En guide til å generere og bruke hiPSC Avledet NPCer for studier av nevrologiske sykdommer

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (96), e52495, doi:10.3791/52495 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Genuttrykkstudier av nevroner differensiert in vitro fra menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCs) med oss en og andre 2,3 indikerer at hiPSC nevroner ligne foster snarere enn voksen hjernevev. I dag kan hiPSC-baserte modeller være mer hensiktsmessig for studiet av predisposisjon for, heller enn sent trekk, nevrologisk sykdom. Vi har tidligere rapportert at en betydelig fraksjon av genet signatur av schizofreni hiPSC-avledede neuroner er konservert i schizofreni hiPSC-avledet nevrale stamceller (NPC), noe som indikerer at NPC kan være et nyttig celletype for å studere de molekylære reaksjonsveier som bidrar til schizofreni 1 . Vi og andre har rapportert avvik migrasjon, økt oksidativt stress og reaktive oksygenforbindelser, følsomhet for sub-terskel miljømessige påkjenninger og nedsatt mitokondriefunksjon ved schizofreni hiPSC NPC 1,4-6, samt redusert neuronal ctilkoblingsmuligheter og synaptisk funksjon i schizofreni hiPSC nevroner 5,7-10. Hvis de molekylære faktorer som bidrar til avvikende migrasjon og / eller oksidativt stress i schizofreni hiPSC NPCer også ligger til grunn for redusert nevronale tilkobling i schizofreni hiPSC-avledet nevroner, kan NPCer være en robust og svært replicative nevrale befolkning med å studere mekanismene som er ansvarlige for sykdom. Videre, fordi man hurtig kan generere et stort antall celler, og behøver ikke å vente i flere uker eller måneder for neuronal modning, NPC-baserte analyser er egnet for studier av Større materialer og er mer mottakelig for high throughput screening. Vi tror at hiPSC NPCer kan tjene som en proxy for de utviklingsveier potensielt bidrar til sykdom patogenesen, som allerede har blitt demonstrert i lidelser så forskjellige som schizofreni 1 og Huntingtons sykdom 11.

For å skille NPCer fra hiPSCs, innledende nevrale iproduksjonen skjer ved dual-SMAD hemming (0,1 mM LDN193189 og 10mm SB431542) 12. Ved å antagonisere BMP og TGF signalering med disse små molekyler, er endoderm og mesoderm spesifikasjon blokkert, akselererende neuronal differensiering og fører til dannelsen av synlige nevrale rosetter innen en uke etter plating. Neural mønster opptrer tidlig i prosessen, antagelig i løpet av neural rosett-dannelse og umiddelbart etterpå. I mangel av andre signaler, disse primitive nervecellene anta en anterior forhjerne-lignende skjebne 13. Umiddelbart etter nevrale rosett formasjon, og fortløpende gjennom NPC ekspansjon, forhjerne NPCer dyrkes med FGF2 8,14. De har dobbelt avstamning potensial og kan differensieres til nevrale populasjoner av 70-80% III-tubulin-positive nevroner og 20-30% glial fibrillære surt protein (GFAP) -positive astrocytter (figur 1). Flertallet av forhjerne hiPSC nevroner er VGLUT1-positive, Og så er antagelig glutamaterg, selv om ca 30% av nevronene er GAD67-positive (GABAergic) 8.

NPC blir rutinemessig passert mer enn ti ganger in vitro, og samtidig opprettholde konsistente differensierings profiler, og uten å akkumulere Karyotype abnormaliteter. Grupper har rapportert aging NPCer mer enn 40 ganger 15, derimot, finner vi at utover ti passasjer, viser NPCer økt tilbøyelighet for astrocyte differensiering. NPCer godt tolerere flere fryse-tiner og kan overført til å vokse som neurosfærer ved ganske enkelt å dyrke i ikke-heftende plater. NPCer er effektivt omformet av virale vektorer, muliggjør rask evaluering av de molekylære og cellulære konsekvensene av genetisk forstyrrelse, og lett utvides for å gi tilstrekkelig materiale for biokjemiske studier. Videre, fordi virale vektorer tillater robuste over-ekspresjon og / eller knockdown av sykdomsrelevant gener, enten kontroll eller pasient avledet Neural-celler, kan man bruke denne plattform for å teste effekten av genetisk bakgrunn på disse manipulasjoner. Selv om ikke egnet for synaptic eller aktivitetsbaserte analyser som krever modne nevroner, kan NPCer være et praktisk alternativ for mange enkle molekylære eller biokjemiske analyser av pasient avledet nevrale celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hiPSC Differensiering til Neural stamceller

  1. Vokse og utvide hiPSCs i humane embryonale stamceller (HMS) media (tabell 1) co-dyrket på en mus embryonale fibroblast (MEF) mater lag til store (men subsammenflytende) kolonier er klare for nevrale differensiering via en embryoid kroppen (EB) mellom (figur 2). Rutine hiPSC dyrkningsforhold er godt beskrevet andre steder 16,17; kort, vokser hiPSCs av HMS medier på en MEF matersjikt inntil sammenflytende, og deretter enzymatisk passasje med kollagenase (1 mg / ml i DMEM) og ekspandere omtrent 1: 3 etter 7 dager.
  2. For å fremstille poly-L-Ornithin / laminin belagte plater, belegge plater med 10 g / ml poly-L-Ornithin i sterilt vann for plastoverflater (50 g / ml for glassoverflater) og inkuberes ved romtemperatur i 3-24 timer. Vask minst én gang med sterilt vann og deretter strøk med 5g / ml Laminin i steril PBS ved RT i 3-24 timer.
    MERK: Hvis innpakket i plast, kan platene værelagres i opp til seks måneder ved -20 ºC.
  3. På dag 1, enzymatisk løfte subsammenflytende hiPSCs (vanligvis dyrket på MEFs eller hiPSCs dyrket i definerte medier som TeSR 18 på Matrigel) fra plate som store kolonier som bruker 1 mg / ml Kollagenase IV i DMEM / F12.
    MERK: Etter 1-2 timers inkubasjon ved 37 ºC, vil kolonier hang i parabolen.
  4. Vask forsiktig hiPSC kolonier (ved bosetting, ikke sentrifugering) 1-2x med DMEM / F12, resuspender i 2 ml / brønn N2 / B27 media (tabell 1) og overføring til ikke-klebende seks-brønns retter (kombinere tre-brønner i en -godt) 19.
    MERK: Over natten, vil kolonier danne flytende sfæriske klynger kalt "embryoid kropper" (EBS). Forvente betydelig cellulær død.
  5. På dag to, tilt plater og la EBS å bosette seg. Fjern forsiktig media og vaske en gang med DMEM / F12 for å fjerne rusk. Mate med N2 / B27 media supplert med doble Smad hemmere (0.1M LDN193189 og 10M SB431542) 12
  6. På Days 3-7, vil neuralization skje i sammenheng med dual SMAD hemming; sjekk at EBS er runde, men ikke cystisk. Mate EBS annenhver dag med N2 / B27 media supplert med 0,1M LDN193189 og 10M SB431542.
  7. På Days 7-14, etter plating av EBS til Poly-L-Ornithine / Laminin belagte plater, sjekk ved hjelp av en lysfelt mikroskop som nevrale rosetter begynner å dukke opp i løpet av få dager (karakterisert som runde klynger av neuroepithelial celler med apico-basal polaritet; Figur 1). Fortsette å mate heft EBS annenhver dag med N2 / B27 media supplert med 0,1M LDN193189, 10M SB431542 og 1 g / ml laminin.

2. Harvest of Neural rosetter

MERK: Vi anbefaler at nevrale rosetter bli enzymatisk høstes ved hjelp av Neural Rosette Selection Reagens 20 eller lignende utvalg reagens. Selv nevrale rosetter kan manuelt plukket opp til 6-brønns Poly-L-Ornithin / Laminin belagt plate, this metodikk tar omfattende opplæring for å mestre, og, avhengig av brukerens dyktighet, kan kreve en ny runde med å plukke på dag 20 for ytterligere å berike for NPCer og utarme ikke-nevrale celletyper.

  1. For enzymatisk utvalg av nevrale rosetter på dag 14, aspirer media fra levd EBS og tilsett 1 ml av nevrale rosett utvalg reagent per brønn for en seks-brønns plate. Inkuber ved 37 ° C i 1 time.
  2. Med en P1000 pipetman fjern forsiktig enzym fra hver brønn. Tilsett 1 ml DMEM / F12 per brønn for å vaske.
  3. Med en P1000, samle en ml DMEM / F12 og raskt fordrive DMEM / F12 tilbake i brønnen, og dermed demontere rosetter fra platen. Samle rosetter inn en falk tube.
  4. Pipetter ytterligere 1 ml DMEM / F12 og raskt fordrive inn i den samme brønnen for å løsne resterende rosetter. (Ikke finfordel. Prøv ikke å bryte opp rosett aggregater). Samle nevrale rosetter i samme falk tube.
  5. Gjenta trinn 2.4 etter behov. Hvis rosetter ikke løsner lett, tilsett more enzym og gjenta prosessen (trinn 2.1 til 2.4)
  6. Spinne celler ved 300 xg i 3 min. Aspirer vask, og re-suspen rosetter i 2 ml av NPC media (tabell 1). Overfør cellene (1: 1) i en poly-L-Ornithin / Laminin belagt 6 brønners plate.
  7. Fra Days 15-21, vil de nevrale rosetter utvide; fôr rosetter annenhver dag med NPC medier.
  8. Evaluere kvaliteten av de neurale rosetter og sikre at flate fibroblast-lignende celler som ikke vokser i kultur.
    MERK: Hvis ikke-rosetter vedvarer, kan NPC kulturen noen ganger bli berget ved manuell plukking, velge kun de beste av de plukket rosetter inn Accutase. Distansere 15 minutter ved 37 ºC. Pellet, vask og plate i NPC media på 24-brønnen Poly-L-Ornithine / Laminin belagt plate.

3. Utvidelse av Neural stamceller

MERK: hiPSC NPCer kan dyrkes på enten Matrigel- eller Poly-L-Ornithine / Laminin belagte plater. Vi bruker vanligvis MatrigeL-plater som de kan fremstilles raskere og til lavere pris.

  1. For å fremstille Matrigel belagte plater, raskt smelte og resuspender en 1 mg frossen porsjon av Matrigel i 24 ml kaldt DMEM / F12 og straks fordele 2 ml til hver brønn av to seks-brønns plater. Inkuberes i minst 1 time ved 37 ° C.
    MERK: Matrigel trenger bare å bli suget, vasket, umiddelbart før bruk.
  2. Mate NPCer annenhver dag og vedlikeholde ved svært høy tetthet eller de vil spontant differensiere til nerveceller.
    MERK: Selv om mer etablerte NPCer er vanligvis delt 1: 4 hver uke, kan meget lave passasje NPCer deles 1: 2 så sjelden som en gang annenhver uke.
  3. Å splitte, første aspirer media og tilsett 1 ml varm Accutase (1x) per brønn av seks-brønns plate. Inkuber ved 37 ° C i 10-15 min.
  4. Forsiktig overføre frigjorte celler til et 15 ml rør inneholdende DMEM / F12 med så lite mekanisk påkjenning som mulig. Ikke titrere celler mens i enzymet. Pellet celler ved spinning ved 1000 xg i 5 min.
  5. Suge vaske, og re-suspen NPCer i ~ 1 ml NPC media per opprinnelige brønnen av 6-brønnen.
    MERK: Forvent at en konfluent godt av en 6-brønnen tallerken har 5-10 millioner celler; Dette kan bekreftes ved å telle et 10l aliquot av celler ved hjelp av en hematocytometer før ny plettering.
  6. Etter re-suspensjon, re-plate NPCer som NPC, nevroner eller neurosfærer. For å opprettholde NPCer, plate omtrent 1-2 millioner celler per brønn av en seks-brønns plate. Effektiviteten av neurosfære dannelse kan variere mellom eksperimenter og cellelinjer, men vanligvis skjer best hvis mellom 200.000 og 1.000.000 celler blir sådd ut pr brønn av en ikke-klebende 6-brønners plate; hvis klumping av neurosfærer oppstår, reduserer antall celler sådd. Å differensiere til nevroner, platen ca 200.000 celler per brønn i en seks-brønns plate, erstatte NPC media med Neuron medier.
  7. Immunohistochemically validere hver etablert NPC linje. Når tilstrekkelig cellemateriale har vært expanded, etikett NPCer med antistoffer for nestin og SOX2. Validert NPC linjer bør også differensiert i nevroner i 4-6 uker, og merket med antistoffer for III-tubulin og MAP2AB.
    1. Fiks celler i 4% paraformaldehyd i PBS ved 4 ° C i 10 min. Permeabilize NPC ved RT i 15 min i 1.0% Triton i PBS, og deretter blokkere i 5% esel serum med 0,1% Triton ved RT i 30 min.
    2. Inkuber med primært antistoff i 5% esel serum med 0,1% Triton, over natten ved 4 ° C.
      MERK: Vi anbefaler følgende antistoffer: geit anti-Sox2, 1: 200; muse-anti-human nestin, 1: 200; kanin anti-SIII-tubulin, 1: 500; mus anti-SIII-tubulin, 1: 500; mus anti-MAP2AB, 1: 200. (Figur 2).
    3. Etter en vask med PBS, inkuberes sekundære antistoffer celler med det passende konjugert sekundært antistoff til geit, mus eller kanin på 1: 300, i i 5% esel serum med 0,1% Triton i 1-2 timer ved romtemperatur. For å visualisere kjerner, beis celler med 0,5 mikrogram / ml DAPI (4 '6-diamidino-to-phenylindole) og deretter montere med Vectashield.

4. NPC Transduksjon

  1. Bruk spinfection (sentrifugering av cellekulturplater i nærvær av viruset ved 1000 x g i 1 time) for å øke prosentandelen av transfekterte celler 21. Aspirer media og erstatte med relevant overekspresjon (eller kontroll) lentiviruses (eller retrovirus), titered til ønsket mangfold av infeksjon (MOI) (typisk 1-10), fortynnet i NPC media. Bruk 1,5 ml volum per brønn i en 6-brønns plate (eller et passende skalert volum for andre typer vevskulturplater). Sentrifugering ved 1000 x g og 37 ° C i 1 time i en plate sentrifuge.
    MERK: Ideelt transduce NPCer med lentiviral eller retrovirusvektorer innen 1-2 dager etter splitting. Enten du bruker kommersielle eller laboratorie forberedt virus, kan det være nyttig å hensiktsmessig titrere grupper av virus i forkant av serie fortynning. (Figur 3).
  2. Å redusere cellular død, erstatte media innen 8 timers av spinfection.
    MERK: Viral integrasjon og transgene uttrykk bør være synlig innen 24 timer etter reporter gen fluorescens. (Hvis viruset mangler et fluorescerende reporter, er dette vanskeligere å vurdere, vellykket transfeksjon best kan valideres av immunoblot, immunhistokjemi eller qPCR for høyekspresjonsystemer produkter.) Full uttrykk kan ta 3-7 dager; gjentatte spinfections med ekstra virus kan være nødvendig for å øke andelen av transfekterte celler. Tilbakevendende spinfections kan skje daglig, men behøver ikke å være så hyppig. Ideelt sett, hvis du bruker en fluorescerende reporter,> 80% av cellene skal merkes.

5. neurosfære Migration analysen

MERK: Neurosfærer formen spontant, etter den enzymatiske dissosiasjon av NPC (fra en måte som er identisk med den som brukes i NPC ekspansjon - trinn 3.3 til 3.6), hvis celler dyrkes i suspensjon i NPC medier.

  1. Kort, vokse distansered NPCer i NPC media for 48 timer i tilfestede plater for å generere neurosfærer. (Figur 4).
  2. For neurosfære migrering fremstille friske Matrigel plater ved hjelp av kalde medier NPC, snarere enn DMEM, i en 96-brønns plate, 1-2 timer før neurosfære plukking. Ikke aspirer Matrigel fra brønnene.
  3. Som opprinnelig publisert for embryonal stamcelle-avledet neurosfærer 22, manuelt plukke NPC-avledet neurosfærer under et mikroskop, etter vask en gang i NPC media for å fjerne mobilnettet rusk. Overføre en neurosfære til hver brønn av en Matrigel-belagte 96-brønns plate.
  4. Legg ytterligere 0,5 mg Matrigel, fortynnes i kaldt NPC media, til neurosfærene på hver 96-brønns plate.
  5. Manuelt sentrere hver enkelt neurosfære i midten av brønnen ved hjelp av en pipettespiss.
    MERK: Det er viktig å plukke neurosfærer av tilsvarende størrelse, for å redusere variasjon i resultatene.
  6. Tillate migrasjon å skje i 48 timer og deretter fikse celler with 4% paraformaldehyde og flekken med ønskede immunhistokjemiske markører.
  7. Hvis radial migrasjon er å være bestemt, fotografi neurosfærer i sin helhet ved hjelp av en 4x mikroskop objektiv. Utelukke noen Neurosfærene kontakter kanten av brønnen eller en annen neurosfære fra analysen.
    MERK: Hvis migrasjon oppstår i mer enn 48 timer, vil den resulterende radial migrasjon sannsynlig være for stor til bilde ved hjelp av en 4x objektiv.
  8. Måle gjennomsnittlig migrasjon fra hver neurosfære hjelp NIH ImageJ programvare (Figur 5). Dette kan gjøres enten ved hjelp av analysemetodene som er beskrevet nedenfor:
    1. Radial migrasjon:
      1. Manuelt spore kanten av de lengst migrere celler ved hjelp av verktøyet for frihåndsutvalg deretter bruke Measure (Ctrl + M) funksjonen for å beregne arealet av den resulterende formen. Før måling området sørge for at området er avkrysset i Set Målinger vinduet finnes under kategorien Analyser. BrukVerdien av arealmåling og ligningen for arealet av en sirkel (A = πr 2) for å bestemme den radius (utvendig).
      2. Spor kanten av den opprinnelige neurosfære, måle området og beregne radien (indre) på samme måte. Beregn det totale radial migrering som forskjellen mellom den ytre og indre radier.
    2. Greatest cellulær migrasjon:
      1. Mål avstanden beveget av de fem lengst celler fra kanten av den indre neurosfære ved hjelp av lineær selection tool etterfulgt av Measure (Ctrl + M) funksjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neural rosetter kan identifiseres morfologisk, ved hjelp av et lysfelt mikroskop ved sitt karakteristiske utseende som runde klynger av neuroepithelial celler med apico-basal polaritet (figur 1). Selv NPCer er vanligvis dyrkes på meget høy celletetthet, umiddelbart etter passaging, er litt pyramideformet soma og bipolar neurite struktur synlig (figur 1D). Validerte NPC uttrykker nestin og SOX2 i de fleste celler, skjønt III-tubulin farging er også synlig i alle populasjoner NPC, noe som indikerer at en viss andel av NPC er konstant initiere neuronal differensiering i kultur (figur 1F). Markører av neurale stamceller som SOX2 og Pax6 og forhjernen nevrale stamceller, som TBR2, blir også uttrykt i NPC, mens midthjernen markører som LMX1A og FOXA2 ikke (figur 1G-I). En betydelig andel av store og flate fibroblast-lignende celler innenfor en NPC befolkningen viser at dårlig kvalitet NPCer har blitt generert, som er usannsynlig å gi et stort antall nerveceller følgende neuronal differensiering (figur 2).

Etter vellykket transduksjon med en høy titer lentiviral eller retroviral vektor, bør mer enn 80% av cellene merkes med fluorescerende reporter inkludert i vektoren (figur 3). Neurosfære generasjon bør gi en befolkning neurosfærer med relativt homogen størrelse (figur 4), som med regelmessig fôring, kan holde seg friske i kultur i ca en uke. Neurosfære migrasjon oppstår robust hos friske neurosfærer (figur 5), og hiPSC NPCer gjennomgå rask differensiering i løpet av en neurosfære migrasjon analysen en.

Figur 1

telt "> Figur 1. Pasientspesifikke hiPSCs, NPCer og nerveceller. Lysfelt bilder av hiPSC nevrale differensiering, fra hiPSCs (A), til embryoid organer (B), nevrale rosetter (C), NPCer (D) og nevroner (E) ... 100x, skala bar 100 um FI hiPSC NPC er positive for et antall forhjernen neurale stamceller og neurale stamcelle markør, inkludert NPC markør nestin (grønn) og den neuronale markeringen III-tubulin (rødt) (F); neural stamcelle transkripsjonsfaktorer SOX2 (grønn) og Pax6 (rødt) (G), og forhjernen progenitor markør TBR2 (rødt) (H), men ikke midthjernen markører LMX1A (grønn) og FOXA2 (rødt) (I). DAPI-farget kjerner (blå). 100x, skala bar 100 mikrometer. J. NPCer kan differensiere til 70-80% III-tubulin-positive nevroner (grønn) og 20-30% glial fibrillary surt protein (GFAP) -positive astrocytter (rød). 200x, skala bar 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2

Figur 2. validere NPC Lines. Høy kvalitet (øverst til venstre) hiPSC NPCer uttrykkelig nestin (rød) og SOX2 (grønn). i de fleste celler (kjerner farget med DAPI (blå)), mens lav kvalitet (nederst til venstre) NPCer har flekker av SOX2-negative og nestin-negative celler (høyre). 4-ukers gamle nevroner differensiert fra høykvalitets NPCer uttrykke MAP2AB (grønn) og III-tubulin (rød) (øverst til høyre), men de som er differensiert fra lav kvalitet NPCer ikke (nederst til høyre). 100x, skala bar 100 mikrometer. Klikk her for å se et større version av dette tallet.

Figur 3

Figur 3. Viral Transduksjon av NPCer. Lysfelt (øverst) og GFP fluorescerende (nederst) bilder av hiPSC NPCer før (venstre) og etter viral spinfection. 100x, skala bar 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4

Figur 4. neurosfære Formation. Lysfelt bilder av heft NPCer (til venstre) og nydannede neurosfærer (til høyre). 100x, skala bar 100 mikrometer. Klikk her for å se et LARger versjon av denne figuren.

Figur 5

Figur 5. neurosfære Migration. AB. Lysfelt bilder av neurosfærer før (A) og etter (B) 48 timer av migrasjon i Matrigel. 100x, skala bar 100 mikrometer. CG. Screen ta bilder som demonstrerer metodikk for å analysere radial nevrale migrasjon ved hjelp av NIH ImageJ programvare. Klikk på "frihånd valg 'på ImageJ verktøylinje (C). Spore kanten av de lengst migrerte celler rundt neurosfærene (D). Sørg for at området er avkrysset i Set Målinger vindu (E). Bruk Mål-funksjonen (Ctrl + M) (F). Spore kanten av de opprinnelige neurosfærer (G) og bruke målefunksjon (Ctrl + M). Målinger kan deretter eksporteres til Excel for analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Media Komponenter
HMS media DMEM / F12 (Life Technologies # 11330)
20% KO-Serum Replacement (Life Technologies # 10828)
1x Glutamax (Livet Technologies # 35050)
1x NEAA (Livet Technologies # 11140)
1x 2-mercaptoethanol (55mm 1000x) (Livet Technologies # 21985-023)
20 ng / ml FGF2 (Life Technologies 13256-029)
N2 / B27 media DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Livet Technologies # 17502-048)
1x B27-RA (Livet Technologies # 12587-010)
NPC media DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Livet Technologies # 17502-048)
1x B27-RA (Livet Technologies # 12587-010)
20 ng / ml FGF2 (Life Technologies)
1 mg / ml Natural Mouse Laminin (Life Technologies # 23017-015)
Nevroner media DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Livet Technologies # 17502-048)
1x B27-RA (Livet Technologies # 12587-010)
1 mg / ml Natural Mouse Laminin (Life Technologies)
20 ng / ml BDNF (Peprotech # 450-02)
20 ng / ml GDNF (Peptrotech # 450-10)
500 ug / ml dibutyryl syklisk-AMP (Sigma # D0627)
200 nM L-askorbinsyre (Sigma # A0278)

Tabell 1. Medie oppskrifter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrevet metoder ved å skille hiPSCs inn NPCer, en nervecelletype der en betydelig andel av genet signaturen til hiPSC-avledet nevroner er bevart og som kan fungere som en proxy for de utviklingsveier potensielt bidrar til sykdom patogenesen 8, 11. I tillegg, som vi har beskrevet, NPCer er en robust replicative og enkelt transdusert nevrale befolkning, som vi mener kan være egnet for biokjemiske og molekylærbiologiske studier av sykdom predisposisjon.

Selv om vi har detaljerte metoder for å differensiere og kultur forhjerne-mønstrede NPCer, kan de enkelt tilpasses til å generere NPCer mønstret til andre celle skjebner. For eksempel, hvis flytende EBS er behandlet med 0,5 mg / ml DKK1, 10 mM SB431542, 0,5 mg / ml Noggin og 1mM cyclopamine, vil hippocampus NPCer bli generert som kan utvides i NPC media og differensiert i nerve media supplert med 20 ng / ml WNT3A 7 12,23. Gitt at de fleste subtype spesifikke nevronale differensiering protokoller skje via et NESTIN- og SOX2-positve middels, spår vi at lignende metoder kan være tilpasningsdyktig for GABAergic- 2,24 og glutamatergic- 3,25,26 spesifikke NPC populasjoner.

Det er flere viktige skritt i protokollen verdt å merke seg. Først, hvis over-uttrykke eller slå ned endogen genekspresjon, er det best å bruke en kontroll vektor som uttrykker en fluorescerende protein fra samme viral ryggraden, som vi har observert betydelige forskjeller i florescence når journalister er uttrykt fra vektorer av variable størrelser (på grunn til redusert emballasje effektivitetmed vektorstørrelse) eller med forskjell arrangører (på grunn av forskjeller i promoter effektivitet). Sekund, anbefaler vi å fylle viral transduksjon før neurosfære formasjon, som vi har observert dårlig pene av virale vektorer inn i den tette neurosfære struktur. For det tredje, som passasjen antall NPCer øker utover passasje ti, vi ofte observerer vesentlig svekket migrasjon i neurosfære analysen. Faktisk får tilbøyelighet til NPC for å gi en større prosentandel av astrocytter med passasjen, er det viktig å tilpasse passasjen av NPC linjer i hvert eksperiment.

Endelig er det viktig å vurdere de biologiske og tekniske begrensningene ved de teknikker som er beskrevet. Selv NPCer synes å være morfologisk like ved øyet, de er en heterogen befolkning består av celler som er i stand til å generere både glutamaterg og gabaergic nevroner. Mens vi observere bemerkelsesverdig konsistent forhjerne fordelingen av NPC linjer mellom personer som bruker dette method 1, dette er bare når man sammenligner fullt validerte høy kvalitet NPC linjer - det er betydelige forskjeller mellom gode og dårlige kvalitet NPC linjer. I tillegg viral transduksjon gir genetisk heterogene celler, hver med en integrering av virusvektoren på en unik genomisk sted; Derfor vil de enkelte celler variere både i antall og plassering genomiske integrasjonssider. Mer konsistente endringer i genuttrykk vil alltid oppstå når genetisk manipulasjon er rettet til en presis og definert sted, enten det skjer ved sink finger, TALEN eller CRISPR baserte strategier.

Pasient hiPSC avledet NPC kan brukes til å studere både globale genekspresjon forstyrrelser som forekommer i nevrologisk sykdom og også de molekylære og / eller cellulære effekter ved å manipulere kandidatgener eller microRNAs i sammenheng med enten friske eller syke pasient-avledet nerveceller. På denne måten, konsekvensene av å manipulere en eller flere nøkkelRisikoen allel (er) kan karakteriseres i sammenheng med forskjellige genetiske bakgrunner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Life Technologies #11330 for HES media
DMEM/F12 Life Technologies #10565 for neural media
KO-Serum Replacement Life Technologies #10828 Needs to be lot tested
Glutamax Life Technologies #35050
NEAA Life Technologies  #11140
N2 Life Technologies  #17502-048 Needs to be lot tested
B27-RA Life Technologies  #12587-010 Needs to be lot tested
FGF2 Life Technologies #13256-029 Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189 Stemgent #04-0074
SB431542 Stemgent #04-0010
BDNF Peprotech #450-02 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF  Peprotech  #450-10 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMP Sigma  #D0627 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acid Sigma #A0278 Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent Stemcell Technologies  #05832
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104
Collagenase IV Life Technologies #17104019
CF1 mEFs Millipore #PMEF-CF
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Laminin, Natural Mouse 1 mg Life Technologies #23017-015
BD Matrigel BD #354230 Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well plates Corning 3506
Ultra low attachment 6-well plates Corning 3471
goat anti-Sox2  Santa Cruz sc­17320 use at 1:200
mouse anti-human Nestin Millipore MAB5326 use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulin Covance PRB­435P use at 1:500
mouse anti-βIII-tubulin Covance MMS­435P use at 1:500
mouse anti-MAP2AB Sigma M1406 use at 1:200
Plate centrifuge Beckman Coulter Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. (2014).
  2. Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
  3. Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
  4. Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
  5. Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18, (10), 1067-1076 (2013).
  6. Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21, (7), 1547-1559 (2012).
  7. Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473, (7346), 221-225 (2011).
  9. Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. (2014).
  10. Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. (2014).
  11. An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington's Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11, (2), 253-263 (2012).
  12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  13. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  14. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
  15. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630 (2009).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  17. Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
  18. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
  19. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
  20. Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
  21. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  22. Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
  23. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  24. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  25. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
  26. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics