Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Overvågning i realtid af mitokondriel respiration i cytokindifferentierede humane primære T-celler
Chapters
Summary October 19th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Metabolisk tilpasning er grundlæggende for T-celler, da det dikterer differentiering, persistens og cytotoksicitet. Her præsenteres en optimeret protokol til overvågning af mitokondriel respiration i ex vivo cytokindifferentierede humane primære T-celler.
Transcript
Mitokondriel metabolisme er en væsentlig regulator af T-celle holdbarhed og hukommelse. Måling af mitokondriel respiration giver derfor vigtig indsigt i T-cellernes egenskaber. Seahorse-maskinen kan måle forskellige elementer af mitokondriel respiration i realtid i levende menneskelige primære T-lymfocytter uden behov for mærkning.
Denne metode er meget velegnet til overvågning af T-celle fitness og hukommelsespotentiale, som er vigtige forudsigere for kræftimmunterapi succes. Til at begynde med skal du vaske CD3 / CD28-perler ved at overføre 12,5 mikroliter perler pr. Million celler til et mikrocentrifugerør og tilføje 12,5 mikroliter PBS pr. 12,5 mikroliter af perlerne i røret. Anbring derefter mikrocentrifugerøret på en passende magnet i et minut, kassér bufferen og genophæng perlerne i det oprindelige volumen T-cellemedium.
Derefter tilsættes 12,5 mikroliter perler pr. Million celler i et forhold mellem en og to perler og celler, og opdel cellerne i to tilstande med omkring fem millioner celler i hver. Tilsæt derefter det korrekte volumen cytokiner til hver tilstand, og overfør cellerne til plader med flere brønde. Inkuber cellerne i tre dage ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.
Efter tre dages inkubation fremstilles frisk T-cellemedium med dobbelt koncentration af cytokiner. Resuspend og opdel cellerne ved at overføre halvdelen af volumenet fra hver brønd til en ny brønd. Tilsæt derefter det samme volumen frisklavet T-cellemedium til hver brønd.
Til det ekstracellulære fluxassay fremstilles belægningsopløsning indeholdende natriumbicarbonat, Cell-Tak og natriumhydroxid. Åbn derefter en frisk XF-cellekulturplade, og tilsæt 12 mikroliter af den frisklavede belægningsopløsning til hver brønd, hvilket sikrer jævn fordeling af belægningsopløsning i bunden af alle brønde. Inkuber pladen ved stuetemperatur med låget på i 30 minutter.
Kassér derefter den resterende flydende opløsning fra alle brøndene. Vask pladen med 200 mikroliter sterilt vand, og kassér væsken. Vask derefter pladen med 200 mikroliter steril PBS af cellekulturkvalitet.
Efter kassering af væsken skal pladen tørre i 30 minutter ved stuetemperatur. For at plade T-celler i XF-cellekulturpladen skal du forberede 50 ml assaymedier ved at blande egnede XF RPMI-medier med glucose, pyruvat og glutamin i henhold til forsøgsopsætningen. Opvarm det tilberedte medie til 37 grader Celsius i en ikke-kuldioxidreguleret inkubator, og indstil pH til 7,4.
Sørg for nok medier til plantning af celler og klargøring af oligomycin- og FCCP-opløsningerne. Design derefter et pladelayout med et stigende antal celler pr. Brønd til optimering eller analysekørsel. Brug fire brønde fyldt med medier og injiceret med medier til baggrundsmålinger.
Efter at have talt de tidligere fremstillede T-celler pipetter et passende antal celler til hver brønd i den tidligere belagte XF-cellekulturplade i henhold til pladens layout. For at klæbe T-cellerne til den belagte overflade centrifugeres XF-cellekulturpladen. Vask derefter cellerne med 200 mikroliter assaymedier.
Kassér medierne, og tilføj 180 mikroliter friske analysemedier. Efter at have sikret, at cellerne er fastgjort og jævnt fordelt over brøndoverfladen, inkuberes XF-cellekulturpladen ved 37 grader Celsius i det ikke-kuldioxidregulerede varmeskab i 30 minutter. Til optimeringskørslen skal du forberede arbejdsløsninger af oligomycin og FCCP i analysemedier.
Læg derefter arbejdsløsningerne for enten oligomycin eller FCCP i sensorpatronens injektionsporte. Sørg for, at ingen injektionsporte kun indeholder luft. Fyld alle tomme porte med analysemedier.
Fjern derefter potentielle bobler i injektionsportene ved forsigtigt at banke pladens kanter på bordet. Til assaykørslen fremstilles en 20-mikromolær antimycin A-opløsning. Derefter, i henhold til pladelayoutet, skal du indlæse 20 mikroliter enten oligomycin eller FCCP i injektionsport A på sensorpatronen og tilføje 22 mikroliter antimycin A til injektionsport B i alle brønde.
I en repræsentativ oligomycinoptimeringskørsel nås et plateau i iltforbrugshastighed eller OCR, når den akkumulerende koncentration når en mikromole. Fra denne koncentration og fremefter blev OCR ikke reduceret yderligere. For celler, der blev behandlet med stigende koncentrationer af afkoblingen FCCP, steg OCR-niveauerne op til 0,2 mikromolær FCCP og nåede derefter et plateau, hvilket indikerer, at der blev opnået fuld afkobling.
I en repræsentativ cellekoncentrationsoptimeringskørsel er den oprindelige OCR for et løb med 200.000 celler cirka halvdelen af det med 400.000 celler. Efter FCCP-behandling er maksimal OCR 61,6 picomoler pr. Minut for 200.000 celler og 190,4 picomoler pr. Minut for 400.000 celler. Efter oligomycinbehandling kollapser OCR i løbet med 200.000 celler i enkeltcifre og er lavere end det i løbet med 400.000 celler.
Undersøgelse af virkningen af cytokiner interleukin-2 og interleukin-15 på metabolismen af T-celler afslørede, at interleukin-15 dyrkede celler havde højere maksimal respiration og ledig åndedrætskapacitet. Basal respiration og ATP-produktion blev imidlertid ikke påvirket. At studere mitokondriemetabolisme i humane T-celler giver vigtige fingerpeg om deres holdbarhed og overlevelsespotentiale.
Dette resulterer i øget viden om T-celle fitness og kan i sidste ende forbedre kræft immunterapi respons satser.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
