DDT und Pyrethroid-Insektiziden. Zusätzlich werden Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) oder Plasmodium Parasiten-DNA Nachweis-PCR-Assays verwendet werden, um in Moskito Geweben vorhandenen Parasiten erkennen. Schließlich a combination der PCR und Restriktionsenzym verdaut, kann verwendet werden, um Wirtspräferenz (zB menschliche vs. Tierblut) durch Screening der Moskitoblutmehl für Host-spezifische DNA aufzuklären. Wir haben eine Mehrnachweisassay (MDA), die alle der oben genannten Assays zu einer Zeit verbindet, in einer einzigen Multiplex-Reaktion Genotypisierung 33SNPs für 96 oder 384 Proben entwickelt. Da die MDA umfasst mehrere Marker für Arten, Plasmodium Erkennung und Gastgeber Blut Identifikation, wird die Wahrscheinlichkeit der Erzeugung von falschen Positiven oder Negativen stark von vorherigen Tests, die nur eine Markierung pro Merkmal sind reduziert. Diese robusten und einfachen Test kann diese Schlüsselmoskito Eigenschaften kostengünstig und in einem Bruchteil der Zeit bestehender Assays.

Introduction

Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii und Anopheles gambiae sind die wichtigsten Vektoren für Malaria-Übertragung in Afrika 1 verantwortlich. Diese drei Arten sind morphologisch nicht 2 und nur durch molekularen Assays 3-9 unterscheiden. Darüber hinaus gibt es viele Downstream-Tests routinemäßig durchgeführt, um epidemiologische und populationsgenetische Untersuchungen zu unterstützen. Diese umfassen (1) eine Genotypisierungsassay für Speziation Inseln 10-12, (2) eine Genotypisierungsassay Anerkennung nicht gleichbedeutend SNPs in der 1014 th Aminosäurecodon Position para-Gen (der Knock-down-Widerstand oder kdr, SNP) 13 -18, (3) Parasitenerkennung PCR 19-23, und (4) Screening von wirtsspezifischen DNA in Moskito midguts 24,25.

Wir entwickelten eine Mehrnachweisassay (MDA), die alle diese Assays in einer einzigen Multiplex-Reaktion mit dem Ziel, eine Kombinationalyzing epidemiologisch wichtige Eigenschaften der Malariavektoren in Afrika. Die MDA-Assay umfasst mehrere Marker zum Detektieren (1) Art (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii oder andere (keiner der drei)), (2), Insektizidresistenz in kdr SNPs dargestellt (beide L1014F und L1014S) , (3) auf zwei wesentliche Malaria-Parasiten, Plasmodium falciparum und P. vivax, und (4) Blutquelle von einem aviären und sechs Säugetierwirten.

Traditionell wurden diese Assays in separaten Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt. Wenn all diese Tests werden unter Verwendung einer herkömmlichen PCR-Plattform erfolgt, bedarf es der Durchführung 8-10 PCR-Assays und Begleit Gelelektrophorese Schritte. Jeder einzelne PCR-Reaktion von der Vorbereitung bis Dokumentation der Ergebnisse dauert 4-5 Stunden, während der hier vorgestellten MDA Verfahren dauert etwa 5 Stunden in der Gesamtheit. Dies entspricht einer 90% Einsparungen bei den Arbeitskosten allein. Der MDA präsentiert hier kostet $ 5pro Probe, um alle 33 SNPs Genotyp. Dies ist erheblich weniger teuer als die einzigen Agarosegel basierenden Assays, die ungefähr $ 1,50 pro Probe kostet. Assays Erkennen alle Merkmale durch die MDA abgedeckt würde ein Minimum von 8-10 verschiedenen Agarose-Gel-basierte Assays zu einem Preis von $ 15.12 pro Probe erforderlich. Darüber hinaus ist die MDA stark die Möglichkeit der Erzeugung eines falschen positiven oder negativen durch die Verwendung von mindestens drei Marker für jeden Parasiten oder Host Quellenerkennung reduziert.

