Generation af CAR T-celler til adoptiv terapi i forbindelse med glioblastom standard for pleje

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care. J. Vis. Exp. (96), e52397, doi:10.3791/52397 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Glioblastoma (GBM) er den mest almindelige primære maligne hjernetumor og er uvægerligt dødelig. Kirurgisk resektion kombineret med ikke-specifik standard pleje kemoterapi og strålebehandling ikke helt at eliminere maligne celler, hvilket resulterer i en trist prognose på mindre end 15 måneder hos patienter med denne sygdom 1. I modsætning hertil immunterapi tilbyder en præcis fremgangsmåde til specifikt at målrette tumorcellerne og således har potentiale til at tjene som en yderst effektiv behandling platform med reduceret risiko for sikkerhed toksicitet 2-4. T-celler manipuleret ex vivo til at udtrykke kimære antigen-receptorer (biler) tilbyder en alsidig strategi for tumor immunterapi. Biler er genereret ved sammensmeltning af det ekstracellulære variable region af et antistof med en eller flere intracellulære T-celle signalering molekyle (r), i stedet for en fuld-længde større histokompatibilitetskompleks (MHC) -begrænset T-cellereceptor 5. Denne tilstand af antistof-lignende antigen recognitipå tillader reaktive antigenspecifikke T-celler til at genkende og reagere på tumorantigener i fravær af MHC, og kan tilpasses til en praktisk talt uendelig antigen repertoire.

CAR T-celler manipuleret mod forskellige tumorantigener har vist præklinisk effektivitet og enestående løfte i klinikken 6-9. Specifikt i forbindelse med GBM, en målretning CAR T-celle platform epidermal vækstfaktor receptor variant III (EGFRvlll), en tumor-specifik mutation udtrykt på celleoverfladen 10, blev vist at forlænge overlevelsen i gliom-bærende mus 11. På trods af deres alsidighed, men den kliniske fordel af CAR adoptiv behandling er ikke blevet realiseret fuldt ud, dels på grund af tumor-associerede immunosuppression og immun unddragelse 12-16 samt udfordringer i at etablere og opretholde antigen-specifikke T-celler in vivo. Udnyttelse standardbehandling (SOC) med immunterapi potentielt kan overvinde flere af disse lefterligninger, hvilket resulterer i øget effektivitet i både den prækliniske og kliniske omgivelser.

SOC for post-resektion GBM består af højdosis temozolomid (TMZ), et DNA-alkyleringsmiddel 17, og hele hjernen bestråling (WBI) 1. Disse behandlinger formodes at virke synergistisk med tumorvacciner via opregulering af tumor MHC-ekspression 18-20 samt afgivelse af antigener ved døde tumorceller 17,19,21,22. Faktisk tilsætning af TMZ 20,23 eller WBI 18,24 fører til øget antitumorvirkning af immun-baserede behandlinger i prækliniske indstilling. Desuden, ligesom mange uspecifikke cytotoksiske kemoterapeutika, TMZ kendt for at forårsage systemisk lymfopeni 25,26, som kan udnyttes som et middel til host-conditioning til adoptiv terapi platforme 27-29. TMZ-medieret lymphodepletion har vist sig at forbedre frekvensen og funktion af antigen-specifikke T-celler, hvilket fører til forøget effektivitet af en vedtative terapi platform mod intrakranielle tumorer 30. I forbindelse med CAR terapi, lymphodepletion tjener som et middel til host-konditionering ved både at reducere antallet af endogene suppressor-T-celler 31 og inducere homeostatiske proliferation 32 via reduceret konkurrence om cytokiner 33 og dermed øge antitumoraktivitet 11,34. På grund af den synergistiske forhold mellem GBM SOC og immunterapi platforme, evaluere nye adoptivforældre behandlingsformer og vaccine-platforme i forbindelse med SOC er kritisk for udarbejdelsen meningsfulde konklusioner om effekten.

I denne protokol, vi skitsere en metode til generering og intravenøs administration af murine EGFRvlll-specifikke CAR T-celler sammen TMZ og WBI i mus med EGFRvIII-positive intrakranielle tumorer (se figur 1 for behandling tidslinje). Kort fortalt CAR T-celler fremstillet ex vivo ved retroviral transduktion. Humane embryoniske nyre (HEK) 293T celler transficeres under anvendelse af en DNA / lipid-komplekset (indeholdende CAR vektor og PCL-Eco plasmider) for at fremstille virus, der derefter anvendes til at transducere aktiverede murine splenocytter, der er høstet og dyrket i parallel. I løbet af CAR generation, er murine værter bærer EGFRvlll-positive intrakranielle tumorer indgives fraktioneret hel-hjerne røntgenbestråling og systemisk TMZ behandling ved doser svarende til klinisk SOC. CAR T-celler leveres derefter intravenøst ​​til lymphodepleted værter.

Følgende procedure er beskrevet i syv separate faser: (1) Indgivelse af temozolomid til tumorbærende mus, (2) hele hjernen Bestråling af tumorbærende mus, (3) transfektion (4) splenektomi og T-celle Preparation (5 ) transduktion, (6) CAR T-celle kultur og Harvest, og (7) CAR T-celle administration til tumorbærende mus. Disse faser består af flere trin, der strækker sig 6-7 dage og udføres samtidig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol er baseret på en eksperimentel design, hvor 10 mus behandles med 10 7 CAR T-celler hver. Det betyder, at der bliver brug 10 8 BIL T-celler; udbyttet skal være overvurderet med 5 x 10 7 -1 x 10 8 til grund for tab i levedygtighed. Følgende protokol er skaleret til at generere ca. 200 x 10 6 celler. Cellerne bliver derefter administreret intravenøst ​​til C57BL / 6-mus med ni dage etablerede syngene EGFRvlll-positive intrakranielle tumorer udviklet fra de eksisterende KR158B astrocytom eller B16 melanom-cellelinjer. Sideløbende med CAR T-celle generation er tumorbærende mus administreret klinisk relevante doser lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) og WBI (16,5 Gy).

Mus blev opretholdt og opdrættet under patogenfrie betingelser ved Duke University Medical Center (DUMC). Alle dyreforsøg blev udført ifølge protokoller godkendt af Duke University Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).

1. Administration af Temozolomide til tumorbærende mus

Dag 0 til 4:

  1. Beregn det samlede antal mus, der skal injiceres og multipliceres med 0,5 for at bestemme mængden af TMZ opløsning behov (f.eks 30 mus x 0,5 ml = 15 ml TMZ) og tilsæt 1,5 ml af denne mængde til at redegøre for spillover (16,5 ml TMZ ).
  2. Gang dette samlede mængde med 3 mg / ml for at bestemme vægten af frysetørret TMZ behov (f.eks 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). Afvejes dette i en 50 ml konisk.
    ADVARSEL: TMZ er giftig ved indånding, indtagelse og kontakt med øjne, hud, og slimhinder. Rådfør dig med institutionens sikkerhed og / eller miljø og sundhed og wellness afdeling for anbefalinger om at reducere risikoen for eksponering.
  3. Multiplicer den samlede mængde med 0,15 for at bestemme mængden af dimethylsulfoxid (DMSO) behov (f.eks 16.5 x0,15 = 2,475 ml DMSO). Filtersteriliser denne mængde af DMSO (plus yderligere 2 ml at tage højde for spill) gennem et 0,2 um filter til et sterilt rør. Tilføj 2,475 ml sterilt DMSO til TMZ pulver.
  4. Placer TMZ / DMSO-opløsning i et bægerglas med vand over en varmeplade ved 65 ° C i 10-15 min. Når TMZ er helt opløst, skal opløsningen være bleg gul farve; hvis opløsningen bliver pink, så TMZ nedbrydes, og en ny løsning skal være forberedt med en frisk masse TMZ.
  5. Beregn det passende volumen af ​​sterilt saltvand behov ved at gange 0,85 med det samlede volumen (0,85 x 16,5 ml = 14,025 ml saltvand). Der tilsættes 15 ml sterilt saltvand til en 50 ml konisk. Mens TMZ opløses i DMSO, varme saltvand til 65 ° C.
  6. Vortex TMZ / DMSO-opløsningen for at sikre, at TMZ pulveret er helt opløst og tilsættes langsomt opvarmet saltvand til TMZ / DMSO-opløsningen.
  7. Umiddelbart efter fremstilling, fuldt indlæse 15 x 1 ml tuberkulin Syringes med TMZ løsning til administration til 4 dage etablerede tumor bærende mus.
  8. Gentag denne procedure på dag 1 til 4 i alt fem TMZ administrationer.

2. Hele Brain Bestråling af tumorbærende mus

Dag 2 til 4:

  1. Tænd for røntgen strålerøret og lad den varme op til fuld spænding. Sørg for, at passende filter er på plads og indtast den korrekte spænding og aktuelle indstillinger (figur 2A).
    BEMÆRK: dosimetri af strålerøret bør fastlagt på forhånd at bestemme den passende spænding indstillinger og gitter layout (figur 2A, B).
  2. Beregn den tid, der er nødvendig for at resultere i 5,5 Gy røntgenbestråling. For eksempel, hvis X-stråler er leveret ved en hastighed på 2 Gy / min, derefter 2,75 min er nødvendig for at levere i alt 5,5 Gy. Indtast den passende tid varighed.
    BEMÆRK: Tabel 2 mus WBI doser ennd deres kliniske ækvivalenter i mennesker. I forbindelse med high-grade gliomer, 60 Gy fraktioneret WBI (2 Gy fraktioner, 5 dage / uge i 6 uger) er den kliniske standard for pleje, og det murine ækvivalent bruges her er 16,5 Gy (5,5 Gy x 3).
  3. Der fremstilles en frisk opløsning af ketamin / xylazin til systemisk anæstesi ved tilsætning af 2 ml ketamin og 1 ml xylazin til 17 ml saltvand, således at den endelige opløsning er 10 mg / ml ketamin og 1 mg / ml xylazin.
  4. Mus vejes og administrere 10 pi ketamin / xylazin intraperitonealt pr gram kropsvægt således, at dyr modtager en dosis af ketamin 100 mg / kg og 10 mg / kg xylazin. Mus skal være fuldt bedøvet og synligt vejrtrækning inden for 2 min af ketamin / xylazin administration.
  5. For at opretholde oftalmisk fugt i bedøvede dyr, gnide forsigtigt en lille mængde af kunstige tårer salve på hvert øje.
  6. Placer sederede mus på nettet, således at hovederne er placeret i det område, der modtager den højeste X-ray itensitet (figur 2B, C). Shield organer fra halsen og ned med passende størrelse bly rør til at blokere systemisk røntgen levering (figur 2D).
  7. Placer placeret mus under røntgenstrålen sådan, at laseren angiver omdrejningspunktet for X-ray stråle er i koordinat (0,0) på nettet layout. Begynd X-ray levering.
  8. Når X-ray levering er afsluttet, fjernes dyr fra strålerøret og sted på en varm varmepude. Må ikke hus sederede dyr med bevidste dyr, indtil dyrene har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystbenet recumbence. Når dyr kan opretholde brystbenet recumbence placere bevidste dyr tilbage i deres passende bure.
  9. Gentag denne procedure på dag 3 og 4 i alt tre fraktionerede doser af stråling.

3. Transfektion

Dag 1:

  1. Forbered D10 medier ved tilsætning af 50 ml føtalt bovint serum (FBS) til 500 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM).
  2. Forbered T-celle medium (TCM) ved tilsætning af 5,5 ml L-glutamin, 5,5 ml natriumpyruvat, 5,5 ml ikke-essentielle aminosyrer, og 5,5 ml penicillin / streptomycin (pen / strep) til 500 ml RPMI-1640-medier. Dernæst tilsættes 550 pi 2-mercaptoethanol og 550 pi gentamicin. Endelig tilsættes 50 ml FBS.
  3. Harvest in vitro dyrkede HEK293T celler og bringe til en koncentration på 7,5 x 10 6 celler / ml i D10 medier.
  4. Plade 10 ml D10 medier, og der tilsættes 1 ml HEK293T cellesuspension i hver af 16 x 10 cm poly-D-lysin (PDL) coatede plader.
  5. Inkuber natten over ved 37 ° C med 5% CO 2.

Dag 0:

  1. Erstat medier med 10 ml frisk D10 mindst 30 minutter før transfektion af celler.
  2. Bestem mængden af ​​vektorplasmidet, PCL-Eco vektor og liposomal transfektionsreagens kræves til transfektion ved at multiplicere det samlede antal plader + 1 (16 + 1 = 17) med 14,1 ugvektorplasmid (14,1 x 17 = 239,7 ug), 9,9 ug pCL-Eco vektor (9,9 x 17 = 168,3 ug), og 60 pi liposomal transfektion reagens (60 x 17 = 1.020 pi). Alle reagenser skal have stuetemperatur før forberedelse løsninger.
  3. Label to rør A og B. I røret A, tilsættes 239,7 ug vektorplasmid og 168,3 ug pCL-Eco vektor (1,5 x 17) ml reduceret serum modificerede Eagles medium (RS-MEM). I rør B, tilsættes 1020 pi liposomal transfektion reagens (1,5 x 17) ml RS-MEM.
  4. Inkuber A og B hver for sig i 5 minutter ved stuetemperatur.
  5. Bland A og B sammen forsigtigt (vortex for 1-2 sekunder eller invertere flere gange) og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur til dannelse af lipid / DNA-kompleks.
  6. Tilføj lipid / DNA-kompleks drop klogt at HEK293T celler i 10 cm skål.
  7. Der inkuberes ved 37 ° C i 6-8 timer eller natten over (ikke overstiger 24 timer).
  8. Efter 6-8 timers inkubation udskiftes mediet med 12 ml frisk TCM for virusproduktion. Dette belagte mediervil blive anvendt på dag 2 som viral supernatant for T-celle transduktion.

