Contrast Imaging in Maus Embryonen Verwendung von Hochfrequenz-Ultraschall

Developmental Biology

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Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Ultraschall Mikrobläschenkontrastmittel in Wohn-, isoliert späten Schwangerschaftsphase murine Embryonen zu injizieren. Dieses Verfahren ermöglicht die Untersuchung der Perfusion Parameter und vaskulärer molekularer Marker innerhalb des Embryos mit kontrastverstärkten hochfrequenten Ultraschall-Bildgebung.

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Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, M. C., Foster, F. S. Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound. J. Vis. Exp. (97), e52520, doi:10.3791/52520 (2015).

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Abstract

Introduction

Die kontrastverstärkte Ultraschallbildgebung nutzt Mikrobläschenkontrastmittel sichtbar zu machen und kennzeichnen das Gefäßumgebung. Diese Agenten ermöglichen die nichtinvasive Beurteilung der Mikrozirkulation, Vaskularität und Herz-Kreislauf-Funktion. Zusätzlich kann eine Modifikation der Blasenoberfläche in gezielter Mikrobläschen führen Bindung an Endothelzellen Biomarkern in der präklinischen Anwendungen der Angiogenese, Arteriosklerose und Entzündung 1,2 Herstellung Molekularultraschallbildgebungs vaskulärer Ereignisse möglich demonstriert. Kontrastverstärkten Ultraschall kann daher verwendet werden, um die komplexen und vielfältigen Umgebungen, die gesunden und erkrankten Gefäßzustände 3-5 beeinflussen zu identifizieren.

In den vergangenen Jahren hat das Interesse an der Nützlichkeit der Mikroblasenabbildungs ​​der vielseitigen Mausembryo Modell erweitert. Als ein Modell der Entwicklung von Säugetieren, die Einführung von Mikroblasen in der embryonalen Gefäßsystem erhöht physiologischenStudie der Entwicklungskreislauf-System (zB Blutfluss, Herzzeitvolumen) und in Fällen von transgenen und gezielte Mutante Mausmodellen der Herzerkrankungen 6,7, kann Einblicke in die genetischen Faktoren Herz-Kreislauf-Funktion zu ändern ergeben. Tatsächlich Analysen von embryonalen Gehirngefäß quantitative und qualitative 2D sind bereits verwirklicht 8. Weiterhin stellt die Mausembryo als ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung der Bindung von Zielmikrogefäßmarker in vivo. Bartelle et al. 9, zum Beispiel, haben Avidin Mikroblasen in Embryo Herzkammern eingeführt zu beurteilen, zielgerichtete Bindung in Biotag-BirA transgenen Embryonen und untersuchen Gefäßanatomie. Eine wichtige Benchmark bei der Übersetzung dieser Technik in die Klinik - Die Erzeugung von heterozygote und homozygote Maus-Modelle können auch als Ersatz für die Tumor-Modell-Studien mit dem Ziel, die quantitative Natur der molekularen Ultraschall definieren verwendet werden.

8-10 ausgesetzt eingeführt. In utero Injektionen, jedoch mit einer Reihe von Herausforderungen. Dazu gehören Injektion Führung, die Notwendigkeit, die Bewegung in der Mutter und exteriorisierten Embryo zu begegnen, die Aufrechterhaltung der hämodynamischen Lebensfähigkeit in der Mutter und außen gelegt Embryonen Bewältigung langfristigen Auswirkungen der Narkose und Komplikationen durch Blutungen 11. Daher ist das Ziel der Untersuchung war es, eine Technik zum Injizieren von Mikroblasen in isolierte Lebensspätstadium Embryonen 12 zu entwickeln. Diese Option bietet mehr Freiheit hinsichtlich der Einspritzsteuerung und die Positionierung, die Reproduzierbarkeit der Bildebene ohne Hindernis, und vereinfachte Bildanalyse und Quantifizierung.

In der vorliegenden Studie haben wir in lebende Mäuse-Embryonen fo skizzieren ein neues Verfahren für die Injektion von Mikrobläschenr die Zwecke der Untersuchung von Mikrobläschen Kinetik und des Studiums gezielt Mikroblasen-Bindung an endogene endothelialen Oberflächenmarker. Nicht-lineare Kontrast spezifischen Ultraschall-Bildgebung wird verwendet, um eine Reihe von Grund Perfusionsparameter einschließlich Spitzenverstärkung (PE), Wasch in Rate und Zeit (TTP) in isolierten E17.5 Embryonen Spitze messen. Wir zeigen auch die Wirksamkeit des Embryos Modell zur Bewertung der quantitativen Natur der Molekular Ultraschall in einem embryonalen Endoglin Funktionsverlust transgenes Mausmodell, in dem Endoglin ist ein klinisch relevanten Ziel aufgrund seiner hohen Expression in vaskulären Endothelzellen an Stellen aktiver Angiogenese 13 . Die Haftung der Endoglin-bezogene (MB E), Ratte Isotyp IgG 2 Steuer (MB C) und ungezielte (MB U) Mikroblasen in heterozygote Endoglin (Eng +/-) und homozygot Endoglin (Eng + / +) exprimieren Embryonen untersucht. Analyse der zielBinding zeigt, dass molekulare Ultraschall in der Lage, die Unterscheidung zwischen Endoglin Genotypen und beziehen Rezeptordichten quantifizierbare molekulare Ultraschall Ebenen ist.

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Protocol

HINWEIS: Die in dieser Studie durchgeführt experimentellen Verfahren wurden von der Animal Care Committee bei Sunnybrook Research Institute (Toronto, Ontario, Canada) zugelassen. Die Verfahren für die humane Behandlung von Tieren muss jederzeit eingehalten werden. Es wird angenommen, daß der Prüfer in den Grundbetrieb eines Ultraschall-Bilderzeugungssystem ausgebildet. Dieses Protokoll funktioniert am besten mit zwei Personen.

1. Tiermodelle

  1. Mate-CD-1 männlich und weiblich Mus musculus zu Wildtyp-Embryonen zu Perfusionsstudien erhalten.
  2. Für die molekulare Bildgebung Studien generieren Eng +/- Mäusen durch homologe Rekombination mit embryonalen Stammzellen von 129 / Ola Ursprungs im Sinne der Bourdeau et al. 14 beschrieben.
    1. Rückkreuzung B6- Eng +/- Mäusen, freundlich von Dr. Michelle Letarte erworben, um das CD-1 Hintergrund. Verwendung Eng +/- CD-1 gekreuzt Embryonen, sowie deren Eng + / + littermate controls. Kamerad die Mäuse inszeniert Embryonen zu produzieren.