Die Plattform verwendeten wir nicht an Malaria Vektoren beschränkt, sondern kann in einer Vielzahl von Anwendungen, wie der Medizin, Veterinärmedizin, und grundlegende Biologie 26-28 verwendet werden. Vertiefte Assoziationsstudien oder Populationsgenetik Studien mit einer großen (in der Reihenfolge der 100s) Anzahl der Proben erfordern kosteneffiziente Tests Screening für mehrere Marker gleichzeitig. Die meisten Studien, die zwei oder mehr getrennten PCR-Assays konnte MDA für schnellere Ergebnisse zu geringeren Kosten zu realisieren.

Protocol

1. PCR-Amplifikation

  1. Mischen Sie alle PCR-Primer (Siehe zusätzliche Tabelle S1) in einem 1,5 ml Mikroröhrchen. Jeder SNP hat zwei Primer (vorwärts und rückwärts). Sicherzustellen, dass der Stammkonzentration von jedem PCR-Primer wird bei 100 & mgr; M gehalten. Stellen Sie genug Primer Mix für 500-1.000 Reaktionen zur Verringerung Pipettieren Fehler und Zeit auf der Bank (siehe ergänzende Tabelle S2). Auf Wunsch bereiten Aliquots für 100 bis 200 Reaktionen pro Röhrchen und bei -20 ° C.
  2. Bereiten PCR-Cocktail nach dem Protokoll des Herstellers (Tabelle 1) beschrieben. Das Volumen für 96 Reaktionen enthält einen Überhang von 20%. Vortex die Röhrchen mit der PCR-Cocktail leicht und Zentrifuge für 30 Sekunden bei 2.000 x g.
  3. Verzichtet werden 3 ul der PCR-Cocktail in jede Vertiefung einer ohne Rahmen 96 Well-Platte. Ein Repeater-Pipette kann Zeit für diesen Prozess zu speichern.
  4. Add 2 ul der entsprechenden genomischen DNA von Moskitos in jede Vertiefung geben.
    HINWEIS: Prozess zur Gewinnung von genomischer DNA aus m osquito Gewebe (Head / Thorax, Abdomen oder Ganzkörper) wird in anderen Literaturen 29-32 beschrieben. Wählen Sie einen geeigneten DNA-Extraktionsprotokoll zu denen mit Plasmodium im Blut (Abdomen) von infektiösen Mücken (im Head / Thorax-Plasmodium) zu differenzieren. Wir verwenden in der Regel von Körperteilen (Head / Thorax oder Abdomen) Mücken extrahierten DNA, so dass DNA-Konzentration variiert von 0.05-2ng / ul. Obwohl die Gesamt-DNA-Eingang unter der Herstellerempfehlung (5-10ng / Reaktion) ist, wir in der Regel erhalten, robust SNP Anrufe von 98% der DNA-Proben ohne Amplifikation des gesamten Genoms.
  5. Verschließen Sie die Platte vorsichtig mischen oder vortexen und zentrifugieren Sie für 1 min bei 370 x g.
  6. Verwenden Sie die folgenden Thermocycler-Protokoll zur Durchführung von PCR-Amplifikation: (1) 94 ° C für 2 min, (2) 94 ° C für 30 Sekunden, (3) 56 ° C für 30 Sekunden, (4) 72 ° C für 1 min (5) Wiederholen der Stufe (2) - (4) für 45 Zyklen (6) 72 ° C für 1 min und 4 ° C gehalten.
_title "> 2. SAP-Behandlung

  1. Bereiten Sie die SAP Enzymlösung in einer Platte mit 96 Vertiefungen (siehe Tabelle 2). Prozess 96 Proben in einer Platte. Das Volumen für 96 Reaktionen enthält einen Überhang von 20%.
  2. Vortex die Röhre von SAP Enzymlösung leicht und Zentrifuge für 30 Sekunden bei 2.000 x g. Dispense 2 ul des SAP Enzymlösung in jedes Well. Auch hier kann ein Repeater-Pipette Zeit für diesen Prozess zu speichern.
  3. Verschließen Sie die Platte vorsichtig mischen oder vortexen und zentrifugieren Sie für 1 min bei 370 x g. Inkubieren der Platte wie folgt: (1) 37 ° C für 40 min, (2) 85 ° C für 5 Minuten, um das Enzym zu inaktivieren, (3) 4 ° C gehalten. Bei Beendigung dieser Stufe, speichern Sie die Platte bei -20 ° C, bevor Sie fortfahren. Verarbeiten Sie die gespeicherten Platte innerhalb von 2 Wochen.