4. splenektomi og T-celle Forberedelse

Dag 0:

  1. Hæld 10 ml af TCM i en 50 ml konisk og sted på is i milt samling.
  2. Sacrifice passende antal dyr af CO 2 kvælning og sekundær halshugning: sted dyr i et bur modtager CO2 ved en strømningshastighed på 10-30% bur volumen / minut pr American Veterinary Medical Association retningslinjer (ikke mere end 5 dyr kan være ofrede samtidigt) indtil åndedræt ophører og i to minutter derefter. Fjern dyr fra CO 2 kammer og halshugge.
    BEMÆRK: En milt af en 6-12 uger gamle kvindelige C57BL / 6 mus vil give cirka 4,5-5 x 10 7 splenocytter. Her vil 4 milten høstes ca. 200 x 10 6 celler.
  3. Læg musen, således at dets højre side vender opad, ogspray med 70% ethanol. Med pincet, snup en tynd hudfold under venstre brystkassen og skære en lille indsnit med en saks. Skræl tilbage huden forsigtigt fat i en tynd fold i bughinden med pincet, og skære en lille hulrum.
  4. Milten er et lille, aflangt, mørkerød organ, der ligner en fladtrykt bønne; fint fat milten med pincet og punktafgifter ved at skære væk det omgivende bindevæv. Placer udskårne milte i den koniske indeholdende 10 ml TCM på is.
  5. Hæld milte over en 70 um mesh cellefilter og disaggregere ved mæskning med den stumpe ende af indersiden af ​​en 5 ml sprøjte til at generere en enkelt-celle-suspension. Højst to milt bør opdeles pr mesh si.
  6. Brug en lille mængde af TCM til omhyggeligt vaske sien efter opdeling til at indsamle de resterende splenocytter. Pool alle disaggregerede milt i en enkelt-celle suspension. Bring endelige volumen til 50 ml med TCM for en vask end spinde ved 300 xg i 10 min.
  7. Forbered en opløsning af 1x lysebuffer ved tilsætning af 5 ml 10x lysispuffer til 45 ml sterilt vand. For at eliminere røde blodlegemer, resuspender pellet i 5 ml 1X lysis buffer per milt i en 50 ml konisk, blande godt ved forsigtigt at pipettere op og ned. Hvis mere end 5 milt, bruge en 250 ml centrifugeglas. Placer konisk eller centrifugeglas i et 37 ° C vandbad i 5 minutter.
  8. Fjern lysis reaktion fra vandbadet og tilføje TCM ved en 1: 1-forhold med lysisbuffer at neutralisere reaktionen. Vask ved centrifugering ved 300 xg i 10 min.
  9. Aspirer supernatanten og fuldt resuspender pellet i TCM (2 ml / milt, 8 ml i alt for 4 milte) ved at pipettere op og ned.
  10. Tæl cellerne ved tilsætning af 10 pi af cellesuspensionen til 190 pi trypanblåt (1:20 fortynding). Multiplicer fremstillet i et af de fire kvadratnet kvadrater med 20 x 10 4 x totalvolumen (8 ml) for at opnå det samlede celleantal (f.eks 125 celler x 20 x 10 4 6 splenocytter).
  11. Fortyndes cellerne til en koncentration på 2 x 10 6 celler / ml i TCM, suppleret med 2 ug / ml concanavalin A (ConA) og 50 IU / ml rekombinant human interleukin-2 (rhIL-2). Således 200 x 10 6 splenocytter, tilsættes 92 ml medier til 8 ml celler, 200 ug ConA og 5.000 IU rhIL-2.
  12. Tilsættes 2 ml celler til hver brønd i 24-brønds vævs-kultur behandlede plader, således at 4 x 10 6 celler i hver brønd (fx vil 100 ml celler kræver ca. 4 plader).
  13. Inkuber natten over ved 37 ° C med 5% CO 2.

5. Transduktion

Dag 1:

  1. Beregn antallet af ikke-vævskulturbehandlede plader med 24 brønde, der er nødvendige for transduktion ved at gange antallet af milt høstet med 2 (der er behov for 8 plader til 4 milt).
  2. Dernæst beregner den nødvendige mængde af rekombinant humant fibronectin fragment (RHFF) opløsningnødvendigt at overtrække plader ved at multiplicere (samlede antal brønde + 3) x 0,5 ml (8 plader x 24 brønde = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml.
  3. Forbered 97,5 ml phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende RHFF i en koncentration på 25 ug / ml ved at multiplicere det totale volumen af ​​25 ug (97,5 x 25 = 2437,5 ug). Tilføj denne mængde RHFF til 97,5 ml PBS.
  4. Coat ikke-vævskulturbehandlede plader med 24 brønde ved tilsætning af 0,5 ml PBS / RHFF opløsning per brønd.
  5. Inkuber natten over ved 4 ° C.