2. Versuchsvorbereitung

  1. Initiieren Paarung von Mäusen und überprüfen Stecker täglich. Embryonaltag 0,5 als Mittag des Tages ein Vaginalpfropf beobachtet definiert ist.
  2. Bereiten Embryomedium durch Zugabe von 50 ml fötalem Rinderserum, 5 ml 1 M HEPES und 5 ml Penicillin-Streptomycin (10.000 Einheiten Penicillin, 10.000 & mgr; g Streptomycin) zu 500 ml nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glucosegehalt (4.500 mg / L). Wickeln Sie die Flasche in Folie und halten gekühlt bei 4 ° C.
  3. Centrifuge klar Ultraschall-Gel in 50 ml konische Röhrchen bei 140 g für 20 min. Zeichnen Gel in die 30-ml-Spritzen. Füllen Sie zusätzliche (markiert) 30 ml Spritzen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und beiseite stellen. Ein Wurf von Embryonen werden in der Regel verlangen, zwischen 2-3 Spritzen Ultraschallgel und 4 Spritzen von PBS.
  4. Ziehen Sie ca. 30 Glasnadeln und sanft befestigen auf einen Streifen aus Plastilinin einer 100 x 20 mm Zellkulturschale. Dies stellt sicher, dass die Nadeln getrennt und während der Handhabung sicher. Mit einem Glasmagnet, verwenden Sie die folgenden Einstellungen auf 1 x 90 mm Glaskapillaren mit Filament: Heizung 77, Sub-Magnet 55, Hauptmagnet 70.
  5. Bereiten zehn vor zwölf Dissektion Platten (genug, um jedem Embryo innerhalb eines Wurfs zu gewährleisten wird eine eigene Schale erhalten), unter Verwendung einer 1: 8 Volumenverhältnis von Härter zur Basis. Pour 40 ml Base in ein konisches 50 ml-Röhrchen. Fügen Sie 5-6 ml Härter und rühren Sie mit Holzstab.
    1. Gieße in 60 x 15 mm-Kulturschalen, Füllen jeder auf etwa die Hälfte. Stehen lassen O / N eingestellt.
  6. Befestigen weiblichen Luer-Komponenten 400 mm lange Stücke von Polyvinylchlorid (PVC) Rohrleitung (Innendurchmesser: 0,79 mm). Der Schlauch muss von der Spritzenpumpe zum Ultraschall Bühne bequem zu erreichen.

3. Versuchsaufbau

  1. Ordnen Sie die Imaging-Plattform unter dem Operationsmikroskop mit einem 3D-Motor und lineare Anordnung 21 MHz Wandlers.
    1. Richten Sie die Plattform, so dass die Schienenmontage ist auf der linken Seite, mit der Bühne direkt unter dem Mikroskop positioniert.
    2. Befestigen des 3D Motor mit dem Kugelgelenk der Verlängerungsarm der Plattform. Schrauben Sie den Schnellspanner nach der Wandlerklemme in die Schnellwechselhalterung am Motor nach vorne, und positionieren Sie den Schallkopf in der Klemme, die Befestigung der Verriegelung.
    3. Sichern Sie den Schallkopfstecker im aktiven Port auf der Vorderseite des Wagens. Schalten Sie das Gerät ein.
  2. Initiieren Sie die 21-MHz-Ultraschallwandler, die Auswahl der "Kardiologie" Einstellung für die molekulare Bildgebung Studien und "allgemeine" für Perfusionsstudien. Umschalt alle zeitabhängigen Verstärkungskompensation Schieberegler, um die genaue Mittelstellung. Für "Contrast Mode ', stellen Sie die folgenden Parameter ein: Frequenz: 18 MHz, Sendeleistung: 4% (0,39 MPa), Kontrastverstärkung: 30 dB, Schwerpunkte: 6 und 10 mm, Kontrastmodus: Nichtlineare, Burst-Zeit: 100% bei 0,1sec, Öffnungswinkel: Weitwinkel.
  3. Aliquoten 40 ml Embryo Medien jeweils in vier 50 ml konischen Röhrchen. Zeigen auf Eis.
  4. Erhitze 1 l Wasser in einem 2 l Becherglas auf einer Heizplatte. Zu halten, bei 45 ° C. Fügen Sie eine Spritze Ultraschallgel und PBS in den Becher zu vorzuwärmen. Diese Temperatur wird durch die Überwachung der mit einem Thermometer zu allen Zeiten.
  5. Beiseite zehn vor zwölf 1 ml Spritzen und zehn Minuten vor zwölf 21 G Nadeln für die Injektion von Mikrobläschen gesetzt.

4. Chirurgische Verfahren

ANMERKUNG: Halten Sie ein Assistent bereiten die Blasen (Stufe 5), während der Chirurg beginnt den chirurgischen Eingriff. Das hier beschriebene Protokoll wurde von Whiteley et al angepasst. 15

  1. Sammeln E16.5 E17.5 Embryonen oder von der schwangeren weiblichen Maus nach Genickbruch.
    HINWEIS: Die Auswirkungen der Narkose an Embryonen sind noch nicht im Detail 16 untersucht. Weitere Methoden, darunter die Enthauptung, so können geeignete op seingungen für die Opfer der schwangeren Mäusen.
    1. Schneiden Sie den Bauch, um die Gebärmutter und Embryonen zu offenbaren. Sorgfältig und schnell entfernen die Gebärmutter durch Abschneiden an den Spitzen der Uterushörner (Durchtrennen der Eierstock- und Gebärmuttergefäße) und Durchtrennen an der Vagina und Blase.
    2. Mit Splitterpinzette, Transfer in die Gebärmutter zu einem Rohr von 40 ml eiskaltem Embryo Medien so schnell wie möglich, ohne die Embryonen. Entsorgen Sie die Maus Karkasse.
  2. Sie umziehen, um Mikroskop und Bühne. Zahlen Sie die Gebärmutter in einen 100 x 20 mm Zellkulturschale. Übertragen Sie die Gebärmutter in eine neue Schale mit 50 ml frisch Embryo Medium gefüllt.
  3. Mit sterilisiert (70% Ethanol Spray) feinen Pinzette vorsichtig reißen und ziehen weg die äußeren Membranen der Gebärmutter beginnt an einem Ende. Setzen Sie das Plazenta-Dezidua, parietalen Dottersack und Reichert-Membran zu trennen und aus der zugrunde liegenden viszeralen Dottersack zu entfernen.
  4. Sezieren die Embryonen eine nach der anderen, wobei die Eingeweide yOlk Säcke intakt und der Handhabung der Plazenta so schonend wie möglich 17. Achten Sie darauf, Bruch der Dottersack zu vermeiden, da die Embryonen springt heraus sofort.
    1. Verwenden Sie den Schaumlöffel, um die Embryonen zu einem anderen Gericht auf Eis mit frischen Embryo Medien gehalten zu bewegen. Halten Sie die Embryonen gekühlt, bis sie benötigt. Ändern Sie die Medien im Embryo Gericht jeden 1-1,5 Std. Mit diesen Bedingungen Embryos lebensfähig sind für bis zu 4 h nach der Sektion.