3. SNP-Erweiterung

  1. Wenn die Probenplatte nach SAP Behandlung gefrieren, so ist es auf RT auftauen, bevor Sie fortfahren.
  2. Bereiten Sie die Verlängerungsprimer Mix (Supplemental Tabelle S2). Jeder SNP hat einen extension Primer. Bewahren Sie die Lager Konzentration jedes Verlängerungsprimer bei 500 uM. Optional aliquoten für 100 bis 200 Reaktionen pro Röhrchen und bei -20 ° C.
  3. Bereiten Verlängerungsmischung, wie in Tabelle 3 Reaktionsvolumen 96 enthält einen Überhang von 20% beschrieben.
  4. Vortex die Röhre der Erweiterung Cocktail leicht und Zentrifuge für 30 Sekunden bei 2.000 x g. Dispense 2 ul des Verlängerungs Cocktail in jede Vertiefung. Auch hier kann ein Repeater-Pipette Zeit für diesen Prozess zu speichern.
  5. Verschließen Sie die Platte vorsichtig mischen oder vortexen und zentrifugieren Sie für 1 min bei 370 x g. Thermozyklus der Platte wie in Abbildung 1 dargestellt. An diesem Punkt der Massenspektrometrie gehen oder lagern Sie die Platte bei -20 ° C bis zu 2 Wochen.

4. Auswertung der SNP-Verlängerungsprodukt zu Massenspektrometrie Analyse Optimieren

  1. Wenn die Probenplatte nach SNP-Erweiterung gefrieren, so ist es auf RT auftauen, bevor Sie fortfahren.
  2. Übertragen Sie 15 mg Harz von seiner container auf die Grübchen Platte mit einem langgestreckten Löffel. Verwenden Sie den Schaber, um Harz in die Vertiefungen der Vertiefung Platte verteilt. Fegen Sie den Schaber von der Seite, über die Noppenplatte her, um den Harz zu verbreiten. Vergewissern Sie sich, Harz in jedem Well.
  3. Kratzen Sie überschüssiges Harz aus der Vertiefung Platte mit dem Schaber. Lass das Harz stehen Grübchens Platte für mindestens 20 min. Während der Vermietung das Harz stehen in der Vertiefung Platte, fügen Sie 41 ul der HPLC-Wasser in jedes Well der Probenplatte.
  4. Legen Sie vorsichtig die Probenplatte auf den Kopf, auf den Grübchen Platte. Sicherstellen, dass die Probenplatte setzt gegen den kleinen runden Beitrag der Vertiefung Platte, die die Brunnen in der Probenplatte mit den Bohrungen in der Vertiefung Platte richtet.
  5. Halten der Probenplatte und die Grübchen Platte zusammen, sanft Flip sie über so das Harz fällt aus dem Vertiefungsplatte in die Vertiefungen der Probenplatte. Tippen Sie auf die Noppenplatte so das Harz fällt in die Probenplatte. Sicherstellen, dass alle das Harz in dem dimple Platte fällt aus auf die Probenplatte Brunnen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 3200 g für 30 Sek.
  6. Drehen Sie den Probenteller auf einem Rotator für 5 min bei RT. Rotator muss der Probenplatte um 360 ° um die Längsachse.
  7. Zentrifugieren Sie die Probe Platte bei 3200 xg für 5 min. Nach diesem Schritt speichern Sie die Probenplatte bei -20 ° C bis zu 2 Wochen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt.

5. MALDI-TOF-Massenspektrometrie

  1. Übertragen Sie die Anlage SNP Verlängerungsprodukt auf eine Bioarray wie SpectroCHIP nach Herstellerangaben. Wir verwenden Massarray Nanodispenser für diesen Schritt.
  2. Sobald die Übertragung abgeschlossen ist, festzulegen, wie Tests und Platten sind in der Testdatenbank eingerichtet werden. Nennen Sie den Test und Platten, so dass jede Platte eindeutige Kennung, die spezifischen Assay-Design (Supplemental Tabelle S3) verbindet.
  3. Nach dem Test und Platte festgelegt sind, zu erwerben Spektren mit einem Massenspektrometer.

  1. Führen Sie die Datenanalyse unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Analyse der Dateninterpretation Software wie Typer Analyzer oder TyperViewer (Sequenom). Erhalten von Daten in .xml-Format, die die Probe Layout Massenspektrogramm für jede Vertiefung enthält, die Marker-Informationen wie Name, erwartete Masse für jede Variante des entsprechenden SNP, und jeder Fehler oder Warnungen bei jeder Reaktion verbunden. Abbildung 2 zeigt die resultierende Massenspektrogramm.
  2. Durchführung SNP-Genotyp Clustering-Analyse durch Einstellen des Erfassungsschwellenwert (Größe oder Signal-Rausch-Verhältnis) und die Toleranz / Varianz für jeden Genotyp erlaubt, Fig. 3 zeigt ein Beispiel für ein 04707-KDR # 2 SNP-Genotyp Clustern.
  3. Exportieren Sie die resultierenden SNP-Genotyp Anrufe in ein Tabellenkalkulationsprogramm.

Representative Results

Artbestimmung:

Die folgenden 5 SNPs zusammen identifizieren drei Arten (A. arabiensis, A. coluzzii und A. gambiae) (Tabelle 4). Wenn eine Probe nicht einer der drei Arten, die drei SNPs (01.073-213, 04.679 bis 157 und 10.313 -052) nicht zu verstärken.

kdr Genotyp zur Ableitung Insektizidresistenz:

Die 1014 th Codon der para spannungsabhängigen Natriumkanals entspricht KDR. Zwei SNPs am 2. und 3. Basis der 1014 th Codon bestimmen die drei möglichen Aminosäuren. . Die möglichen Kombinationen der Genotypen sind in Tabelle 5 aufgeführt Diese SNP arbeitet für drei Arten von afrikanischen Malariavektoren: A. arabiensis, A. coluzzii und A. gambiae. Diese SNPs können nicht in A. verstärken darlingi, eine brasilianische Malaria Vektor. Das ist nichtüberraschend, da die mitochondriale Genomsequenz Ähnlichkeit zwischen A. darlingi und A. gambiae nur 88,9%, während das mitochondriale Genom Sequenzähnlichkeit zwischen drei African Malariavektoren sind über 98%. Andere Arten nicht getestet. Wir waren in der Verstärkung von Proben in Mali, Kamerun, Tansania und Sambia gesammelt erfolgreich.

Plasmodium Erkennung:

Sollen vollständige Plasmodium DNA in der Mücke Gewebe vorhanden ist, erwarten wir, P. erkennen falciparum oder P. vivax spezifischen DNA unter der DNA-Probe aus dem Moskito extrahiert. Die artspezifische SNPs wurden Sequenzalignments der Cytochrom-b-Sequenz von 123 P. identifizierten falciparum, 97 P. vivax, 11 S. malariae und 18 P. ovale isolieren Sequenzen aus Afrika auf Genbank. Wir haben 6 SNPs, die einzigartig SNP Genotypen herzustellen P. unterscheiden falciparum oder P. vi vax von anderen Plasmodium-Spezies (Tabelle 6). Wir haben diesen Test auf Moskito Proben in Mali, Kamerun, Tansania, Sambia und Brasilien gesammelt geprüft und bestätigt, dass diese besondere Gruppe von Markierungen arbeitet unabhängig von Mückenarten.

Blutmehl Erkennung PCR:

Cytochrom-b-Sequenzen von 7 Wirtsarten (Mensch, Huhn, Kuh, Hund, Ziege, Schwein und Schaf) aus Genbank gesammelt und Konsensus-Sequenzen erzeugt wurden. SNPs informativ für jeden Host wurden dann für die Genotypisierung ausgewählt. Wir testeten diese mit Blut Quellen aus 7 verschiedenen Tieren (Tabelle 7).

Da PCR-Fragmente sind kurz (80-120 bp), das funktioniert auf etwas verschlechtert DNA oder teilweise verdaute bloodmeals vor Mückengewebe. Die Wahrscheinlichkeit falsch positiver Anrufe stark durch mehrere Marker pro Hosttyp reduziert.

s "> Figur 1
Abbildung 1. Thermocycler-Programm für SNP Verlängerungsschritt. Die Amplifikationszyklus ist insgesamt 200 (5x40).