Dag 2:

  1. Dump PBS / RHFF opløsning fra ikke-vævskulturbehandlede plader med 24 brønde.
  2. Tilsæt 1 ml / brønd 2% bovint serumalbumin (BSA) i PBS og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter.
  3. Fjern BSA ved fast upending plade. Vask ved at tilsætte 2 ml PBS.
  4. Saml viral supernatant ved at overføre medier fra hver HEK293T PDL plade i en 250 ml centrifugeglas og spin 10 minutter ved 500 x g.
  5. Overføre forsigtigt viral supernatant i en frisk 250 ml centrifugeglas, som er sikker på ikke at forstyrre cellepelleten, der kan have dannet.
  6. Tilføj frisk TCM til den virale supernatant, således at det endelige volumen er 3 ml mere end den nødvendige mængde for RHFF-coatede brønde. For eksempel, for 192 RHFF-coatede brønde, bringe mængden af ​​viral supernatant til 192 + 3 ml = 195 ml.
  7. Fjern dyrkede splenocytter fra inkubatoren og resuspender ved forsigtigt at pipettere op og ned 2 - 3 gange i hver brønd. Overføres til en 250 ml konisk. Hvis du bruger en multikanalpipette ved hjælp af en steril reservoir før overførsel vil hjælpe fremskynde dette trin. Tæl som tidligere beskrevet og centrifugering ved 300 xg i 10 min.
  8. Tilføj rhIL-2 viral supernatant i en koncentration på 50 IU / ml. For eksempel tilsættes 50 x 195 = 9.750 IU rhlL-2-195 ml viral supernatant.
  9. Resuspender splenocytter i viral supernatant på 1 x 10 6 celler / ml
  10. Tilsæt 1 ml / brønd af splenocyt suspensionen RHFF-coatede 24-brønds plader.
  11. Spin i 90 minutter i henhold til de følgende indstillinger: 770 xg, acceleration = 4, bremse / deceleration = 0, 32 ° C.
  12. Forbered en TCM løsning med 50 IE / ml rhIL-2. For eksempel fremstilles en 200 TCM ved tilsætning 10.000 IE rhlL-2. Der tilsættes 1 ml rhIL-2 / TCM til hver brønd efter centrifugering.
  13. Kultur natten over ved 37 ° C i 5% CO 2.

6. CAR T-celle Kultur og Harvest

Dag 3 og 4:

  1. Hvis T-celler opnår> 80% konfluens, kan celler deles (dette sker normalt ved dag 3 eller dag 4). Du opdeler celler, forsigtigt pipetteres op og ned i hver brønd 2-3 gange, og flytte 1 ml fra hver brønd i nye brønde i en frisk 24-godt cellekultur behandlet plade. Derefter tilsættes 1 ml frisk TCM med 50 IU / ml IL-2 til hver brønd, således at den endelige volumen er 2 ml i alle brønde.
  2. Hvis celler ikke nå> 80% konfluens, udføre en halv medier ændring ved langsomt pipettering fra 1 ml medier fra toppen af ​​hver brønd. Undgå disturbing celler afviklet på bunden, mens du fjerner medier. Der tilsættes 1 ml frisk TCM indeholdende 50 IU / ml rhlL-2.

Dag 5:

  1. Resuspender CAR T-celler ved forsigtigt at pipettere op og ned 3 gange i hver brønd og overføres til en 250 ml centrifugeglas. Spin celler ved 300 xg i 10 min.
  2. Helt aspirer supernatant uden at forstyrre pellet. Vask en gang med PBS, tælle celler som tidligere beskrevet, og vask med PBS anden gang. En typisk CAR T-celle Udbyttet er ca. 1 x 10 6 celler per brønd (8 plader x 24 brønde = 192 x 10 6 CAR T-celler).
  3. Resuspender celler i PBS ved en koncentration på 5 x 10 7 / ml for en injektion af 1 x 10 7 i et volumen på 200 ug (fx 192 x 10 6 CAR T-celler, resuspender vaskede pellet i 3,84 ml PBS).

7. CAR T-celle Administration til tumorbærende mus

Dag 5:

  1. TranspoRT-celler på is for dyrs facilitet til intravenøs injektion. Load 500-1.000 pi i insulinsprøjte med 27-31 G nål, der sikrer, at alle bobler er bortvist.
  2. Snup en mus ved haleroden og sted i røret harpiksstopperen.
  3. Træk halen stram med vene opad og glide nålen ca. 1-2 mm under huden i en vene ved at indsætte den parallelt med halevenen. Langsomt udvise 200 pi ind i venen. Hvis nålen er korrekt indsat i venen, vil lydstyrken nemt flow i; ellers vil der være modstand, og nålen bliver nødt til at blive fjernet fra halen og igen indsat korrekt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CAR T-celler dannes ved transduktion med EGFRvlll CAR retrovirusvektor 11. Denne vektor, MSGV1, blev udviklet fra SFGtcLuc_ITE4 vektor 35, som indeholder den murine stamcelle virus (MSCV) lange terminale gentagelser, den udvidede gag regionen og kuvert splejsningssted (splejsningsdonor, SD, og splejsningsacceptor, SA), og viral emballage signal (ψ). Den EGFRvlll CAR indeholdende det humane anti-EGFRvlll variable fragment enkelt kæde (scFv) 139, i takt med murine CD8TM, CD28, 4-1BB og CD3ζ intracellulære regioner blev klonet ind i den retrovirale vektor nedstrøms Ncol-stedet (figur 3) .