5. Mikroblasen Vorbereitung

HINWEIS: Führen Sie die molekulare Bildgebung mit Ultraschall mit beiden gezielte und ungezielte Mikroblasen. I) Antikörper gezielte Mikrobläschen, ii) Steuer Isotyp Antikörper gezielte Mikroblasen und iii) nicht zielgerichtete Mikrobläschen: Ein einziges Experiment kann bis zu 3 separate Ampullen von Mikroblasen benötigen. Das Kontrastmittel wird als Trockenpulver-freeze und müssen mit Kochsalzlösung vor der Injektion rekonstituiert werden. Es gibt ~ 2 x 10 9 Mikroblasen in jedem ungezielte microbubble Fläschchen und ~ 8,8 x 10 8 Mikrobläschen in den Ziel bereit Fläschchen. Die Mikrobläschen sind für bis zu 3 Stunden nach Rekonstitution stabil.

  1. Rekonstitution der Ziel Bereit Vials
    ANMERKUNG: Beispiele für Ziel bereit Zubereitungen: Endoglin gezielte Mikrobläschen (MB E, mit biotinyliertem Ratte MJ 7/18 Antikörper gegen Maus Endoglin; in Haus Hybridom Anlage); vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor Rezeptor 2 (VEGFR2) gezielte Mikrobläschen (MB V, mit Biotin-Anti-Maus CD309); Ratte Isotyp IgG 2 Kontrollantikörper gezielte Mikrobläschen (MB C, Biotin Ratte Isotyp IgG 2 Steuer Targeting Maus-IgG2a).
    1. Verdünnen Sie die Antikörperlösung (20 ug) in 1 ml (Endvolumen) Kochsalzlösung. Halten Sie auf dem Eis.
    2. Füllen Sie Spritze mit 1 ml Kochsalzlösung, die Beseitigung aller Luftblasen. Anbringen einer 21 G-Nadel, Injizieren Sie die Lösung langsam in die Mikrobläschen Fläschchen.
    3. Ziehen Sie langsam den Kolben, das Entfernen von 1 ml Luft, und die Nadel zurückzuziehen. Sanftagitieren. Lassen Sie Standplatz 5 min auf Eis.
      HINWEIS: Ultraschall Mikroblasen können unter Hochdruckumgebungen zerstört werden.
    4. Nach der abgelaufenen Zeit, füllen Sie eine neue Spritze mit Antikörperverdünnung und fügen Sie den entsprechenden Fläschchen. Vorsichtig geschwenkt. Lassen Sie die Mischung (jetzt 2 ml) stehen für 10 min. Halten Sie auf dem Eis. Unter Annahme einer vollständigen Oberflächen Konjugation, ist die durchschnittliche Zahl der gebundenen Liganden für die Mikroblasen ca. 18 7.600 Liganden / & mgr; m 2.
  2. Rekonstitution der ungezielte Vials
    1. Füllen Sie Spritze mit 1 ml Kochsalzlösung, die Beseitigung aller Luftblasen. Anbringen einer 21 G-Nadel, Injizieren Sie die Lösung langsam in die Mikrobläschen Fläschchen.
    2. Ziehen Sie langsam den Kolben, das Entfernen von 1 ml Luft, und die Nadel zurückzuziehen. Vorsichtig geschwenkt. Lassen Sie Standplatz 5 min. Hinzufügen eines zusätzlichen 1 ml Kochsalzlösung, wie oben beschrieben. Vorsichtig geschwenkt und lassen Sie stehen 10 Minuten auf Eis.
  3. Coulter Counting
    1. Leicht bewegen die gewünschte Mikroblasen-Fläschchen und ziehen ~50 ul der Lösung in eine 1 ml Spritze mit der 21G Nadel. Injizieren Sie die Mikrobläschen in einen leeren 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. Pipettieren Sie 10 ul-Probe von Mikroblasen-Stammlösung in 10 ml Verdünnungsmittel.
    3. Nach vorsichtigem Mischen, bewerten die Konzentration und Größenverteilung der Mikroblasen-Bevölkerung durch die Verwendung Scharzählung (siehe Liste der Materialien). Zählen ein Minimum von drei 50 ul-Messungen (pro Ampulle Probe) unter Verwendung eines 30 & mgr; m Apertur.
  4. Vorbereitung Microbubbles for Injection
    HINWEIS: Der Assistent führt Sie diesen Schritt, wenn "Die Injektion von Mikroblasen in Embryonen" (Schritt 6) begonnen wird. Jeder Embryo wird einmal eingespritzt wird, mit dem Typ der Mikrobläschen für jede Injektion gewählt, um nach dem Zufallsprinzip durch den Assistenten, so dass alle Arten von Mikroblasen gleichmäßig während des gesamten Verfahrens verteilt ist, sondern in zufälliger Reihenfolge angegeben gewählt werden. Stellen Sie sicher, der Chirurg ist blind für die Art von Blase injiziert.
    1. Bestimmen Sie, the Volumen erforderlich, um eine endgültige Konzentration von 1 x 10 8 MB ​​/ ml in einem Volumen von 400 ul zu produzieren (berechnet die Lautstärke mit den Stammkonzentrationen in 5.3.3 gemessen) Aktienblase Lösung. Aliquot das entsprechende Volumen Kochsalzlösung in ein leeres Reaktionsgefäß.
    2. Leicht bewegen das ausgewählte Mikroblasen-Fläschchen und ziehen eine Überschussvolumen (~ 50 & mgr; größer als die oben berechneten) der Lösung in einer 1 ml Spritze mit dem 21 G-Nadel. Injizieren Sie die Mikrobläschen in einen leeren Reaktionsgefäß.
    3. Pipettieren Sie das notwendige Volumen der Mikroblasen-Stammlösung und fügen Sie die aliquote Menge Kochsalzlösung. Mischen durch Rühren vorsichtig mit der Spitze der Pipette.
    4. Zeichnen Sie die verdünnte Mikroblasen-Lösung in eine saubere Spritze mit dem 21 G-Nadel. Entfernen der Injektionsnadel, beseitigen alle Luftblasen aus der Spritze und befestigen Sie den Luer und Schläuche. Langsam schieben Sie die Lösung für das Ende des Schlauches darauf achten, dass keine Luftblasen zu erzeugen.
    5. Legen Sie die syringe in eine Spritze Infusionspumpe eingestellt, um die Mikrobläschen mit einer Rate von 20 ml / min mit einem Gesamtvolumen von 20 ul zu verzichten. Bringen Sie ein gezogen Glasnadel bis zum Ende des Schlauchs. Bewegen Sie die Pumpe in der Nähe der Einspritzphase.

6. Die Injektion von Mikroblasen in Embryonen

  1. Nach dem Zufallsprinzip auswählen und entfernen (mit Lochlöffel) ein Embryo aus dem Kühlmedium Gericht. Platzieren Sie in Dissektion Gericht auf dem Ultraschall Bühne unter dem Stereoskop befindet und entfernen Sie den Dottersack und Amnionmembranen mit den feinen Pinzette, Schneiden / Reißen von der Seite, die am wenigsten mit Gefäßen erscheint (die antimesometrial Seite). Dies wird am einfachsten durch Durchstoßen einer Fläche benachbart zu dem Kopfbereich erzielt wird.
    1. Geschnitten genug, um die Embryos aus zu entfernen, aber nicht mehr. Stabilisierung der Dissektion Gerichte mit kleine Stücke aus Plastilin.
  2. Manöver vorsichtig den Sack aus der ganzen Embryo. Positionieren Sie den Embryo auf der Seite, mit der Plazenta undNabelgefässe vor. Mit den Insekten Stifte, festzunageln den Dottersack (4 Pins empfohlen) und Kanten der Plazenta wie nötig, um an Ort und Stelle zu befestigen. Vermeiden großen Gefäße.
  3. Waschen Sie den Embryo mit vorgewärmter 45 ° C PBS, bis der Embryo belebt. Identifizieren Sie die Nabelvene und die damit verbundenen Gefäßnetz. Positionieren Sie den Teller so, dass die Injektion kann bequem durchgeführt werden.
    HINWEIS: Sobald erwärmt wird Blut im Embryo zu fließen beginnen, sichtbar Pumpen in der Nabelarterie. Wenn beginnt Strömungs Zunächst werden die Adern a leuchtend rot, mit dem Blut in beide Behälter schnell identisch erscheinen. Die Äste, die aus der Nabelvene Regel überlagern, die von der Nabelarterie auf der Plazentaoberfläche.
  4. Sobald der Embryo wieder, bedecken Sie es (aber nicht die Plazenta) mit vorgewärmter US-Gel, dass auf jeden Fall vorsichtig entfernen Sie alle Luftblasen (mit den feinen Pinzette) aus der ganzen Embryo. Füllen Sie die Schale mit vorgewärmten PBS.
    HINWEIS: Achten Sie auf die Höhe der solutiauf der PBS und Gel Spritzen und fügen Backup Spritzen an die Heizungs Becher nach Bedarf.
  5. Montieren Sie die Glasnadel auf einem großen Ball aus Plastilin am Rande der Dissektion Gericht und führen Sie die Nadel Ende in die PBS. Die Wahl einer Vene an der Chorion-Oberfläche der Plazenta-Scheibe, so weit entfernt von der Hauptgeschäftsstelle als angemessen, schneiden Sie die Spitze der Größe mit einer Schere. Injektion ist am einfachsten, wenn die Spitze in einem leichten Winkel schneiden. Entfernen Sie alle scharfen Kanten des Glases an der Kante der Federschere.
  6. Verwendung der Spritzenpumpe und injizieren die Mikrobläschenlösung bei 20 & mgr; l / min in die Glasnadel, bis die gesamte Luft aus der Nadelspitze ausgestoßen wird und Mikrobläschen zu erkennen, um frei in den PBS fließt. Stoppen der Pumpe und einem Injektionsvolumen von 20 ul zurückgesetzt. Lassen Sie keine Luft zum des Embryos Gefäßsystem während der Injektion ein.
  7. Legen Sie die Glasnadelspitze sanft in eine der Venen in der Plazenta und sicherzustellen, dass es unbeweglich ist. Parallelverschiebung der Steroscope Kopf und Position der Wandler über dem Embryo. Initiieren Bildgebung.

7. Ultraschall Molekulare Bildgebung

HINWEIS: Mit Hilfe der Kontrastnichtlineare Abbildungsbedingungen zuvor einzustellen, setzen Sie den Schwinger so, dass der Embryo wird gleichmäßig zwischen den Brennpunkten bei 6 und 10 mm liegt. Einmal positioniert, starten Sie den Bolus-Injektion der Mikrobläschen. Wenn die Injektion abgeschlossen ist, starten Sie den Timer.

  1. Perfusion Imaging
    1. Stellen Sie sicher, dass die maximale Anzahl der Bilder für nichtlineare Kontrastmodus wird durch Drücken der "Studienmanagement" wählen und auf die Registerkarte "Prefs" am oberen Rand der Studie Browser ausgewählt. Überprüfen Sie das entsprechende Kästchen im Fenster "Einstellungen".
    2. Passen Sie die Bildeinstellungen durch die Einleitung lineare Bildgebung. Drücken Sie die "Kontrastmodus-Taste auf dem Bedienfeld. Verfeinern Sie den 2D-Gewinn durch Anpassung der "Gewinn & #8217; wählen, um 30 dB, die Macht zu 4% zu senken mit dem "Power" zu wählen, verringern Sie die Frequenz auf 1 Hz unter Verwendung des "Frequenz" wählen und stellen Sie die Strahlbreite (links unten), um breite Verwendung der Rollerball / Maus.
      HINWEIS: Alle Steuerungen sind auf dem Bedienfeld des Ultraschall-Systems.
    3. Einfangen des gesamten Wasch in und Dissipation des Mikrobläschens Bolus mit einer Aufnahme 20 min Filmschleife mit einer Bildfrequenz von 1 Hz. Drücken Sie Scan / freeze, um die Datenerfassung zu starten.
    4. Sobald die vollständige Sequenz von Bildern eingefangen worden ist, drücken Sie die Taste "Cine-Speicher" auf dem Bedienfeld, um die Sequenz von Bildern in der Systempuffer zu speichern. Das System erstellt einen Datumsstempel versehen Kinoschleife der erworbenen nichtlineare Kontrastmodelldaten.
  2. Gezielte Mikroblasen Imaging
    1. Unter "Prefs", stellen Sie den Burst-Zeit 0,1 s. Legen Sie die entsprechenden Aufnahmeparameter mit den Steuerelementen desoben cribed (7.1.2.).
    2. Initiieren nichtlineare Kontrastbildgebung durch Drücken der 'Kontrastmodus-Taste auf dem Bedienfeld. Sicherstellen, dass die Embryos richtig unter dem Wandler und dass die Strömung des Mikrobläschenkontrastmittels durch den Embryo in dem nichtlinearen Bildkontrast-Modus sichtbar entfernt.
    3. Gezielte Mikroblasen verbindlich während der Embryonalentwicklung der molekularen Bildgebung Studien zu bewerten, damit die Mikrobläschen für 3 min und 40 s nach Abschluss der Injektion zirkulieren ungestört. Dieses Mal ist die Beibehaltung der zirkulierenden Mikroblasen zu ermöglichen. Drücken Sie "Scan / einzufrieren", um Bildgebung während dieser Zeit zu stoppen.
    4. Bei 3 min und 40 sec, Lebenslauf Bildgebung, um zu bestätigen, dass der Embryo noch sichtbar ist, ausreichend mit PBS bedeckt, und dass Mikroblasen weiter zirkulieren. Drücken Sie "Scan / einzufrieren", um Imaging zu starten.
    5. Erwerben Sie die Störung / Nachschub Sequenz bei 3 Minuten und 50 Sekunden nach der Injektion durch die Aufnahme eines "Pre-Zerstörungtion "akustische Antwort-Sequenz mit 29 Hz. Drücken Sie "Scan / einzufrieren", um die Datenerfassung zu starten. Bei 4 min nach der Injektion 18,19, starten Sie eine 0,1 s Hochfrequenz-Lautstärkespitzen. Drücken Sie die "Burst", um einen Ausbruch zu implementieren.
    6. Weiterhin Frames für den Rest der Sequenz aufzeichnen (bis der Puffer Zeile voll) und speichern Sie die Filmschleife mit 'Cine-Speicher'.
    7. Sammeln eine zusätzliche Filmschleife von zirkulierenden Mikroblasen. Das nachfolgende "Post-Zerstörung" Bildsequenz wird angenommen, dass nur umlaufende Blasensignale, die den Strahl wieder aufgefüllt sind, enthalten. Drücken Sie "Scan / freeze 'zu Bildgebung und" Cine-Shop "zu initiieren, um die Bilder zu sammeln.
    8. Beschriften Sie die Cine-Loops nach Abbilden jedes Embryo. Drücken Sie 'Studienmanagement ", markieren Sie die Datei mit Hilfe des Rollkugel und die" Option "-Taste, drücken Sie' Bild Label" und den Namen entsprechend.

    8. Handhabung von Embryonen nach Injection

    1. Beitrag Bildgebung, bewegen Sie den Wandler, unpin den Embryo und einschläfern (via Enthauptung, Genickbruch, Erstickung mit Kohlendioxid oder Anästhesie, gefolgt von schnellem Gefrieren oder Fixierung) wie gewünscht.
    2. Für jede nachfolgende Embryo Injektion eine frische Präparation Gericht, Nadel, Spritze und Schlauchsegment verwendet werden, bei der Vorbereitung der nächsten Charge von Mikroblasen-Injektionslösung stattfindet beim Präparieren und Wiederbelebung.
    3. Sparen Gewebeproben (zB Schwanz, Gehirn) für weitere Analysen (zB Genotypisierung mittels PCR-Analyse von Schwanz-DNA isoliert, LacZ-Färbung oder semi-quantitative Maßnahmen der Biomarker Ausdruck mit Western Blots 21 bestimmt).

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Representative Results

Die Injektion von Ultraschallkontrastmitteln in ex utero Mausembryonen ist abhängig von der erfolgreichen Isolierung von lebenden spät Gestationsalter Embryonen aus dem Uterus und Wartung der Lebensfähigkeit im Verlauf der Injektion und ähnliche Ultraschallbildgebung. Nachdem der Embryo wurde nach außen verlagert und so positioniert, wie in Figur 1 gezeigt, ist eine sorgfältige Injektion von Kontrastmittel in den embryonalen Gefßsystems möglich. Eine typische B-Mode-Ultraschallbild eines E17.5 Maus-Embryo ist in 2A gezeigt. Die Wash-in der Mikrobläschen und der entsprechenden Verbesserung in der unteren Hohlvene, das Herz, das Gehirn und im gesamten Tier kann mit nichtlinearen Kontrastbildgebungsverfahren erfasst werden, wodurch die Durchführbarkeit dieser Methode demonstriert. Individuelle Zeitpunkte werden in 2B dargestellt und zeigen die Veränderung im Vergleich mit der Zeit.

Durch das Aufzeichnen des gesamten Wasch in und Wash-out of der Mikroblasen-Bolus, ist es möglich, verschiedene Perfusionsparameter messen. In einer Offline-Analyse wurde der Gegensatz Region Trace-Tool verwendet werden, um 1,5 mm 2 Regionen von Interesse (ROI) in den embryonalen linken und rechten Gehirnhälften zu schaffen. Die mittlere Signalintensität in diesen ROIs wurde dann als eine Funktion der Zeit und geglättet unter Verwendung eines Sieben-Punkte-Medianfilter. Aus der resultierenden Kontrastintensität-Kurve (in 2C gezeigt), das Gehirn wurde Überhöhungs bestimmt. Die Wash-in Rate, definiert als die Steigung zwischen 10% und 50% des maximalen Überhöhungs (PE), wurde ebenfalls berechnet. Schließlich wurde der Zeit-zu-Spitze (TTP) ab dem Beginn der Signalverstärkung auf die Spitzenzeit berechnet. Unterschiede in der mittleren Perfusionsparameter über verschiedene Arten Blase wurden mit separaten t-Tests 12 getestet. Diese Ergebnisse, die in Tabelle 1 zusammengefaßt, zeigen, dass die Injektion von Mikrobläschen eine valuLage Verfahren zur Ermittlung wichtiger Perfusionsparameter im Entwicklungs Maus.

Einführung von Mikrobläschen in den embryonalen Gefßsystems ermöglicht auch die Verwendung von Maus-Embryos als Modellsysteme zu definieren und zu kennzeichnen, die quantitativen Fähigkeiten der Molekularultraschallbildgebung. In dem folgenden Beispiel wird ein Verlust der Funktionsmodell, in denen eine genetische Manipulation generiert heterozygote und homozygote Expressionsmuster von Endoglin in embryonaler Mäuse, wurde verwendet, um die Fähigkeit der molekularen Bildgebung von Ultraschall zwischen Genotypen unterschieden testen. Nach Injektion von Mikrobläschen und Umsetzung von Zerstörung / Nachschub Imaging wurde das Verhältnis der durchschnittlichen Signalintensität des "Pre-Zerstörung" zu "post-Zerstörung 'Sequenzen verwendet, um ein Maß für das Molekularsignal namens Gegensatz mittleren Leistungsverhältnis (CMPR ). Ein lineares Mischmodell (mit Bonferroni Anpassungen für multiple Vergleiche vorgenommen) durchgeführt, um festzustellen, w hether gab es ein wesentlicher Unterschied zwischen Endoglin gezielte Steuerung und ungezielte Mikroblasen-Bindung an Eng + / + oder Eng +/- Embryonen (ermittelt nach der Injektion durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) der Schwanzproben). Die geschätzten CMPR Mittel (Mittelwert ± 95% Konfidenzintervall (CI)) für jeden Mikroblasen und Embryo-Typ in Abbildung 3 dargestellt und sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Diese Ergebnisse liefern einen konkreten Nachweis, dass die Injektion von Ultraschallkontrastmittel in isolierten lebenden Embryonen erreicht werden kann. Weiterhin Dieses Protokoll ermöglicht die Beurteilung der Perfusion Parameter und kann verwendet werden, um Mikrobläschen ziel Bindung in Embryos Modellen einer Gefäßerkrankung in einem Versuch, die Leistungsfähigkeit der molekularen Ultraschallbildgebungs aufzuklären vergleichen.