Abbildung 2
Abbildung 2. Messe-Spektrogramm für die MDA. Die X-Achse ist die Masse (Da) der SNP-Verlängerungsprodukte und die Y-Achse die Signalintensität. Die roten Linien zeigen den erwarteten Masse von Unincorporated Erweiterung Primer, SNP-Allel 1 und Allel 2 für den gewählten Marker. Graue Linien zeigen die zu erwartenden Massen anderer Marker in der MDA. Dieses Grundstück befindet sich aus der Datenanalyse-Software (Typer Typer Analyzer oder Viewer) aus der Ausgangsdatendatei nach dem Schritt 5 erzeugt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

e = "always"> Figur 3
Abbildung 3. Individuelle SNP-Genotyp Clusteransicht Die X-Achse ist die Arkustangens-Wert der Signalintensitäten der SNP-Allel 1 und SNP-Allel 2. Die Y-Achse ist die Größe der Genotyp Rufsignal (wie "Winkel" bezeichnet). Dieses Grundstück befindet sich in der Datenanalyse-Software (Typer Typer Analyzer oder Viewer) zur Verfügung gestellt. Etwaige besondere Daten können mit einem Klick auf eine Maustaste ausgewählt und ausgewählte Stichprobe Daten werden von Kreis angezeigt. Clustering-Analyse in den Software-Cluster bereitgestellt Genotypen mit einem benutzerdefinierten Varianzschwelle, und Farben drei Genotypen eines biallelen SNP. Beispiel hier gezeigten zeigt homozygot T (TT) Individuen als blaue Dreiecke, heterozygote (TA) als grüne Quadrate und homozygote A (AA) Einzelpersonen Orange umgekehrte Dreiecke. Rote Kreise stellen keine Aufforderung (keine Verstärkung).t = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Reagens Konzentration in 5 ul Volumen Volumen
(1 rxn) (96 rxns)
Wasser (HPLC-Qualität) N / A 0,8 & mgr; 92,2 & mgr;
10x PCR-Puffer mit 20 mM MgCl2 1x (2 mM MgCl 2) 0,5 ul 57,6 & mgr;
MgCl2 (25 mM) ** 2 mM 0,4 & mgr; 46,1 & mgr;
dNTP-Mix (jeweils 25 mM) *** 500 & mgr; M 0,1 & mgr; 11,5 & mgr;
Primergemisch (jeweils 500 nM) 100 nM 1,0 & mgr; 115,2 ul
PCR-Enzym (5 U / ul) 1,0 U / Reaktion 0,2 & mgr; 23,0 & mgr;
Gesamtvolumen: 3,0 & mgr; 345,6 ul

Tabelle 1. Multiplex PCR-Cocktail Rezept. Das Volumen jedes Reagenz für die PCR-Verlängerungsschritt für eine Reaktion und 96-Reaktionen mit einer 20% Überhang.

Gesamtvolumen
Reagens Volumen (1 rxn) Volume (96 rxn)
Wasser (HPLC-Qualität) 1,53 & mgr; 176,3 ul
SAP-Puffer (10x) 0,17 & mgr; 19,6 & mgr;
SAP-Enzym (1,7 U / ul) 0,30 & mgr; 34,6 & mgr;
2,00 & mgr; 230,4 ul

Tabelle 2. SAP Enzymlösung. Das Volumen jedes Reagenz zur Shrimp Alkaline Phosphatase-Behandlung für eine Reaktion und 96-Reaktionen mit einer 20% Überhang.

Reagens Conc. In 9 ul Volume (1rxn) Volume (96 rxns)
Wasser (HPLC-Qualität) N / A 0,6190 & mgr; 71,3 & mgr;
iPLEX Buffer Plus (10x) 0.222x 0,2000 & mgr; 23,0 & mgr;
iPLEX Termination Mix 1x 0,2000 & mgr; 23,0 & mgr;
Erweiterung Primer Mix 0,9400 & mgr; 108.3 ul
iPLEX Enzym 1x 0,0410 & mgr; 4,7 & mgr;
Gesamtvolumen 2,0000 & mgr; 230,4 ul

Tabelle 3. SNP Zusatzes Cocktail Das Volumen jedes Reagenz zur SNP Verlängerungsschritt für eine Reaktion und 96-Reaktionen mit einer 20% Überhang.