Efter transduktion kan CAR T-celler kvantificeres og fænotypebestemt ved hjælp af flowcytometri. EGFRvlll CAR T-celler kan visualiseres med en 2-farve panel består af et streptavidin-phycoerythrin (SA / PE) -konjugeret biotynlated EGFRvlll afledt multimer og anti-CD3 FITC. Brug af kultur og transduktion protocols beskrevet her, vi rutinemæssigt observere CAR udtryk blandt 55-70% af murine splenocytter (figur 4A) 11. Alternativt kan biler, også blive farvet for ekspression under anvendelse af gede-anti-human F (ab ') 2-biotin primære og SA / PE sekundære antistoffer, som er tidligere blevet beskrevet 36. CAR-T-celler kan yderligere fænotypebestemt ved tilsætning af andre fluorescensmærkede antistoffer til tofarvet CAR panel. For eksempel farvning for CD8 og CD4 viser, at 70% af transducerede biler er CD8 + T-celler, mens 20% er CD4 + T-celler (figur 4B). CAR-T-celler med dette udtryk profil har vist sig at let trafik til hjernen og behandle intrakranielle tumorer.

Tabel 1:. Temozolomid dosis baseret på animalsk vægt Temozolomide doser blev beregnet ud fra en samlet dosis på 60 mg / kg.

Legemsvægt Volumen
25 g 0,50 ml
0,48 ml
23 g 0,46 ml
22 g 0,44 ml
21 g 0,42 ml
20 g 0,40 ml
19 g 0,38 ml
18 g 0,36 ml
17 g 0,34 ml
16 g 0,32 ml
15 g 0,30 ml
14 g 0,28 ml
13 g 0,26 ml
12 g 0,24 ml
11 g 0,22 ml
D d # Brøker BED SOC
16,5 5.5 3 62 GBM
14 7 2 63 GBM
20 4 5 60 GBM
12 6 2 48 LGA
16 4 4 48 LGA
21 3 7 52,5 LGA
12 3 4 30 Met
16 2 8 32 Met

Tabel 2:. Klinisk relevante strålingsdoser biologisk ækvivalente stråledoser blev beregnet efter BED = D [1+ d / (α / β)], hvor D = total dosis, d = fraktioneret dosis, og α / β = 2). Den totale dosis indgivet som WBI til murine vært er vist i form af the fraktioneret doser leveret, og den humane dosis, der er modelleret af disse dosis fraktioner. For model formål er malignitet, som sengen er standard for pleje også vist.

Figur 1
Figur 1:. Tidsfrist for behandling af tumor-bærende mus og samtidig ex vivo CAR generation standard for pleje kemoterapi og hele hjernen bestråling begynder 4 dage efter tumorimplantation (A). Under dette tidsinterval er CAR T-celler genereret og dyrkes ex vivo (B) og leveret efter en komplet vært condition.

Figur 2
Figur 2: Layout og indstillinger for stråling levering.X-stråler er leveret i henhold til en dosimetri af 320 kV og 10 mA, med en variabel varighed vælges i overensstemmelse med den ønskede dosis (A). Omdrejningspunktet område røntgenstråling er en smal 2.5 cm område. Bedøvet dyr er anbragt i henhold til nettet (B), således at deres hoveder ligger i området højeste X-ray intensitet (C) viser udsigten fra den ene ende af X-ray beam. Ca. 4 dyr kan være under strålerøret under en løbet af X-ray administration ifølge denne gitterlayout (B, D). Bly slange bruges til at beskytte kroppen, så kun deres hoveder udsættes for WBI (D).

Figur 3
Figur 3: Det modificerede SFGtcLuc_ITE4 retroviral vektor, MSGV1 blev anvendt til transduktion og generering af CAR T-celler.EGFRvlll CAR insert indeholdende det humane anti-EGFRvlll variable fragment med enkelt kæde (scFv) 139, i takt med murine CD8TM, CD28, 4-1BB og CD3ζ intracellulære regioner, er flankeret af murine stamceller virus (MSCV) lange terminale gentagelser (LTR ). Opstrøms for CAR insert er den udvidede gag regionen og kuvert splejsningssted (splejsningsdonor, SD, og ​​splejsningsacceptor, SA), og viral pakning signal (ψ).