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Abbildung 1: Versuchsaufbau für die Injektion von Mikroblasen in isolierte Embryonen. Ein 21 MHz-Linearschallkopf über einem exteriorisierten Lebens E16.5 Embryos positioniert ist, wie in 20 & mgr; l Mikrobläschen-Lösung wird in eine Plazenta-Vene mit einer Glaskanüle injiziert. Maßstabsbalken = 10 mm. Von Denbeigh, JM et al. 12 mit Genehmigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Ultraschall-Bildgebung von außen gelegt Wohn E17.5 Embryonen. (A) B-Modus-Ultraschallbild eines Embryos. Vor der Injektion von gezielten Mikrobläschen (t = 0 sec.) (B) Nicht-lineare Kontrastbild des Embryos vor und nach der Injektion von Mikrobläschen. Nichtlineare kontrastreiches Bild prioder der Injektion (t = 0 sec) Mikrobläschen. Nur die stark reflektierenden Grenzflächen (zB Knochen) sichtbar sind, mit minimalen Signal von den Weichteilen. Unten, nichtlineare Kontrastbild von Mikrobläschen innerhalb des Embryos bei t = 50 s, t = 120 s und t = 420 sec nach einer Bolus-Injektion. Kontrast im gesamten Tier, einschließlich des Herzens und des Gehirns festgestellt. (C) Perfusion Parameter von Zeit Intensitätskurven abgeleitet. Intensity Grundstück von Mikrobläschen als Funktion der Zeit in einem einzigen ROI im embryonalen Gehirn. Perfusion Parameter werden auf dem Graphen identifiziert, darunter Spitzenverstärkung (PE), Wasch in Rate (Steigung), und die Zeit bis zum Peak (TTP). Pfeilspitzen: R = Rippen, Ht = Herzen, Br = Gehirn. au, willkürlichen Einheiten; ROI, Region of Interest, sec, Sekunden. Maßstabsbalken = 3 mm. Diese Zahl hat sich von Denbeigh, verändert wurde JM et al. 12. Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößernVersion dieser Figur.

Figur 3
Abbildung 3. Zusammenfassung der mittlere Kontrast bedeuten Leistungsverhältnisse (CMPR) für Endoglin gezielte (MB E), Steuerung (MB C) und nicht zielgerichtete Mikrobläschen (MB U) in Eng + / + und Eng +/- Embryonen. CMPRs von Endoglin gezielte Mikrobläschen waren signifikant höher (***, p <0,001) als die für MB und C MB U gesammelt (nicht signifikant voneinander verschieden, unabhängig vom Genotyp). MB E Bindung wurde gefunden in Eng + / + Embryonen (dunkle Markierungen), verglichen mit signifikant höher,Eng +/- Embryonen (Lichtmarker). Ergebnisse als Mittelwert ± 95% Konfidenzintervall dargestellt. n gibt die Anzahl der einzigartigen Embryonen in jeder Kategorie. Von Denbeigh, JM et al. 22 mit Genehmigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Mikroblasen-Typ T-Tests
p-Wert
Perfusion Parameter MB U MB C MB V MB U vs MB C MB U vs MB V MB <sub> C vs MB V
Peak-Enhancement, PE (au) 0,427 ± 0,063 0,490 ± 0,079 0,499 ± 0,064 0.19 0,06 0.81
Wash-in-Rate (au / s) 0,008 ± 0,002 0,009 ± 0,002 0,011 ± 0,002 0,18 0,01 0,09
Time to Peak, TTP (sec) 53,75 ± 7,96 51,75 ± 4,46 45,00 ± 5,33 0.55 0,03 0,03
# Embryonen injiziert 4 4 3

Tabelle 1. Zusammenfassung der E17.5 embryonalen Perfusionsparameter. Mittelwert ± Standardabweichungen von Zeit Intensität Grundstücke für alle ROIs Embryo abgeleitet (ein.u. = Willkürliche Einheiten). Die Tabelle enthält Messungen für ungezielte (MB U), IgG 2 Steuer gezielte (MB C) und VEGFR2 gezielte (MB V) Mikroblasen. Separate t-Tests wurden durchgeführt, um Gruppen zu vergleichen. Diese Tabelle wurde von Denbeigh, JM et al. 12 geändert.

Mikroblasentyp Genotyp CMPR Mittel 95% Konfidenzintervall
MB E Eng + / + 9,71 9,05, 10,38
Eng +/- 5,51 4,87, 6,15
MB C Eng + / + 1.42 0,41, 2,43
Eng +/- 1.46 0,45, 2,47
MB U Eng + / + 1,7 0,65, 2,75
Eng +/- 1.76 0,67, 2,84
Lineare gemischte Modell: Zwischen-Subjekt-Effekte
df F p-Wert
Genotyp 1 12,75 <0,001
Mikroblasentyp 2 147,65 <0,001
Genotype * Mikroblasen-Typ 2 18,29 <0,001

Tabelle 2. Zusammenfassung der linearen gemischten Modell AnalyseMikrobläschen-Bindung in Embryonen mit Bonferroni-Korrektur bei Mehrfachvergleichen. Genotyp Mikrobläschentyp und die kombinierte Interaktion (Genotyp * Mikroblasen-Typ) wurde festgestellt, wesentliche Faktoren bei der Bestimmung CMPR sein. df = Freiheitsgrade. Von Denbeigh, JM et al. 22 mit Genehmigung.

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Discussion

Ultraschallkontrastmittel wurden in der Spätphase der Trächtigkeit Mausembryonen und nichtlineare Kontrastbilder injiziert wurden erworben, um die Perfusion Parameter zu messen und zielgerichtete Mikrobläschen verbindlich. Erfolgreiche Abbildung von Mikrobläschen in embryonalen Vaskulatur war abhängig von einer Reihe von Faktoren, wobei der erste Embryo Lebensfähigkeit. Die gesamte Ausrüstung und die Vorrichtung wurden im Voraus, um die Zeit für die Trennung von Embryonen aus dem Uterus zu Beginn der Einspritzung zu minimieren hergestellt. Da die Auswirkungen einmaliger oder wiederholter Exposition auf die Anästhesie an embryonalen Mäuse nicht im Detail untersucht wurde der Einsatz von Anästhesie bei der Mutter vor 16 vermieden opfern. Während Embryo Isolierung war es wichtig, eine Beschädigung des Dottersacks zu verhindern und sicherzustellen Embryonen wurden zu allen Zeiten gehalten, gekühlt, in häufig aktualisiert Embryo Medien. Wenn exteriorisieren den Embryo vor der Injektion und während Pinning wurden wichtige Dottergefäße vermieden werden, um die likelihoo begrenzend von Blutungen, die tödlich sein können. Wir haben festgestellt, dass bei der Wiederbelebung der Embryo, war es am besten, zunächst auf die Plazenta und dann den Embryo mit PBS, bevor Ultraschall-Gel auf den Embryo in einer Hin- und Herbewegung und Entfernen von großen Luftblasen mit einer Pinzette. Der Rest der Petrischale wurde dann mit PBS gefüllt. Die Verwendung von Gel und PBS beschränkt die Möglichkeit von Lufttaschen zwischen dem Embryo und dem Wandler, der die Bildqualität beeinflussen können. Da der Embryo wieder begann Blut zu fließen, sichtlich Pumpen in der Nabelarterie während die Nabelvenen erschien leuchtend rot 23. Zum Vergleich, die Zweige, die aus der Nabelvene der Regel zu überlagern, die von der Nabelarterie auf der Plazentaoberfläche. Obwohl es möglich war, in die Plazenta Labyrinth Arteriolen einzuspritzen, Injizieren der Mikroblasen in Strömungsrichtung verringert Plazenta Blutungen und venule Injektionen auch erlaubt die Mikrobläschen, um direkt durch den Embryo vor zirkulierenden th passierenrau die Plazenta.