Tabelle 4
Tabelle 4. SNP Genotypen für jede Spezies. 28S IGS-540, 28S IGS-649 und 01.073 bis 213 sind auf dem X-Chromosom, 04.679-157 ist auf Chromosom 2 und 10.313 bis 052 ist auf Chromosom 3. Hybrid-Genotyp (heterozygot) wird gelb hervorgehoben. Feste Variante A. coluzzii ist hellblau und feste Variante A gekennzeichnet gambiae in dunklen markiertBlau.

Tabelle 5
Tabelle 5. SNP Genotypen für kdr. Zwei SNPs KDR # 1 und # 2 KDR stellen ein Genotyp für die 1.014 th Codon der para-Gen. Die erste Basis unveränderlich ist und ist daher nicht von dem Assay umfasst. Anfällig homozygote Genotypen sind blau markiert. Die widerstandsfähigsten L1014F homozygote Genotyp wird dunkelblau markiert. Gelbe Farbe zeigt heterozygot. Der L1014 S, zwischenbeständig Genotyp wird in orange angezeigt.

Tabelle 6
Tabelle 6. SNP Genotypen für P. falciparum und P. vivax Ong>. Insgesamt 6 SNPs verwendet werden, um das Vorhandensein von Malariaparasiten zu bestimmen. Pl-0041, Pl-1269 und Pl-1549 enthalten P. falciparum spezifischen Allele (G, T und T beziehungsweise). Gleichzeitige Amplifikation der drei Allele zeigt das Vorhandensein von relativ intakten P. falciparum DNA in DNA-Probe. Amplifikation alternativen Allele (A pL-0041 und PL-1269) zeigt das Vorhandensein von anderen Plasmodium-Arten (zB P. vivax, P. ovale und P. malariae) in der Probe. PF-1549 in Gebieten mit viel mehr P. befindet falciparum spezifischen flankierenden Regionen damit diese SNP wird nur noch verstärkt, wenn P. falciparum vorhanden. Pl-0071, Pl-1245 und Pl-0157 enthalten P. vivax bestimmte Allele (G, G und T beziehungsweise). Amplifikation alternativen Allele (A, A bzw. C) zeigt das Vorhandensein von anderen Plasmodium-DNA in der Probe. Nicht infizierte Mücken keine Verstärkung auf allen 6 Marker haben. Tabelle 7
Tabelle 7. SNP Genotypen für 7-Hosts:. Mensch, Huhn, Kuh, Hund, Ziege, Schwein und Schaf "NC" steht für "No Call" (keine Verstärkung) in der folgenden Tabelle. Beachten Sie, dass einige nicht-spezifische Amplifikation kann irgend loci auftreten, aber nicht für alle SNPs von einem bestimmten Host. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Discussion

- Flugzeit (MALDI-TOF) -Massenspektrometrie 33-37 PCR-Amplifikation shrimp alkalischer Phosphatase (SAP) Reaktion SNP Verlängerung Verlängerungsprodukt Anlage und Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisation: Das MDA ist aus fünf Hauptschritten zusammengesetzt. Die erste PCR-Amplifikation Schritt verstärkt DNA flankieren jedes SNP damit genügend Template-DNA wird an der SNP Verlängerungsschritt verfügbar. Der SAP-Reaktion neutralisiert ungenutzte dNTPs, die mit der folgenden SNP Verlängerungsschritt stören können. SNP-Erweiterung beinhaltet eine einzelne Verlängerungsprimer pro SNP Locus und massenmodifizierten Nukleotide Terminator. Das 3'-Ende modifizierten Nukleotiden verhindern nachfolgenden Nukleotide in die Verlängerungsprimer eingebaut. So ist die Masse der einzelnen Basis zeigt den Genotyp des entsprechenden SNP.

Der wichtigste Schritt für den Erfolg dieses Ansatzes ist eine gute Datenbestand bestehender Polymorphismen im Zielorganismuss. Wir haben gut charakterisierten SNPs zur Identifizierung von Arten (N> 900) 10,12,38-40 und kdr (N> 1000) 15,18. Die artspezifische SNPs für Plasmodium wurden aus Sequenz-Alignment der Cytochrom-B-Sequenzen von 123 P. identifizierten falciparum, 97 P. vivax, 11 S. malariae und 18 P. ovale isolieren Sequenzen aus Afrika, die auf Genbank zur Verfügung standen. Cytochrom-b-Sequenzen von 7 Wirtsarten (Mensch, Huhn, Kuh, Hund, Ziege, Schwein und Schaf) aus Genbank für hostspezifische SNP Identifizierung gesammelt. Basierend auf dieser großen Anzahl von Sequenzdaten, waren wir in der Lage, eine robuste diagnostischen Assay unter Verwendung eines Assays Designer Software entwerfen.