Figur 4
Figur 4: EGFRvlll biler udtrykkes på overfladen af T-celler 48 timer efter transduktion, blev T-cellerne farvet for overfladeekspression af EGFRvlll biler, der benytter en multimer sammensat af LEEKKGNYVVTDHC-K (biotin) -NH2 / streptavidin-PE.. Utransducerede T-celler fra den samme donor blev også farvet som en negativ kontrol. Dataene viser antallet af CAR T-celler (y-akse) positive for stalingen af PE-konjugeret EGFRvlll multimer (x-aksen), gated på CD3 + celler som en T-celle-markør, hvor ekspression blev fundet at være 60,9% (A). CAR T-celler farvet for CD4-PerCP-Cy5.5 og CD8-APC viser en ekspressionsprofil af 21,7% og 70,9%, henholdsvis (B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Behandlingen tidslinje beskrives her var designet til at modellere klinisk standard for pleje og udnytte dens virkninger for CAR adoptiv terapi. CAR T-celle doser TMZ regimer og strålebehandling indgivelse kan modificeres til at forøge in vivo T-celle-aktivitet, lymphodepletion og tumordrab. TMZ regimer kan øges til opnåelse vært myeloablation og øget udvidelse af adoptivt overførte celler 30. Endvidere kan lymphodepletive virkninger af TMZ blive sammenfattet af lav-dosis (4 - 6 Gy) single-fraktion kroppens samlede bestråling (TBI), således omgår de tumordræbende egenskaber SOC. Strålingen regime anvendes her efterligner en biologisk ækvivalent dosis på 60 Gy; Imidlertid kan antallet af fraktioner og fraktionerede doser indstilles til at efterligne andre kliniske doser (tabel 2). Vigtigt er det, vores model for SOC udnytter biologisk ækvivalente doser WBI, snarere end ekstern strålebehandling leveret fokalt til tumoren og margins, som ofte anvendes i klinikken, og således kan føre til en mindre dosis af stråling leveret til tumoren og en øget risiko for toksicitet til sunde musehjerne. På trods af disse begrænsninger dog WBI er en accepteret teknik til modellering klinisk strålebehandling i en præklinisk indstilling.

CAR T-celle doser kan øges eller mindskes for at observere dosis effekter på tumor drab og samlet overlevelse 11. Derudover kan timingen af ​​behandlingen og indgivelsesvej modificeres for at se forskelle i effektivitet. For eksempel kan CAR T-celler blive leveret intrakranialt at sikre aktivitet på tumorstedet. Udbyttet af CAR-positive T-celler kan variere afhængigt af effektiviteten af ​​transduktion. En måde at sikre en vellykket transduktion er ved at et grønt fluorescerende protein (GFP) -styring hele proceduren. For at gøre dette, kan 1 HEK293T 10 cm PDL plade tildeles for GFP transfektion og transduktion af en enkelt brønd af T-celler til at urern for GFP på dag 3-5. En kritisk faktor i transduktionseffektivitet er omfanget af T-celleaktivering og proliferation ved tilsætning af viral supernatant. Vi bemærker en vigtig forskel mellem vores fremgangsmåde til T-celle aktivering, som er opnået ved tilsætning af ConA til dyrkningsmediet, og der anvendes i kliniske omgivelser, som opnås ved CD3 og CD28 agonist monoklonale antistoffer. Selv om sidstnævnte er rutinemæssigt anvendes til at generere patientens retrovirale transducerede CAR T-celler, og har også haft succes med transduktion af murine T-celler, vi tidligere bestemt, at ConA stimulation ført til bedre og mere ensartede transduktioner 37. Vi har også observeret, at den samlede CAR T-celle udbytte kan variere baseret på, hvornår trin 5.18 udføres. Hvis du oplever dårlig CAR T-celle udbytte, anbefaler vi at udføre trin 5.18 umiddelbart efter trin 5.17 i stedet for at vente på 5-6 timers inkubation. Selv om dette kan påvirke effektiviteten af ​​transduktion, har vi ikke observeret signifikant difskelle i CAR overfladeekspression i vores studier.

Efter transduktion, kan CAR T-celler kvantificeres og fænotypebestemt ved flowcytometri; Vi plette vores EGFRvIII CAR T-celler med et 2-farvet panel bestående af en streptavidin-phycoerythrin (SA / PE) -konjugeret biotynlated EGFRvIII afledt multimer og anti-CD3. Alternativt kan biler, også blive farvet for ekspression under anvendelse af gede-anti-human F (ab ') 2-biotin primære og SA / PE sekundære antistoffer, som er tidligere blevet beskrevet 36. Vi rutinemæssigt observere CAR ekspression blandt 55-70% af murine splenocytter 11. Vi har tidligere vist, at levering af T-celler med denne bil ekspression profil kan let trafik til hjernen og behandle tumorer. TMZ- eller TBI-induceret lymfopeni øger klonal ekspansion af adoptivt overførte celler, hyppigere CAR-positive celler og deres samlede antitumorreaktion. CAR-T-celler kan spores in vivo ved farvning perifert blod med enppropriate tetramer; dette er en nyttig teknik til at forstå CAR T-celle overlevelse over tid og effekterne af host-condition på CAR T-celle funktion og vedholdenhed. Alternativt, hvis der ikke tetramer er til rådighed for antigen receptor, en fluorescerende reporter kan indgå i RCA vektorkonstruktion eller CAR T-celler kan mærkes ex vivo med carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) før administration til in vivo tracking.

