と伝達性海綿状脳症種の障壁を評価する

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Johnson, C. J., Carlson, C. M., Morawski, A. R., Manthei, A., Cashman, N. R. Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay. J. Vis. Exp. (97), e52522, doi:10.3791/52522 (2015).

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Abstract

Introduction

伝達性海綿状脳症(TSE、プリオン病)は、動物およびヒトの様々な影響を与える長時間のインキュベーション期間が致命的な神経変性疾患の一群である。 TSEの推定上の病原体は、感染、疾患関連したPrP(PrP Cから)の正常な細胞形態のテンプレート駆動変換によって自己増殖可能な宿主プリオンタンパク質(PrP)のミスフォールド異性体から構成されている感染したホスト1の中枢神経系組織内に蓄積フォーム(PrPのTSE)。感染哺乳類のプリオンは、一般的に種間の伝送イベント2を制限する「東証種の壁」の概念に上昇を与えている種特異的な方法、ホスト·ツー·ホストから送信する。プリオン種の壁の生物学的決定要因はよく理解されていない。感染性プリオンTSEとホストのPrP C cアミノ酸配列類似性強く変換が行わ3-5かかりますインビボ 6,7 観察されたすべてのプリオン伝達事象を説明するには不十分なままであるかどうかに影響を与える。

したがって、TSE種の障壁の特性は、主に動物チャレンジ試験に頼っている:別のプリオンに所定の種からのナイーブ動物を曝露し、伝送効率の指標として、疾患の発症および発病率を生じるインキュベーション時間を測定する。異種の種由来のPrP Cを発現するマウスはまた、試験8のこのタイプのために使用される。トランスジェニックマウスの生産と長引くプリオンバイオアッセイと同様に、動物使用の倫理的配慮に関連するコストは、東証種の壁の実験的調査の障害となっている。 TSEはヒト種の壁の評価は、ヒトPrP Cを発現するように遺伝子操作したマウスに依存しています。これらのマウスは、tに人間のTSEや変更に屈するように長い潜伏期間を必要と彼の迅速な疾患発症9用のヒトPrP C分子 。これらのマウスにおける非ヒトのTSEの潜伏期間は、困難な負の結果の解釈を行う通常のマウスの寿命を越えて延びることができる。非ヒト霊長類は、ヒト種の壁を研究するためのプロキシとして使用されてきたが、これらの研究は、ヒト宿主に進むように、他の動物実験の種類、非ヒト霊長類と同様の課題を正確疾患を再現しない可能性をはらんでいる。

動物のバイオアッセイは、東証への種の感受性を測定するための「ゴールドスタンダード」方式のままであるが、障害物、コストとこれらの生きた動物研究の倫理は、代替案調査を強要している。 PrPのTSEによって播種プロテイナーゼK(PK)耐性状態(PrPの解像度 )にホストのPrP Cの転換を評価することに基づいて、in vitroアッセイの数は、開発され、TSE種を調査するために使用されているECIES障壁10-12。 インビトロアッセイの例は、無細胞転換アッセイ、タンパク質サイクリック増幅(PMCA)のミスフォールディング、および変換効率率(CER)アッセイ10-14を含む。これらのアッセイのいずれも、自然感染した後、種の壁に関与するアカウント末梢要因を考慮しないが、すべてのTSEのための潜在的に感受性のホストを識別することが有用であり得る。

ここでは、正常な脳ホモジネート由来の2つの変性したPrP C基板をベンチトッププリオン転換反応に使用されるCERアッセイのためのプロトコルは、( 1)13 提示する。 pH7.4で変性した基板中のPrP Cは、種の壁14の非存在下での反応中に播種したPrP TSEによってPrPの解像度に変換することができる。対照的に、pHが3.5で他の基板中のPrP Cの変性は、インキュベーション後のPrP 解像度に変換することができ任意の種からのPrP TSEと、変換のためのコントロールとして機能します。 pH3.5の基板とpH7.4の基板の相対中のPrP resはへのPrP Cの転換の比率は種の壁の尺度を提供する。我々は、CERアッセイは、種々のTSEに実験用マウスの既知の種の壁を予測することが見出されており、慢性消耗病(CWD)にオオツノヒツジ、および他のTSE 14を含む多くの哺乳動物種の種の壁を予測するための努力においてアッセイを使用している15。便利なこの方法論を見つける東証種の壁またはPrP Cから-to-PrPの解像度の変換の評価の迅速なスクリーニングを可能なツールに興味を持って研究者。