Aufgrund ihrer Zerbrechlichkeit, Mikroblasen Herstellung und Handhabung erforderlich auch Pflege. Ultraschall Mikroblasen können unter Hochdruckumgebungen zerstört werden. Daher wurde der gleichen Prozedur wiederholt während jeder Rekonstitution und Blasenkonzentration wurde gemessen, um experimentelle Konsistenz zu gewährleisten. Eine einzelne Flasche von Mikroblasen war in der Regel für etwa 5-7 Embryonen genug. Da die Mikroblasen sind stabil in der Phiole für 3 h wurden mehrere Fläschchen oft für einen einzelnen Experiment erforderlich. Um Reißen der Gewebe zu vermeiden, war es am besten für die Glasspitze der Injektionsnadel zu scharf sein und schneiden auf einem leichten Winkel bei der Annäherung an das Schiff so klein wie möglich zu einem Winkel. Einmal getrimmt hatte die Spitze der Nadel groß genug sein, damit die Luftblasen leicht durch die Ende fließen, ohne Klumpenbildung, aber klein genug, um leicht in dem Behälter passt. Die ideale Größe war im Allgemeinen <100 um. Einige der Praxis bei der Beurteilung der angemessenenGröße notwendig. In dem Fall, dass die Spitze wurde geschnitten zu groß oder blockiert wurde, wurde eine neue Glasadel aufgebracht. Es einigen Fällen war es möglich, die Nadel leicht oberhalb der Verstopfung zu trimmen. Es war wichtig, dass Luft nicht erlaubt, des Embryos Gefäßsystem während der Injektion geben werden, da dies in der zum Tod des Tieres führen und unerwünscht während der Bildgebung (Luftblasen können im Gefäßsystem des Embryos unterzubringen und sein im Ultraschallbild nachweisbar , künstlich erhöht jede Messsignal). Nichtlineare Kontrastbildgebung in diesem Protokoll durchgeführt verwendet einen Stand der Technik Hochfrequenz (21 MHz) Mikro-Ultraschallsystem (Vevo2100) gepaart mit linearen Arrays speziell für die Kleintierbildgebung (MS250) ausgelegt. Mikro- oder Hochfrequenz -Ultraschall ist einer der wenigen Modalitäten der Lage, in dieser Zeit, um hochauflösende Bilder von lebenden Maus-Embryonen und Neugeborenen 16 liefern. Dieses System kann axiale und laterale Auflösungen von 75 & mgr; m und 165 μ erreichenm jeweils in einer Tiefe so groß wie 15 mm. Es war zu viel höhere Auflösungen als der Regel mit klinischen Instrumente erreicht und das akustische Signal von Mikroblasen kann aus Gewebe mit nichtlinearen Kontrastbildgebungsverfahren (einschließlich Pulsinversion und Amplitudenmodulationsverfahren 24) unterschieden werden deshalb möglich, das gesamte Bild Embryo. Obwohl wir viel Erfolg mit den hier beschriebenen Ultraschall-Einstellungen ist es möglich, dass einige Anpassung an diesen Parametern werden auch zu befriedigenden Ergebnissen. In allen Fällen wird ein niedriger Strom für Mikrobläschen-Abbildungs ​​erforderlich, um eine unerwünschte Zerstörung der Mikroblasen vor der Initiierung eines Bursts zu vermeiden, während die kurzen Burst vermeidet nur einen kleinen Bruchteil der Mikrobläschenpopulation. Mit der Praxis wird das gesamte Verfahren für eine einzelne Embryos aus der Positionierung auf die Vollendung des Molekularultraschallbildgebung, dauerte etwa 15 min. Wir haben erfolgreich bis zu 12 Embryonen aus einem Wurf in spritzteine einzige Sitzung.

Injektionsexperimente wurden einer 4 Stunden Fenster aufgrund der begrenzten Lebensfähigkeit der Embryonen beschränkt. Da die Verteilung der Mikroblasen war abhängig von der Zirkulation der Embryo selbst könnten Injektionen nicht stattfinden, bevor der Herzschlag (E8.5) und nachweisbar Fluss im Dotter und Nabelblutung (E9.5) wurde 25 gegründet. Mit der Reifung der Plazenta erst abgeschlossen, wenn E14.5 wurde die Injektion von Kontrastmittel durch die Plazenta-Labyrinth, um Embryonen von Mitte bis Ende der Schwangerschaftsdauer begrenzt. Basierend auf Beobachtungen waren Embryonen näher tige widerstandsfähiger und konnten Erhöhungen ihres Gefäßvolumen besser als ihre jüngeren Kollegen zu widerstehen. Durch Kombination dieser Faktoren beschränkt kontrastverstärkte Ultraschallbild des embryonalen Gefßsystems zu späteren Stadien der Entwicklung und angiogene Wachstums. Dies kann Auswirkungen auf die Verfügbarkeit von transgenen Mausmodellen, da Manipulationen von Rezeptoren in vasc beteiligtendere die Entwicklung und Wartung (zB VEGFR2, VCAM-1) können embryonale Letalität oder Defekte in der Entwicklung und Regulierung der embryonalen Kreislaufsystem 26,27 führen. Dennoch ist eine Reihe von Modellsysteme sind für vaskuläre Biomarker von Interesse, einschließlich α 2 β 1 28, α v β 3 29, plättchen endothelial cell adhesion molecule-1 30 und das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül-1 31, ICAM verfügbaren -1 32 -2 und 33 und P-Selektin-34. Was mehr ist, beginnt Gehirn Histogenese nach Mitte der Schwangerschaft 11, so dass die Expression von angiogenen Markern in diesem Gewebe wahrscheinlich und damit eine ausgezeichnete Alternative zu den traditionellen Tumor-Modell für Studien zur Bewertung der quantitativen Aspekte der molekularen Bildgebung.

Die ex vivo Art der Injektionen tut präsentieren einige limitations. Es ist wichtig zu beachten, dass, nachdem die Embryonen wurden von der Mutter und der Plazenta Labyrinth punktiert entfernt, war es in der Regel nicht möglich ist (noch wünschenswert ist), um wiederholte Injektionen zu tun. Zusätzlich isolieren die Embryos aus dem mütterlichen Kreislauf begrenzt die Zufuhr von Nährstoffen und O 2, und embryonalen Gesundheit wird erwartet, mit der Zeit verschlechtern. Während Kühlen und Wiedergeburt verlängert die Überlebensfähigkeit der Embryonen, kann es auch Auswirkungen auf die Herzfunktion. Zum Beispiel wurde beobachtet, dass isolierte Embryonen hatte eine reduzierte Herzfrequenz (Daten nicht im Lieferumfang enthalten, siehe Denbeigh et al. 12) im Vergleich zu den bisher in vivo 35 beobachtet. Es ist daher wahrscheinlich, dass die Studien zur Bewertung kardiovaskuläre Physiologie nicht genau in vivo-Bedingungen anzupassen. Mit wenigen Studien Charakterisierung Kreis Hämodynamik im lebenden späten Stadium Mausembryo, jedoch ist es schwierig, mit Sicherheit zu sagen, dass das Ausmaß, in dem diese experimentellen Bedingungen kann ALTer physiologische Funktion. Eine Alternative ist die Injektion in utero zu führen, entweder durch einen laparoskopischen Schnitt 36 oder durch den Bauch der schwangeren Mutter direkt 37, obwohl dieser Ansatz seine eigenen Herausforderungen 11 zu präsentieren. In einigen Fällen kann die Isolierung und Exteriorisierung Embryos können ebenfalls erhebliche Blutung aus dem Dottersack führen. Obwohl wir fanden, dass wir die Durchblutung mit Ultraschall-Gel zu hemmen, könnte eine signifikante Blutverlust die Lieferung und die Konzentration der Mikrobläschen auswirken, und diese Tiere wurden von der Analyse ausgeschlossen. Schließlich, während Isolierung tut Grenze mütterlichen und embryonalen Quellen der Bewegung, ist regelmäßige Bewegung, um die Herztätigkeit im Zusammenhang unvermeidbar. Wir entschieden, das statische Bild Gehirn, um die Wirkung von Rezeptor-Expression auf gezielte Mikrobläschensignal jedoch Implementierung von Echtzeit-bewegungskompensierte kontrastverstärkte Ultraschallbildgebung 38 kann direkt prüfenerweitern diese Studien auf andere Organe.

Es gibt nur wenige Bildanwendungen, die derzeit in der Lage sind, um die vaskuläre Landschaft des lebenden entwickelnden Mausembryo zu beurteilen. Einige Studien haben erfolgreich die Bildgebung des Blutflusses in ex vivo murine Embryonen mit Doppler gepfeilten Quelle optischer Kohärenztomographie 39,40 durchgeführt, während die Kernspintomographie, Gefäßkorrosions wirft, microcomputed Tomographie und optische Projektionstomografie sind Obduktion 16 umgesetzt. Dies ist bedauerlich, da dieser Zeitraum von embryonalen Wachstum entscheidende Informationen über frühe vaskuläre Entwicklung und Funktion zu offenbaren. Mikroblasen-Bildgebung in lebenden Embryonen könnte daher zu unserem Verständnis der Entwicklungsphysiologie beitragen. Es könnte auch verwendet werden, um Biomarker Verteilung im gesamten Körper des lebenden Maus Fötus in Echtzeit sichtbar zu machen, obwohl diese Technik wahrscheinlich nicht existierenden Verfahren zu ersetzen (einschließlich Histologieund Fluoreszenz-Imaging) für die Messung der molekularen Signal in embryonalem Gewebe. Die sich schnell entwickelnde Masse Gefäße in den Embryonen jedoch ähnelt in Tumorwachstum, mit der Expression von vielen der gleichen Schlüsselrezeptoren der Tumorangiogenese 41,42 identifiziert und kann daher als eine ausgezeichnete Tumor Surrogat für Studien, die die quantitativen Fähigkeiten der Molekular dienen Ultraschall. Daher erwarten wir, dass die beschriebenen Verfahren werden nicht nur für die Bewertung und Charakterisierung von embryonalen Modelle der Kreislauf-Gesundheit und Krankheit durch funktionelle Bildgebung, sondern bietet einen Weg für die Erkundung der Stärken und Schwächen der molekularen Bildgebung sowie. Die Anwendung kann auch zu anderen interessanten Untersuchungsgebiete zu erweitern, einschließlich in utero Gentransfertherapie, bei der Mikroblasen wurden als Mittel zur Bereitstellung von nackter DNA zu fetalen Mausgewebe 10 getestet. Alternativ ist auch eine 3D-Kreislauf-Abbildung von lebenden Embryo möglich,was kann wertvolle Informationen in Bezug auf die morphologische Anomalien in gentechnisch veränderten Mäusen liefern. Einführung der Ultraschallkontrastmittel in isolierte lebende Embryonen könnten daher ein weiteres Instrument zur Erhöhung der unser Verständnis von Gefäßerkrankungen und Übersetzung kontrastverstärkte Ultraschallanwendungen in der Klinik sein.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
  • rat isotype IgG2 control
eBioscience 13-4321-85 This antibody/microbubble combination is often required as experimental control 
  • biotin anti-mouse CD309
eBioscience 13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin In house hybridoma Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
  • 500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose
Sigma D5796
  • 50 ml Fetal Bovine Serum
ATCC 30-2020 lot # 7592456
  • Hepes
Gibco 15630 5 ml, 1 M
  • Penicillin-Streptomycin
Gibco 15140-122 5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde Sigma 76240 4%
Phosphate Buffered Saline [1x]  Sigma D8537 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1 Charles River Laboratories Inc. 
0.9% sodium chloride (saline) Hospira 0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm Fisher Scientific 08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm Sigma D8054
Centrifuge Sorvall Legend RT centrifuge 
Conical tubes, 50 ml BD Falcon VWR 21008-938
Diluent Beckman Coulter Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner) Fine Science Tools Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm) Fine Science Tools 11200-33
Forceps, splinter VWR 25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) VWR 89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament Narishige GD-1
Glass needle puller Narishige PN-30
Gloves Ansell 4002
Gross anatomy probe Fine Science Tools 10088-15
Hot plate VWR 89090-994
Ice bucket Cole Parmer RK 06274-01
Imaging Platform VisualSonics Inc. Integrated Rail System
Light source, fiber-optic Fisher Scientific 12-562-36 Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread Cole Parmer 45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency VisualSonics Inc. Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”) VWR 305165
Particle size analyzer Beckman Coulter Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria) Fine Science Tools MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl] Eppendorf Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl] Eppendorf epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32” VWR 63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head) VWR CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification Fisher Scientific Steromaster
Syringes, 1 ml Normject Fisher 14-817-25
Syringes (10), 30 ml VWR CA64000-041
Syringe infusion pump  Bio-lynx  NE-1000
Thermometer, -20-110 °C VWR 89095-598
Timer VWR 33501-418
Tubes, Eppendorf VWR 20170-577
Tube racks (3) VWR 82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz VisualSonics Inc. MS250
Vannas-Tubingen, angled up Fine Science Tools 15005-08

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References

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