A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Ein bakterieller oraler Fütterungstest mit antibiotikabehandelten Moskitos
Chapters
Summary September 12th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dieser Artikel stellt ein Protokoll vor, um die Wirkung einzelner Mückendarmbakterien zu untersuchen, einschließlich Isolierung und Identifizierung von Mücken-Mittelgut-anbaufähigen Mikroben, Antibiotika-Erschöpfung von Mückendarmbakterien und Wiedereinführung einer bestimmten Bakterienart.
Transcript
Mosquito Midgut beherbergt eine komplexe Gemeinschaft von Mikroben, die den Wirtsstoffwechsel, Die Fortpflanzung, Fitness und Tierarztkompetenz beeinflussen. Mit jeder Darmmikrobe ist ein anderer Effekt. Dieses Video stellt das Verfahren vor, um die jeweilige Rolle jedes Bakterienstamms oder der Wirtsphysiologie zu untersuchen.
Um eine Kultur der Darmbakterienkolonien zu erwerben, sezieren Sie die Mücke Midgut unter sterilem Zustand. Erden Sie das Sezieren midgut, serotologinate, und über die Agarplatte verteilt. Wählen Sie einzelne Kolonien von der Platte und identifizieren Sie die Bakterienarten über ihre 16 SRNA-Gensequenz.
Füttern Sie die Mücken mit COD-Emboss, die Antibiotika für aufeinander folgende von drei Tagen enthalten, um Darmmikrobiota zu entfernen. Die Wirksamkeit der Antibiotika-Behandlung kann durch Sezieren des Mittelguts der aseptischen Mücke für Kolonien bildenden Einheit Assay vor den nachfolgenden Extremisten bestätigt werden. Dann wieder bestimmte Bakterienarten, die zuvor aus Demmückendarm durch orale Fütterung Assay isoliert.
Die Wirkung von Bakterien auf die Wirtsphysiologie könnte durch den Vergleich der unbehandelten Mücken, antibiotikabehandelten Mücken und der Wiedereinführung spezifischer Zurückhaltung bewertet werden. Mittelgut-Sektion und die kultivierte Bakterienisolierung. Zuerst sammeln Sie die Mücken im Käfig mit einem Aspirator und Zelle der Mücken in der Sammelbox.
Anästhesisieren Sie die Mücken, indem Sie eine Temperatur von 4 Grad für drei bis fünf Minuten unterwerfen. Halten Sie die Mücken anästhetisiert, indem Sie sie in eine eiskalte Petrischale legen. Desinfizieren Sie die Bank, sezieren Sie Mikroskop, und Zange durch Sprühen 75%Ethanol, um eine Kontamination durch Bakterien aus der Umwelt zu vermeiden.
Oberfläche sterilisieren die Mücke durch Verkleben und Schütteln in 75%Ethanol für drei Minuten und spülen zweimal mit PBS-Puffer. Bisect die Mücke separat auf einem sterilen Glasrutsche, die Ihren Tropfen PBS enthält. Entfernen Sie vorsichtig die Beine, Flügel und den Kopf der Mücke mit Zangen.
Klemmen Sie die Brust der Mücke und der letzte Abschnitt des Bauches war Zange und ziehen Sie auseinander, um den Verdauungstrakt zu isolieren. Verwenden Sie Zangen, um die Ernte und das Malpighian-Rohr aus dem Verdauungstrakt zu entfernen. Die Ernte wird am Pnterior des Mittelguts positioniert und wölbt sich nach der Einnahme von Zuckerwasser.
Malpighian Rohre sind Gruppe von schlanken Ausscheidungsrohren an der Kreuzung von Midgut und Hintergut. Das sezierte Make-up mit 200 Mikroliter sterilem PBS-Puffer in EP-Rohr geben und mit dem sterilmahlenden Pastor in die saubere Bank schleifen. Getreide, um die Homogenate auf drei Tempowahn bei 50 Mikroliter jeder Täuschung auf die LB-Agarplatte und verzweifelte Platte zu laden.
Inkubieren Sie die Platte ein bis zwei Tage lang als 37 Grad, bis einzelne Kolonien möglich sind. Wählen Sie einzelne Kolonien in einen 150 Milliliter konischen Kolben mit 50 Milliliter lb BHs Medium. schütteln Sie die Bakterien bei 37 Grad über Nacht.
Artenidentifikation. Extrahieren Sie TOTO DNA aus bakteriellem genomischem DNA-Bausatz und verstärken Sie 16 SRDNA per PCR. Rückgewinnung und Reinigung von DNA-Fragmenten aus PCR-Produkten durch Ambrose-Gel-Elektrophorese und das angetriebene Recovery-Kit.
Führte DNA-Sequenzierung an den gereinigten DNA-Fragmenten durch, um eine erreichte Bakterienkettensequenz zu haben. Führen Sie die Explosionssuche zu einer Abfrage der 16 SRNA-Gensequenz aus, in der die Bakterien gegen die Bakterien und die Archaeen und die Datenbank identifiziert werden. Die Identifikation auf Artenebene wurde als größer oder gleich 99%16 SRDNA-Sequenzähnlichkeit mit dem nächstgelegenen Teambankeintrag definiert.