Die Anzahl der Markierungen jeder Reaktion aufnehmen kann durch die biochemische Kompatibilität der Zündmittelmischung bei einer Toleranz gegen Dimer Potential (0,9 0-1 Skala) -Primer bestimmt. Autoren verwendet den Standardwert (1; strengsten) für falsche Grundierung Potenzial. Relaxation dieses Parameters kann möglicherweise die Anzahl von SNPs, die in einer einzigen Reaktion zusätzlich getestet kann die SNPs in diese Studie einbezogen.

Die PCR-Amplifikation Schritte sind robust und in der Regel nicht Einstellung von der ersten Testaufbau benötigen. Der SNP Verlängerungsmischung (Tabelle 3) jedoch müssen Änderungen in relativen Mengen von jedem Primer unter Verwendung von Massenspektrometrie, um ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis wird für jeden Primer erreicht gewährleisten. Die zur Verfügung gestellten SNP Verlängerungsprimer Rezept ist das Ergebnis dieser Anpassungen. Kompatibilität zwischen Verlängerungsprimer kann die Gesamtzahl der SNPs, die Multiplex in einer einzigen Reaktion sein kann, zu begrenzen. Da das Reaktionsvolumen klein (5-8 ul), muss die Probenplatte richtig abgedichtet Verdunstung während Amplifikationsschritte verhindern.

Diese Plattform können gleichzeitig erzielen bis zu 35 SNPs pro Reaktion, während andere SNP-Genotypisierung Plattformen Unterkünfte könnene über tausend SNPs pro Reaktion 41. Mit den Fortschritten in der Genomsequenzierung Technologie kann man Millionen von SNPs mit der nächsten Generation Sequenzierung 29,42,43 erwerben. Die Technik, welche hier allerdings bietet eine ideale Anwendung für Studien, die Genotypisierung einer relativ kleinen Anzahl von Markern für viele (100s-1000e) Individuen erfordern. Weitere Diskussion der Entwurfsbeschränkungen der verschiedenen SNP-Genotypisierung Plattform in früheren Studien 41 bedeckt.

Die MDA ist zu charakterisieren epidemiologisch wichtige Merkmale der Malariavektoren ausgerichtet und bietet einen idealen Protokoll für mittleren Durchsatz SNP-Genotypisierung Tests analysieren Tausende von Mücken aus natürlichen Populationen gesammelt. Der MDA präsentiert hier bietet (1) über eine 90% ige Reduktion der Arbeitszeit, (2) eine 60% ige Reduktion Reagenzienkosten, und (3) Reduktion der False Positives / Negative durch die Verwendung mehrerer Marker. Der vorgeschlagene Test kann epidemiologische Studien durch zu verbessernstark erleichtert die Datenerfassung. Darüber hinaus kann es genomweiten Assoziationsstudien durch die Charakterisierung der Moskito Proben im Hinblick auf Bevölkerung Herkunft, Insektizidresistenz, Parasiten Suszeptibilität und Gastgeber Wahl zu verbessern. Schließlich kann diese MDA bieten Inspiration und eine Vorlage für die Gestaltung von anderen Multiplex-Assays mit einem MALDI-TOF-basierten SNP-Genotypisierung Plattform.

Acknowledgments

Wir danken Drs. Anthony Cornel und Laura Norris an der UC Davis und Dr. Katharina Kreppel an der Universität von Glasgow für die Bereitstellung von Moskito Proben aus Tansania. Wir danken Frau Smita Das und Dr. Douglas Norris von der Johns Hopkins School of Public Health für den Austausch von Moskito Proben aus Sambia. Wir danken auch Mr. Lee V. Millon an der Tierärztlichen Genetics Laboratory für das Training auf Assay-Design. Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Health gewähren R01AI 078.183 und R21AI062929.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.

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References

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