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Protocol

USGS国立野生生物保健センターで行わ動物の作業は実験動物福祉ガイドラインのNIHオフィスに合わせて、制度的動物のケアと使用委員会プロトコル#のEP080716で行った。狩猟採取した動物からの組織は、ウィスコンシン州、または天然資源のミシガン部門からの贈り物だった。

1.溶液の調製

注:以下に記載されているソリューションは、下記の第2でCERアッセイ基質の製造のために必要とされる。より高濃度のストック溶液からこれらの溶液の各々を準備し;ストック溶液の推奨濃度は、リストされた各それぞれの化学名の後の括弧内に与えられます。使用するまで4℃で基板準備や店舗の際に新鮮なすべてのソリューションを準備します。

  1. 100mMの秒:溶解緩衝液は、10mMトリス、pH7.5の(1 Mトリス、推奨pH7.5のストック溶液)で以下の溶液を調製する憎悪塩化ナトリウム(NaCl、1 Mのストック溶液)、10mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA、500mMのEDTA、pH8.0のストック溶液)、0.5%NP-40(10%ストック溶液)、0.5%デオキシコール酸(DOC、10%ストック溶液)。
  2. 変換バッファは、1リン酸緩衝生理食塩水(PBS、10、pH7.4のストック溶液)、0.05%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS、10%のストック溶液)及び0.5%のTriton X-100(10%ストック溶液)の溶液を調製する。
  3. カオトロピックソリューションでは、1×PBS(10倍原液)における塩酸グアニジン(GdnHCl、8 Mストック)の2つの3 M溶液を調製する。濃塩酸(HCl)を用いて、3.5±0.05の解決策の1のpHを調整する。第2の溶液のpHが7.4±0.05のままであり、必要に応じて、濃HClまたは水酸化ナトリウム(NaOH)を用いて調整することを確認する。

2. CERアッセイ基質ペアを準備

  1. 興味の種から健康的、非TSE感染脳組織を入手し、10%の重量あたりのボリュームを準備ダウンス、ビーズミル、又は乳鉢及び乳棒均質化:次のいずれかの方法を使用して、溶解緩衝液中(w / v)のホモジネート。さらに、シリンジおよび針均質に供する基板を吸引し、27 G注射針を介して容易に排出することができるまで増加ゲージの針を使用して得られたホモジネートを絞り込む。
    1. 齧歯類および他の小型哺乳類から調製基板について、脳全体(複数可)を均質化する。大型哺乳類から調製した基板について、OBEX(脳幹)ホモジネートを準備するための組織を使用しています。脳ホモジネートの量を選択する場合、ステップ2.6において、タンパク質沈殿のために使用される遠心分離器の容量の50%以下を準備していない。
    2. 取得された脳組織の品質は疑問がある場合は、SDS-PAGEおよび免疫ブロット16 17基板の前に準備することによってのPrP Cのレベルを評価する。
  2. 独立したラベルプラスチック製コニカルチューブ内の2つの同等のボリュームに脳ホモジネートを分割。 (GdnHClを追加脳ホモジネートへ1体積比:1の各チューブにpHが3.5または7.4のいずれかで1 P​​BS中の3 Mソリューション)。
  3. 2の溶液のpH値を確認してください。濃HClを使用して0.05​​±pHにpHを3.5基質のpHを調整します。他の基板のpHは7.4±0.05のままで確認し、必要に応じて、必要に応じてHClまたはNaOHでpHを調整する。酸または塩基の賢明な添加によってpH値をオーバーシュート避ける。
  4. 5時間室温(RT)で転倒ミキサーで解決策を回転させます。
  5. 各コニカルチューブ内の基板ソリューションへのメタノールの4つのボリュームを追加することによって、タンパク質を沈殿させ、ボルテックスよく混ぜ、そして16〜18時間、-20℃でインキュベートする。
  6. 4℃で30分間、13000×gで遠心分離により堆積物試料。慎重にデカントし、上清を廃棄し、メタノールはペレットから蒸発させる。チューブの内側にしがみついメタノールを吸収を助けるために綿棒アプリケーターを使用してください。オーバー-DRへのペレットを許可しないyおよびメタノールが見えなくされたら、次のステップに進んでいない。
  7. 変換バッファにおけるタンパク質ペレットを再懸濁する。ステップ2.2において、各チューブに分注し、脳ホモジネートの出発材料の量に等しい変換バッファの量を使用する。
    注:これは、pHが3.5と7.4で処理した基板の製剤の両方からのタンパク質ペレットを再懸濁するために使用する変換バッファは、(洗剤の低レベルと生理的pHを含む)上記のステップ1.2で定義されて解決することが重要です。
  8. cuphorn音波処理で簡単に超音波処理基質溶液(30%最大電力〜10秒)、0.5へのアリコート - ラベル1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ中で1.0mlのボリューム。各基板のアリコートに品質管理イムノブロット(ステップ2.9)を実行します。 CERアッセイ(第4節)を実行する準備ができるまで-80℃で、他のアリコートを保管してください。
  9. 使用前CER基板対( 図2)上の品質管理を行う。これらのステップは、CER基板が提供します:することを保証する変換の研究で、電子最適な結果を得る。
    1. 二枚の基板中のPrP Cの匹敵する量を確認してください。 SDS-PAGE 16およびイムノ17によって各基板の10-25μlの中のPrPレベルを比較。 pHは7.4と3.5の基質中のタンパク質レベルが互いに約10%以内で​​あれば、基板対はCER研究での使用に適している。
      注:PrPのイムノブロットは、大規模なPrP Cから劣化証拠を示すべきではありません。 PrPの免疫反応性は、主> 20kDaのである必要があります。この分子量よりも小さいバンドは分解産物であることができる。バンドパターンは、基板対の間でほぼ同等でなければなりません。
    2. 両方の基質中のPrP Cの PK敏感であるべきであるように、100μg/ mlの最終濃度でPKと、各基板10〜25μLを治療し、サーモシェーカーで1時間、37℃で1,000rpmで試料を消化する。 SDS-PAGE 16およびイムノ17で残りのPrPの信号を評価する。PrPのRESを持つ基板は、CERの研究に使用するために適切ではありません。

3.東証エージェントの種子を準備

  1. 興味の種からTSE感染脳組織を入手し、上記のステップ2.1に記載されている方法を使用して、1×PBS pH7.4の中で10%(w / v)のホモジネートを準備します。
    NOTE:種子はまた、中枢神経系外の他のTSE感染組織から製造することができ、しかし、TSE感染末梢組織に由来する種子による脳由来の基質の変換効率はまだ実験的に公開された文献において評価されていない。
  2. 100へのホモジネート(S)結果の分量 - 直前まで、-80℃で0.5 mlマイクロチューブ内の300μlの体積およびストアはCERアッセイを実行する。

4. CERアッセイ

注:CERアッセイは、ある種から(「シード」で提供される)のPrP TSEの比較的少量の添加を含む部分的にpHが3.5または7.4のどちらかで変性された別の種からのPrP C(非感染脳「基板」で提供される)の相対的過剰に。拡張振盪インキュベーション期間の後、各反応中のPrP TSEによるPrP Cからのテンプレート駆動型の変換は、PrPの解像度の残りのPK消化および免疫ブロット検出後の濃度測定信号によって評価される。以前にpHは3.5 7.4で変性基質中のPrP RESレベルを比較することは、種の壁の尺度を提供する。このアッセイ法の実験の概要を図1に提供される。

  1. ゆっくりと非感染CER基板のペア(アッセイは、以前にpHが3.5と7.4の両方で変性基質の等容量を必要とする)と氷のベッド(約1時間の解凍時間)の上にそれらを配置することによってTSE感染シード·ソリューションを解凍。
  2. 完全に解凍されると、吸引した後、各貫通基質溶液を追い出す27 Gの注射針を数回に再均質化する。簡単に説明すると約30%最大パワーで10秒間各TSE感染シードソリューションを超音波処理。変換反応の準備中に氷の上にすべてのソリューションを保管してください。
  3. ラベルTSEエージェントあたり5個々の低結合、薄壁PCRチューブがテストされている。
  4. pHは7.4で調製(a)はCER基板およびpH 3.5で調製(b)はCER基板の95μlに10%のTSE感染シード溶液5μlを添加することにより、これらのチューブ内変換反応を準備します。
    1. 各実験サンプルについては、以前にpHは3.5と7.4の両方で変性CER基板対における平行反応を準備します。
    2. 経験的決定を通じて感染していない脳の基板へのTSE因子の種の比率を最適化します。共通シード:採用基板比は100μlの総反応容量を維持し、1:99μL、2:98μLと5:95μlのがあります。ほとんどのアプリケーションでは、5:95μlのシード基板の体積比が適当であると目に提示されるものであるプロトコルである。
  5. 次のようにTSE因子ごとに3つのコントロールサンプルがテストされているの準備:(a)の入力のPrP RESのコントロールとして95μlの変換バッファに10%のTSE感染シード溶液5μlを追加します。非特異的、非テンプレートの変換のための対照として(b)のpHは3.5、及び(c)は、pH 7.4で調製95μlの基質を5μlの変換バッファを追加する。
  6. 簡単に言えばよく、種と基板を混合するためにその閉じたPCRチューブに各サンプルをボルテックス。 PCRチューブの蓋の中に閉じ込め、反応混合物の任意のボリュームを削除するには、低速ベンチトップミニ遠心機で瞬間的なパルスで従ってください。
  7. PCRチューブを受け入れるために装備ベンチトップサーモシェーカーに個別に標識PCRチューブで負荷サンプル。 24時間、37℃で1000rpmでサンプルを振る。
  8. 以下(w / v)のおよびPKを、100μg/ mlの最終濃度2%の最終濃度までサルコシルを追加し、振盪。ダイジェストサンプルサーモシェーカーで1時間、37℃で1,000rpmで少なくとも。
    NOTE:PrP CからのPK消化のサンプル変換後のエイズへのサルコシルを添加する。播種していないサンプル(ステップ4.5)において偽陽性シグナルは事実上サルコシルを添加することによって除去される。
  9. 5分間95℃にSDS-PAGE試料緩衝液、熱のサンプルを追加して、17をイムノブロッティング、続いてSDS-PAGE 16により各サンプルの残りのPrP res解決する。
    注:前のイムノブロッティングサンプルバッファーの添加と加熱後、サンプルをすぐに処理してもよいし、サンプルは-20℃で保存するか、または-80℃である。ここに提示されたすべてのデータは、ノベックスNuPAGEゲル及び転送システムを使用して生成された。 CERアッセイからの個々のサンプルがサンプル·バッファと、製造者の指示に従って還元剤で処理した。サンプルは、その後95℃で5分間加熱し、各サンプルの30μlを、12%ビス - トリスプレキャストゲルにロードした。
  10. 対策として、変換効率比(CER)を計算種の壁の。デンシトメ17によるPrPのRESの測定レベルと、pHが3.5試料のそれによってpHが7.4の試料の総密度を分割。パーセントを生産する100で掛けます。
  11. 与えられたTSE因子を有する種の平均CER±標準偏差を生成するために、独立した実験の反復からのデータをコンパイルします。

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Representative Results

CERアッセイの使用の成功は、変換反応に使用される基板のペアの品質に大きく依存する。この理由のために、CER基板対を調製する手順に従い、品質管理イムノブロット( 図2)を実行すべきである。両基板の場合、アッセイ免疫ブロット法によって10〜25μL。 PrP Cからは、各基板において容易に検出可能であるべきとのPrP Cレベルは、2つの間でほぼ同じでなければなりません。免疫反応は、20kDaの上記主に表示されますが、小さいバンドも明らかである。我々の経験では、より小さなバンドの存在は、種に依存します。低分子量の生成物が認められた場合に、それらの存在は両方の基質ペアで確認すべきである。

それは、そのCER基板はPKで基板を処理することにより( 図2)内因性プリオンRESから自由であることを確認することが重要です。 PrPの解像度が存在する場合、動物がでsubstに使用レートの調製は、TSE感染または無症状感染した可能性があります。あるいは、基板中のPrP Cは、変性又は沈殿手順の間にPK耐性の状態にミスフォールドしている場合があります。理由から独立し、PrPの解像度を含むCER基質変換アッセイにおける使用のために許容されない。

実験用マウスは、最も頻繁にTSE研究に実験動物の使用の一つである。など、ほとんどののTSEに対する感受性は、CERアッセイの忠実度をテストするに対するin vivoでのベンチマークを提供し、8十分に特徴付けられている。 図3Aプリオンにマウス(CD1系統)基板からのPrP CからのCERアッセイ変換の結果を示すマウス継代スクレイピーのRML株)1による解像度は 、エージェントは、マウス宿主18、2)国内ヒツジ古典スクレイピー、長い潜伏期間18以下のマウスに送信することができる薬剤、および3)WHIのに適合TE-オジロジカ(Odocoileusのvirginianus)CWDとハムスター継代スクレイピーの263K株、エージェントへの最小限か19,20の影響を受けやすいいるマウス。結果のPrPのRESレベルは、PrP resはは pHが3.5で変性し、TSE因子を播種すべての基板で発見されたときにマウス基板はpH7.4で変性させ、さまざまなTSE病原体を接種し全体にばらつきがあった。 pHの中のPrP resはレベルを比較する変換比が7.4と3.5の基板を独立して少なくとも3回算出し、±SDは、 図3Bに示されていることを意味した。 RMLによって播種反応では、pHは7.4と3.5の基板の間の変換比は約100%であった。スクレイピーによって播種人のために、pH7.4の基板での変換は、pH 3.5基板のそれの約75%であった。 CWDまたはpH 7.4基板の263K誘発の変換が最小限であった。一元配置分散分析は、RMLとsの変換比の違いを見分けることができなかったcrapieまたはCWDおよび263Kは、しかしRMLスクレイピーの転換率は、CWDと263Kのものとは有意に異なっていた。

CERアッセイは、ヒト組織またはバイオアッセイは、倫理的およびトランスジェニックマウスの産生が所望されない難しすぎるかではない動物種での使用に適合させることができる。私たちは、CWDへの様々な野生生物種の感受性を特徴づけるために、このアッセイを使用している。このアッセイの使用例として、 図4のいくつかの予備的な結果を提示する。狩猟閉じ込められたボブキャッツ( リンクスルーファス )から脳がまだのPrP CとPrPの分解生成物の検出可能なレベルでは、これらの示唆、広範囲でなかった含むことがわかった。組織は、CER基板( 図4A)の許容ソースである可能性があります。ボブキャット脳から発生する基板のペアは、適切な分子量のPrPの免疫反応性を示し、内因性プリオンRESが含まれていませんでした( 図4B)。二つの別々の動物から生成されたボブキャットのCER基板対がCWDエージェントは、図3で説明したマウスCERアッセイで使用したのと同じオジロジカとインキュベートしたとき、我々は、PrP 解像度のレベルはpHで調製された基板と比較した、pH7.4で調製した基板を発見CWDによる変換にボブキャットのPrP Cの最小種の壁を示す3.5( 図4C)、。 、ポジティブコントロールとして、以前にMorawski で95.2±18.4%と報告された、ここでボブキャットのPrP Cに変換するために使用されるのと同じCWD分離物によるオジロジカPrP Cからの変換のためのCER。(2013)15。

図1
図1:CERアッセイの実験概要つのアッセイ基板を部分的に非プリオンに感染した脳組織ワット中のPrP Cを変性することによって調製されるpHが3.5またはpH 7.4のいずれかでのi番目のカオトロピックソリューション。基質は、関心のあるプリオンエージェントからのPrP TSEで播種し、実験試料の両方はpH3.5と7.4の基質中のPrP TSEの変換のPrP Cを可能にするために振とうしながら24時間インキュベーションに供される。インキュベーションの後、変換はSDS-PAGEおよびイムノブロッティングによって評価される。信号密度は、デンシトメトリーによって読み取られ、CERは、pH 7.4にpHを3.5各実験サンプルの信号密度の比によって計算される。

図2
図2:CER基板上の品質管理。 (A)CERアッセイにおけるそれらの使用の前に、pHが7.4または3.5のいずれかで調製したマウスの基板を各基板対のPrP Cの含有量を評価するために、PK処理の1)の非存在下で免疫ブロットによりアッセイ(のPrP Cレベルの間で同等であるべきであるpHは7.4と3.5 substra CERアッセイにおける使用のためのTES)及びPKの2)の存在下(100μg/ ml)を基質を調製するために使用される組織における既存のPrP 解像度をテストするための処理(既存のPrP 解像度を表示する任意の基質がでの使用に適していないCERアッセイ)。(B)変換アッセイ中の非特異的なPrPの解像度の形成のためにテストするには、pHが7.4または3.5のいずれかで調製したマウスのPrP Cの基質は、37℃、1,000rpmで24時間振盪し、変換バッファを播種する、その後PK処理(100μg/ ml)および(右に2レーン)をイムノブロッティングによってPrPの解像度についてアッセイした。非振盪非PK処理したマウスの基質はアッセイ反応(左二車線)の総のPrP Cの含有量を表す。 (B)については、無関係のレーンは、明確にするためにトリミングされているが、各免疫ブロットのパネルは、同じゲル、膜および暴露に由来する。すべてのパネルでイムノブロットは、SAF 83モノクローナル抗体を使用していました。

"> 図3
図3:実験用マウス基板を用いたCERアッセイ pHが7.4または3.5のいずれかで調製された(A)マウスCERアッセイ基質がRMLのマウス適合スクレイピー、国内の羊の古典的スクレイピー、オジロジカ慢性消耗病(CWD)または263Kとインキュベートした CERアッセイにおけるハムスター適応スクレイピー株。対照試料は、(ラベル「なし」)のみ感染性因子の等量のないマウスの基板を含んでいた。サンプルは各レーンの下に表示され、各サンプルのモノクローナル抗体SAF 83生濃度測定値とのイムノブロットによるPK耐性プリオンタンパク質(PrP resは )の存在について分析した。(B)棒グラフは平均比率を示す(±標準偏差)少なくとも3つの独立したアッセイの実行に基づいて、各感染性病原体のためのpHとの間の7.4と3.5のマウス基板。小文字は、統計的にを参照してください。均質な部分集合(テューキー·クレーマー最小有意差が法による分散分析; P <0.05)。この図は、Morawski から変更されている。201315。

図4
図4:既存のPrP Cを評価するためにボブの脳ホモジネート(A)及びCERアッセイ基質(B)は、PK(100μg/ ml)の非存在下および存在下でのイムノブロッティングにより試験したCWDにボブキャット感受性を調査するCERアッセイのサンプル·ユースそれぞれのレベルと既存のPrP 解像度の存在下、(C)、ボブキャット基板は(二車線の左側)変換用緩衝液で播種し、非特異性のPrP resは形成を評価するために、CERアッセイでアッセイした。非振盪し、非PKは、ボブキャット基質はアッセイ反応(右の2車線)の総のPrP Cの内容を表す処理された。pHが7.4または3.5のいずれかで調製された(D)ボブキャット基板はCERアッセイを用いてオジロジカのCWDとインキュベートした。対照試料は、(ラベル「なし」)CWD剤の等量が、無ボブキャット基板を含んでいた。各サンプルについての生の濃度測定値は、各レーンの下に表示されます。すべてのパネルでイムノブロットは、ネコプリオンタンパク質21と反応するモノクローナル抗体3F4を、使用。

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Discussion

このプロトコルが正常に完了するために、注意が基板準備(ステップ2.1.2)と、変換反応(ステップ4.4.2)用の比率を基板へのシードに使用する非感染脳組織中のPrP Cレベルに支払われるべきである。我々の経験では、脳は、限りのPrP Cは、免疫ブロット法( 図4)によって存在するように、かなりの期間、死後後CER基板として使用するために抽出することができる。実際には、いくつかの自己消化は、CER研究のために使用ボブキャットの脳で観察された。それにもかかわらず、これらの脳から誘導された基質のインキュベーションは、依然としてのPrP resは形成された。我々は、部分的には、CERアッセイのロバスト性は、多くのプロテアーゼを不活性化する、1.5M GdnHClでCER基質の変性に由来する、と推測している。

比率を基材へのシードは、免疫ブロット法により許容さPrPのRES信号を得ることが経験的に決定する必要があるかもしれない。あまりまたはL基質比:ittleのPrP resは、基板と矛盾変換比がシードを最適化するためのすべての理由である欠く対照試料中の濃度測定、高いバックグラウンドのPrP 解像度レベルを実行する。バリエーションは、100μlの総反応容量を維持し、1:99μlを、2:98μLと5:95μlのがあります。基板の体積比が最適である:ほとんどすべての機会に、私たちは5:95μlの種子があることを見出した。どんなに採用されているものの比率、TSE因子の同量は使用されませんし、アッセイは、内部的に一貫している。ただし、テンプレート反応に使用されるプリオン感染脳ホモジネートの種濃度は、おそらくその変化シード力価または希釈液中でCERアッセイの結果はPrP Cから-to-PrPの解像度の変換のレベルを変えることにつながる可能性が影響します。この効果は、 インビトロでのプリオン変換アッセイ22 他に実証されている、別のプリオン分離株の比較を複雑にするかもしれない。 CERアッセイにおいてこれに対処するために、種子cはPrP Cから変換をテンプレート希釈液の範囲を特定するためにpHを3.5と7.4で調製した各PrP Cから基板に滴定されるウルド。理想的なシード希釈を過剰シードプリオンの溶液の飽和を回避し、まだ変換反応の感度への洞察を提供する。代替的に、CERのアッセイ反応中のPrP C -to-PrPの解像度変換は、(リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応のための読み出しに類似し、アッセイの期間にわたって、複数の規則的な時点で測定し、レートの変換曲線としてプロットすることができ定量PCR)23とリアルタイム震え誘発性転換(RT-QuIC社)24アッセイ。このような読み出しは、種の壁をより包括的に解釈を可能にし、この方法論の将来の発展の興味深い焦点である可能性があります。

ここで紹介するプロトコルでは、我々は低結合、薄壁PCRチューブを使用しますが、我々はまたのために装備サーモシェーカーで標準1.5ミリリットルのチューブを使用していたチューブのこのタイプ。プロトコルの他のバリエーションは、より大きなサイズのチューブを使用するために必要ありません。我々の経験では、しかし、我々はより多くのPrP resは生産、1.5 mlチューブに比べて低結合性PCRチューブで、より再現性のある結果を持っていた。 PCRチューブにおけるアッセイの改善された性能のために説明を空気-水界面でのPrP線維25のために重要であることを示す結果に基づいて、この時にのみ、投機的であるが、我々は、小さなチューブがPrPのためのより最適な表面張力を提供するという仮説を立て変換。

おそらく、CERアッセイの使用にチーフ制限は、変換比がこのような疾患の浸透度や潜伏期間の長さなどの生体内種の壁の決定要因、の面で何を表しているか理解している。現時点では不明ながら、 インビトロおよびインビボでの種の壁要因間の変換は、テストADDITにおけるCERアッセイの継続的使用とより明確になる必 ​​要があります既に生体内で確立されており、バイオアッセイのデータが入手できない種で結果を修飾するのに役立ちますional東証種の壁。 PMCAに比べCERアッセイの利点は、任意のTSE因子によって変換することができるPrPの変換、すなわちpH3.5の基質、内部統制の存在である。それがもしあれば、TSEエージェントはエキゾチックなホストのPrP Cからの誤った折り畳みを引き起こすべき、不明である場合、このコントロールは価値がある。 PMCA特定のTSE因子を増幅するための特定のホスト基板のできないことは、種の壁の証拠として解釈することができ、または技術的欠点に起因する可能性がある。 PMCAに比べCERアッセイの欠点は、PrP resは 、CERの基板準備で追加のステップとCERの反応によって生成PrPのRESで知られていない感染性の増幅を制限などがあります。それは、PrP resは foの同様のパターンが得られた以前の研究では、しかし、我々はCERアッセイを見つけたことに留意すべきであるPMCA 15とrmation。ここに示された結果はまた、CERアッセイが正確に実験用マウス( 図3)に対する種々のTSEの送信のために種の壁を予測することを示し、ボブキャット、そのイエネコ(報告と一致し、CWD( 図4)フェリスに感受性を有し得ることを示唆するカトゥスは、実験CWDチャレンジ26,27後プリオン病を取得することができる。 CERアッセイを用いた研究は、CWD 28に野生生物の感受性を理解するためのPrPのシーケンシングの努力を補完することができます。

CERアッセイは、in vitroでの TSEの種の壁の信頼できる評価を迅速、低コストを可能にする。動物のバイオアッセイの「ゴールドスタンダード」のための完全な代替されていないが、CERアッセイは、生きた動物でのさらなる研究を正当化するか、未然に防ぐことが東証種の壁の存在の初期評価として使用することができます。このため、このアッセイは、依存しているため非実験動物から取得することができる脳組織で、CERは、動物実験手順29を交換回数の削減、改善に向けた取り組みと一致している。ミスフォールド形態の通常の機能性のPrP Cの転換:種の壁を評価することに加えて、CERのアッセイはまた、プリオン病の生物学を定義する基本的なイベントのメカニズムを調査すると単純化されたプラットフォームを提供することができる。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Bis-Tris SDS-PAGE gels Life Technologies NP0342
0.5 mm Zirconium oxide beads Next Advance ZROB05 Other varieties of beads are also effective
Antibodies various suppliers Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest
Bead homogenizer Next Advance BBY24M
Centrifuge Beckman Coulter 369434 High speed with temperature control
Conical tubes any brand
Cotton-tipped applicator Uline S-18991
Cuphorn sonicator Heat Systems-Ultrasonics W-380 Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC
Densitometry software program UVP Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software Other programs, such as NIH ImageJ, will also work
Dounce homogenizer Kimble Chase 885300
End-over-end mixer Labnet International H5600
Ethylenediaminetetra acetic acid Boston Bioproducts P-770 Hazardous chemical: eye irritation
Guanidine hydrochloride, 8 M Thermo Fisher Scientific 24115 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation
Heating block Fisher Scientific 11-718
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 435570 Hazardous chemical: strong acid
Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x Life Technologies NP0008 Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid
Methanol Fisher Scientific A454-4 Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid
Microcentrifuge tubes any brand
Mini-centrifuge Labnet International C1301
N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) Sigma-Aldrich  L-5125 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage
Nonidet P-40 Amresco M158 Hazardous chemical: skin irritation, eye damage
SDS-PAGE gel system Life Technologies NuPAGE electrophoresis system Other SDS-PAGE systems will also work
PCR tubes (low-binding) Axygen PCR-02-L-C
Pestle homogenizer Fisher Scientific 03-392-106
pH meter Sentron SI600
Polyvinyldifluoride membrane Millipore IPVH00010
Proteinase K Promega V3021 Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity
Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x Life Technologies NP0009
Sodium chloride Fisher Scientific 7647-14-5
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich  D6750 Hazardous chemical: acute toxicity
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 28364 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 Hazardous chemical; strong base
Syringe BD Biosciences various Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized
Syringe needles BD Biosciences various
Thermoshaker (PCR tube shaker) Hangzhou All Sheng Instruments MS-100
Tris base Bio Basic 77-86-1 Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation
Triton X-100 Integra Chemical Company T756.30.30 Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation
Vortexer Fisher Scientific 12-812

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