Das Isolat wurde der entsprechenden Gattung 16 SRDNA-Sequenz zugeordnet, die Ähnlichkeit war weniger als 99% und größer als oder gleich 95% Antibiotika-Behandlung und Bakterium Wiedereinführung. wiegen Sie die erforderliche Menge an Saccharose Penicillin und Streptomycin, um uns 10%Saccharose-Lösung vorzubereiten, einschließlich des Ausprobierens von 20 Einheiten Penicillin und der 20 Mikrogramm Streptomycin pro Milliliter. Infiltrieren Sie die Baumwollkugeln in die Saccharoselösung, die Antibiotika enthält, und legen Sie sie über die Oberseite des Papierbechers, der Mücken enthält.
Bedecken Sie die Baumwollkugel mit einer 10 Zentimeter langen Petrischale, um zu verhindern, dass eine Uferpromenade verdunstet. Ersetzen Sie die Baumwollkugeln zweimal täglich und füttern Sie die Mücke für aufeinander folgenden von drei Tagen. Mücken werden in zwei Gruppen eingeteilt.
Die erste Gruppe wurde in einem Mückenbecher ohne Jede Behandlung platziert, jeder Baumwollkugeln Arzt mit 10%So Kreuz wurde täglich gegeben. Die zweite Gruppe wurde mit Antibiotika behandelt und diente drei Tage lang. In jeder Gruppe wurden Sergei Mücken seziert.
Die Mika wurde für die gesamte DNA-Extraktion extrahiert und die QPCR wurde mit universellen Bakterienprimern durchgeführt, Abbildung 1 zeigt die Expression von 16 SRNA in der Kontrollgruppe und Antibiotika-Behandlungsgruppe. Die Ergebnisse zeigen, dass die Kosten oder Realisierung von Penicillin und Streptomycin erfolgreich war. bakterielle Lösung vorzubereiten, misst eine Bakterienlösung im Virus mit einem Spektralphotometer, fügen Sie eine OT-Bakteriensuspension in EP-Röhre.
Zentrifugieren Sie die Suspension bei 5.000 CINCH für fünf Minuten bei vier Grad Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie die Bakterienpalette versucht mit sterilen PBS Puffer. Setzen Sie die Bakterienpalette mit 200 Mikroliter sterilen PBS-Puffer Wiederaufheben Fügen Sie 600 Mikroliter, 10% Saccharoselösung, 200 Mikroliter ATP und 200 Mikroliter bakterielle Suspension in ein neues AP-Rohr und mischen Sie gut. Alternativ können die Bakterien in DerHitze wieder suspendiert werden, um Ihr Blut zu aktivieren.
Vorbereitung der Erwärmung aktiviertes Blut. Gerinnsel frisches Blut mit Gerinnungsmittelröhre, nehmen Sie zwei bis drei Milliliter frisches Blut. Zentrifuge bei 1000 für 10 Minuten bei vier Grad, um Plasma und Blutzellen zu trennen.
Sammeln Sie das Plasma in eine neue EP-Röhre und aktivieren Sie hierin aktiviert bei einem 56 Grad für eine Stunde. Waschen Sie Blast House durch Ihre Zeit mit sterilem PBS-Puffer. Spülen Sie abgehängtes Strahlhaus mit heizaktiviertem Plasma.
Membran und Zuführsystem montieren. Ziehen Sie die Filmkrankheit auf das Maximum. fix mit dem Kunststoffring und Arbeitsplatz Parafilm, um zu vermeiden, dass das Leck langsam fügen Sie die vorbereitete bakterielle Lösung auf die Feeder-Einheit, um die maximale Brieftasche.
Um zu vermeiden, dass die Blase aus einer Richtung fiel und versiegeln Sie die Feedereinheit. Schließen Sie das Netzteil an. Warten Sie, bis die Temperatur 37 Grad erreicht Installiert die Feedereinheit mit Bakterienlösung auf dem Feeder installiert.
Vor der Fütterung von Bakterien Mücken sollten für 24 Stunden gestoppt werden, um Antibiotika zu verstoffwechseln. Für die Futtereinheit auf dem Papierbecher mit Mücken, dann erlauben Fütterung für 90 Minuten. Voll geförderte Mücken könnten für weitere Studien ausgewählt werden.
Repräsentative Ergebnisse. Abbildung zwei zeigt uns die durchschnittliche Auszeichnung pro Mücke. Nach der Fütterung von Antibiotika behandelt die Mücken sehen wir Meningosepticum.
Abbildung 3 zeigt die Expression einer Variante entwicklungsbezogenen Gene 24 Stunden nach der Blutmahlzeit, die das C-Meningoseptikum enthält. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die Eiproduktion der Kontrollgruppe und der Verblassengruppe nicht wesentlich verändert. Vielen Dank für Ihr Interesse an Bakterien oder einem Fütterungsaufsatz mit antibiotikabehandelten Mücken.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