Afhængigt af tumormodel immunterapiplatform og SOC regimen kan klinisk SOC administreres sammen adoptiv terapi eller vacciner fører til toksiciteter. TMZ er et DNA-alkylerende middel, der fører til ikke-specifik celledrab og intensiveret doser kan resultere i vægttab og sygelighed i murine værter. Høj-dosis og langvarige fraktioner af WBI kan resultere i hydrocephalus. Endvidere kan inflammatoriske virkninger fra en stærk vaccine og / eller adoptivt overført T celle responser føre til sygelighed på grund afgiftige cytokin storme. Det er også vigtigt at bemærke effekten af ​​systemisk anæstesi på sygelige dyr. Hvis TMZ og WBI føre til betydelige toksiciteter, så ketamin / xylazin doser kan reduceres med 20-25% for at reducere risikoen for dødelighed, som dyrene kun skal bedøvet og immobiliseres i 10 minutter til levering af små strålingsdoser (2- 8 Gy).

Host condition er kritisk for alle immunterapi platforme, der omfatter adoptiv overførsel. Som immunterapi forsøg ofte vurderet inden for rammerne af SOC, bør præklinisk evaluering af immunterapi ske inden denne indstilling til at rekapitulere den kliniske scenario. Vi præsenterer her et eksempel på at udnytte lymphodepletive og tumordræbende effekter af SOC med adoptiv terapi ved hjælp af CAR T-celler. Dette regime er et kraftfuldt værktøj, der kan anvendes på andre immunterapi platforme til at vurdere effekten af ​​kombineret SOC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector Imgenex 10045P Helper vector for generating CAR retrovirus
Concanavalin A Sigma Aldrich C2010 Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction
Retronectin ClonTech/Takara T100B Facilitates retroviral transduction of T cells
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Transfection reagent
DMEM, high glucose, pyruvate Life technologies 11995-065 HEK293 culture media
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 T cell culture media
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life technologies 11058-021 Transfection media
200 mM L-Glutamine Life technologies 25030-081 T cell culture media supplement
100 mM Sodium Pyruvate Life technologies 11360-070 T cell culture media supplement
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life technologies 11140-050 T cell culture media supplement
55 mM 2-Mercaptoethanol Life technologies 21985-023 Reducing agent to remove free radicals
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life technologies 15140-122 T cell culture media supplement
Gentamicin (50 mg/ml) Life technologies 15750-060 T cell culture media supplement
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum Gemini Bio Products 100-500 Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V–Standard Grade Gemini Bio Products 700-100P Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates
Pharm Lyse (10x concentrate) BD Biosciences 555899 Lyses red blood cells during splenocyte processing
70 μm Sterile Cell Strainers Corning 352350 Filters away large tissue particles during splenocyte processing
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine Corning 356469 Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection
Name Company Catalog Number Comments
Temozolomide Best Pharmatech N/A Lyophilized powder prepared on the day of administration
Dimethyl Sulfoxide Sigma Life Sciences D2650 Necessary for complete dissolution of temozolomide
Saline Hospira IM 0132 (5/04) Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine
Ketathesia HCl Henry Schein Animal Health 11695-0701-1 Ketamine solution
AnaSed Lloyd Inc N/A Xylazine sterile solution 100 mg/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, (10), 987-996 (2005).
  2. Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
  3. Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363, (8), 711-723 (2010).
  4. Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364, (22), 2119-2127 (2011).
  5. Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21, (1 Pt 1), 127-130 (1989).
  6. Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14, (11), 1264-1270 (2008).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119, (12), 2709-2720 (2012).
  8. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365, (8), 725-733 (2011).
  9. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118, (18), 4817-4828 (2011).
  10. Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55, (14), 3140-3148 (1995).
  11. Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20, (4), 972-984 (2014).
  12. Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71, (2), 211-217 (1989).
  13. Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63, (21), 7462-7467 (2003).
  14. Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66, (6), 3294-3302 (2006).
  15. Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16, (10), 1081-1085 (2005).
  16. Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171, (8), 3947-3954 (2003).
  17. Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A, (7), 940-942 (1993).
  18. Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
  19. Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15, (1), 927-943 (2014).
  20. Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62, (9), 1463-1474 (2013).
  21. Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25, (17), 3485-3491 (2007).
  22. Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65, (18), 8059-8064 (2005).
  23. Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18, (17), 4657-4668 (2012).
  24. Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173, (4), 426-432 (2010).
  25. Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23, (18), 4235-4236 (2005).
  26. Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116, (12), 2868-2877 (2010).
  27. Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3, (12), 668-681 (2007).
  28. Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17, (2), 195-201 (2005).
  29. Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26, (32), 5233-5239 (2008).
  30. Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8, (3), (2013).
  31. Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22, (4), 610-616 (1200).
  32. Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110, (2), 185-192 (2002).
  33. Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202, (7), 907-912 (2005).
  34. Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33, (1), 1-7 (2010).
  35. Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16, (4), 457-472 (2005).
  36. Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23, (10), 1043-1053 (2012).
  37. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34, (4), 343-352 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics