المدى الطويل حيوي داخلي Multiphoton المجهر التصوير من الخلايا المناعية في السليمة والمريضة الكبد عن طريق الفئران CXCR6.Gfp مراسل

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., Ergen, C., Kohlhepp, M., Mossanen, J. C., Schneider, C., Vogt, M., Tolba, R. H., Trautwein, C., Martin, C., Tacke, F. Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice. J. Vis. Exp. (97), e52607, doi:10.3791/52607 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التهاب الكبد كرد فعل على الإصابة هي عملية ديناميكية للغاية تنطوي على تسلل فرعية متميزة من الكريات البيض بما في ذلك حيدات، العدلات، T مجموعات فرعية الخلايا، والخلايا B، القاتلة الطبيعية (NK) والخلايا NKT. intravital المجهري للكبد لرصد هجرة الخلايا المناعية هو تحديا من نوع خاص نظرا لمتطلبات عالية فيما يتعلق إعداد العينات وتثبيت، القرار البصرية وبقاء الحيوان على المدى الطويل. ومع ذلك، ويمكن أن ديناميات العمليات الالتهابية وكذلك دراسات التفاعل الخلوية توفير المعلومات الهامة لفهم أفضل للبدء، تقدم وتراجع أمراض الكبد التهابات. لذلك، أنشئ طريقة حساسة للغاية ويمكن الاعتماد عليها لدراسة الهجرة وخلية خلية التفاعلات الخلايا المناعية المختلفة في الكبد الماوس على مدى فترات طويلة (حوالي 6 ساعات) من خلال حيوي داخلي ثنائي الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر (TPLSM) في تركيبة مع العناية المركزة الرصد.

والأنف والحنجرة "> طريقة المقدمة يتضمن إعداد لطيف وتثبيت مستقر الكبد مع الحد الأدنى من اضطراب في الجهاز، التصوير حيوي داخلي المدى الطويل يستخدم متعدد الألوان multiphoton المجهري مع عمليا أي photobleaching من أو التأثيرات الضوئية على مدى فترة زمنية تصل إلى 6 ساعات، مما يتيح تتبع من مجموعات فرعية الكريات البيض محددة؛ وشروط التصوير مستقرة بسبب مراقبة واسعة من الماوس المعلمات الحيوية واستقرار الدورة الدموية، درجة الحرارة وتبادل الغازات.

للتحقيق في الهجرة اللمفاويات على التهاب الكبد CXCR6.gfp الضربة القاضية في الفئران تعرضوا للتصوير الكبد حيوي داخلي في ظل ظروف خط الأساس وبعد تلف الكبد الحاد والمزمن الناجم عن حقن داخل الصفاق (ق) من رابع كلوريد الكربون (لجنة علم المناخ 4).

CXCR6 هو مستقبلات chemokine أعرب عن الخلايا الليمفاوية، وذلك أساسا على الطبيعية القاتل T (NKT) - القاتلة الطبيعية (NK) - ومجموعات فرعية من الخلايا الليمفاوية T مثل خلايا CD4 T ولكن أيضا associ المخاطيةated ثابتة (مائت) خلايا تي 1. في أعقاب نمط الهجرة وتحديد المواقع من CXCR6.gfp + الخلايا المناعية يسمح نظرة مفصلة في سلوكهم تغير على اصابة الكبد، وبالتالي مشاركتهم المحتملة في تطور المرض.

Introduction

لقد كان التصور من الخلايا والوظائف الخلوية في أجهزة كاملة أو الكائنات حتى كلها ذات أهمية كبيرة لأكثر من 50 عاما، بما في ذلك كل أجزاء الجسم 2. لذلك، فإن بعض الدراسات المبكرة استخدمت بالفعل التصوير حيوي داخلي في الكبد 3،4. ومع ذلك، توجد العديد من القيود على آخر المستجدات المتعلقة المدى الطويل عالية الدقة مستقر التصوير من أنسجة الكبد.

بسبب موقف التشريحي للكبد في اتصال وثيق مع الحجاب الحاجز والجهاز الهضمي والمشكلة الأكثر شيوعا للتصوير حيوي داخلي المجهري هي الحركة بسبب التنفس، وإلى حد أقل، تحوي من الأمعاء 6. وبالمقارنة مع الأجهزة الصلبة الأخرى، وجراحة الكبد هي تحديا من نوع خاص. نظرا لهيكل الاوعية الدموية الدقيقة كثيفة، يمكن التلاعب الجراحية تؤدي إلى آفات النزفية واسعة النطاق، وضعف دوران الأوعية الدقيقة وكذلك تفعيل المقيمين طخلايا مناعية مثل خلايا كوبفر 8. ولذلك، التثبيت الميكانيكي للأنسجة كما نشرت في أماكن أخرى 6،9 من المحتمل أن تتداخل مع التصوير intravital المجهري.

في كبد صحي، 10-15٪ من حجم الدم الكلي يكمن داخل الأوعية الدموية والكبد، والجهاز يستقبل حوالي 25٪ من النتاج القلبي العام 10، مما يجعل الجهاز عرضة للتغيرات في الدورة الدموية (على سبيل المثال، وتقلبات ضغط الدم ). ولذلك، فإن اضطرابات في تدفق الدم الكبدي بسبب مثل إجهاد القص، والتشرد، والإصابة التي كتبها معالجة الأنسجة المفرط أو تداول مركزية تؤدي إلى تغيرات مصطنعة في الكريات البيض سلوك الهجرة، الأوكسجين الكبد وضعف، وبالتالي المزيد من تلف الكبد، مما يؤثر على الكبد الاستجابات المناعية وكذلك كما الحفاظ على الجهاز والوقت حياة الشامل للحيوان.

واستندت الدراسات المجهرية في وقت مبكر على ميل epifluorescence حيوي داخليcroscopy، ولكن العديد من المعوقات الفنية مثل تبيض الصورة وعمق الاختراق المنخفض تحد من استخدام هذه التقنية لتصوير الكبد على المدى الطويل 4،11،12. مع تطور المجهر multiphoton في 1990s، تم حل القيود المفروضة على الصورة تبيض أو عمق الاختراق بشكل رئيسي، كما كان هذا الأسلوب الجديد قادر من الناحية الفنية لإجراء دراسات التصوير في تقريبا جميع الأجهزة تحت مواقف الحياة الحقيقية 13-15. ومع ذلك، كانت التحديات الرئيسية المتبقية فيما يتعلق التصوير الكبد: حركات التنفس، وتألق ذاتي من أنسجة الكبد، وتأمين تدفق الدم دون تغيير في الجيوب الكبدية، والتصوير مستقر وخاصة لفترات أطول من عدة ساعة 16.

على الرغم من أن العديد من الدراسات تناولت وظيفة والهجرة من مختلف الكريات البيض في الكبد 17، على سبيل المثال، NKT خلايا 18-20، وخلايا T 21،22، 23،24 الضامة الكبد أو العدلات 25، المدى الطويل multiphoton ملم يتم بعد إنشاء التصوير icroscopy بنجاح، وهي مهمة أكثر صعوبة في الحيوانات مع مرض الكبد الحاد أو المزمن بسبب الأضرار الموجودة وبالتالي ارتفاع قابلية لمزيد من الضرر 26. ومع ذلك، ومراقبة سلوك الهجرة وظيفة الخلوية من الكريات البيض في الكبد في الوقت الحقيقي يتيح رؤى جديدة في دورها معين في التوازن الكبد ومرض 27.

يتم التعبير عن CXCR6 مستقبلات chemokine على عدة مجموعات فرعية لمفاوية، بما في ذلك القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا، والخلايا NKT وبعض السكان الخلية T 18،28. وقد أشارت الدراسات السابقة في الفئران التي CXCR6 وCXCL16 يجند لها وما شابه ذلك قد السيطرة على الدوريات الخلايا NKT على الجيوب الكبد خلال التوازن. ونتيجة لذلك، وقد وصفت استخدام الفئران CXCR6.gfp (يحمل في المغلوب من البروتين الفلوري الأخضر [GFP] في موضع CXCR6) للتحقيق في الهجرة من الخلايا الليمفاوية في مختلف أجهزة مثل الدماغ 29وكذلك الكبد 18،20، والتي تبين زيادة تسلل خلايا CXCR6.gfp على الالتهاب.

مع أسلوب المقدمة في هذه الدراسة كان من الممكن أن تتبع هذه العمليات على مدى فترة طويلة من الزمن في ظل ظروف مستقرة. يسمح الإجراء multiphoton حيوي داخلي يستند التصوير التي كان استنساخه للغاية مع الحد الأدنى من اضطراب الحيوان والجهاز. الأمثل لبقاء الحيوان على المدى الطويل من خلال رصد واسعة تليها مراقبة وثيقة من التنفس والدورة الدموية. ومرنة للغاية وسهلة تعتمد أيضا على أجهزة متني أخرى مثل الكلى أو الطحال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: وأجريت التجارب وفقا للتشريعات التي تحكم الألماني الدراسات على الحيوانات في أعقاب "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" (منشورات NIH، الطبعة 8، 2011) والتوجيه 2010/63 / الاتحاد الأوروبي بشأن حماية الحيوانات تستخدم لأغراض العلمية (الجريدة الرسمية للاتحاد الأوروبي، 2010). تم منح إذن رسمي من الحكومة رعاية الحيوان واستخدام المكتبي (LANUV نوردراين فيستفالن، ركلينغاوسين، ألمانيا).

ملاحظة: الخطوات التي يمكن حذفها للتصوير على المدى القصير (على سبيل المثال المفاجئة الطلقات، مداخن 3-D أو أيضا مدة قصيرة الوقت الفاصل بين المجهري) يتم وضع علامة مع النجمة (*) للحد من الوقت اللازم لإعداد وتبسيط البروتوكول الجراحي. ويمكن أيضا أن يؤديها التصوير دون رقابة رصد وتداول واسعة النطاق إذا لزم الأمر، ومع ذلك، سيتم تخفيض الوقت البقاء على قيد الحياة بشكل ملحوظ.

1. إعداد المجهر وجراحة قبل إعداد (5-10 ميلن)

  1. نظام التبديل على (المجهر، مختبر السلطة، ليزر، وسادة التدفئة، وغرفة المناخ، وكاميرا ويب، جهاز ضخ حقنة، التنفس).
  2. ربط O 2 العرض لالأيزوفلورين بخار وتعيين مستوى الأيزوفلورين إلى 1.5٪ المجلد (ت / ت)، وربط لجهاز التنفس الصناعي الحيوانات الصغيرة.
    1. للتصوير على المدى القصير، والحفاظ على التخدير باستخدام الأيزوفلورين إلا بعد الأولي للتحريض التخدير IP (راجع الخطوة 2.2). ثم استخدام 2 المجلد٪ (ت / ت) الأيزوفلورين، والحفاظ على وقت التصوير أقل من 2 ساعة لضمان استقرار دوران الأوعية الدقيقة في الكبد.
  3. ضبط التنفس إلى 120-140 دورات التنفس / دقيقة مع حجم 150-200 ميكرولتر.
  4. إعداد مرحلة الماوس الاغاروز. إعداد 100 مل من 3٪ (ث / ت) الاغاروز، وسكب عليه في طبق (حوالي 10 سم × 15 سم القاعدة) في زاوية من 40 درجة.
  5. اقامة منطقة العمل الجراحي جمع الأجهزة المطلوبة. لمنع العدوى الميكروبية، وتطهير الأدوات باستخدام محلول 1٪ من Sekusept فورت S (9.9٪ ث / ت)، غلوتارال 9.8٪ ث / ت، الفورمالديهايد لمدة 5 دقائق قبل التجربة (الشكل 1A).
  6. الحصول على المكونات المتبقية: مطهر الجلد (على سبيل المثال، 10٪ محلول البوفيدون اليود)، ومرحلة الكبد (مداخن والجسر)، والحل الاغاروز (3٪ (ث / ت) في PBS)، ضخ حقنة مع 5٪ (ث / ت) حل الجلوكوز (G-5)، ضخ حقنة مع الحل مخدر I (الكيتامين 0.1 ملغ / مل، زيلازين 0.5 ملغ / مل، الفنتانيل 5 ميكروغرام / مل)، ومسحات القطن، ن بوتيل-2-Cyanoacrylat، وبرنامج تلفزيوني 1X. وضع طبق مرحلة الاغاروز إلى غرفة الحضانة لالتسخين.

2. القصبة الهوائية (10-15 دقيقة)

  1. استخدام C57BL / 6 الفئران من المنزل في تربية وزنها 25-28 ز. بيت الفئران في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة وفقا للمبادئ التوجيهية FELASA، في و للحرارة البيئة التي تسيطر عليها الرطوبة مع 12 ساعة ضوء / 12 ساعة دورة الظلام. تسمح الحيوانات حرية الوصول إلى النظام الغذائي العادي الفئران (الشمة ستاندرد القوارض الدايت) والمياه الإعلانية libitum.
  2. تخدير الماوس عن طريق الحرف الأولالاتحاد العالمي للتعليم داخل الصفاق (IP) حقن 250 ميكرولتر من محلول مخدر II (الكيتامين 0.1 ملغ / مل، زيلازين 1 ملغ / مل، البوبرينورفين 10 ميكروغرام / مل).
    1. * للصيانة خلال التصوير حيوي داخلي وإدارة باستمرار حل مخدر I عن طريق الحقن الملكية الفكرية المستمر (الكيتامين 0.1 ملغ / مل، زيلازين 0.5 ملغ / مل، الفنتانيل 5 ميكروغرام / مل) باستخدام جهاز ضخ حقنة مع معدل تدفق 0.2 مل / ساعة في بالاشتراك مع inhalative الأيزوفلورين 0.5 المجلد٪ (ت / ت).
    2. تحقق من ردود الفعل بعد 5 دقائق (مثل قرصة وسادة القدم مع ملقط)، وتطهير الجلد لالقصبة الهوائية، وبدء التحضير إذا الفأر هو في حالة التخدير الجراحي متسامحة.
    3. تطبيق كريم العين واقية (على سبيل المثال، ديكسبانتينول 50 ملغ / غ) لمنع القرنية من الجفاف (الشكل 1B).
  3. يحملق الماوس على إعداد جدول فضح الجانب البطني باستخدام شريط لاصق لالأطراف. تنهك بلطف الرقبة، يحملق في هذا الموقف، على سبيل المثال، باستخدام الشريط المطاطي مدمن مخدرات رس القواطع.
    1. تطهير الجلد والفرو باستخدام محلول اليود البوفيدون، من خلال تطبيق مطهر مع مسحة القطن.
  4. أداء قطع الجلد الأولي (0.5-1 سم طول) أدناه الذقن مباشرة (الشكل 1C)
    1. تشريح بعناية النسيج الضام بين الغدد اللعابية (الشكل 1D).
    2. المسيل للدموع بعناية مفتوحة العضلات المحيطة أنبوب القصبة الهوائية (الشكل 1E، F).
  5. وضع موضوع الجراحي تحت القصبة الهوائية لاحق أنبوب التهوية تثبيت (الشكل 1G).
    1. فتح القصبة الهوائية مع مقص الصغرى بين حلقات الغضروف إجراء شق على شكل حرف T (الشكل 1H)
  6. وضع أنبوب التهوية إلى القصبة الهوائية من خلال شق (~ 0.5 سم). لدفع أنبوب إلى الأمام، والاستيلاء على نهاية الذيلية مع ملقط التشريحية الصغيرة ودفع بلطف أنبوب في القصبة الهوائية (الشكل 1I)
  7. يحملق أنبوب مع موضوع الجراحية (على سبيل المثال (الشكل 1J، K).
  8. ختم قطع مع الغراء الأنسجة (على سبيل المثال، ن بوتيل-2-Cyanoacrylat) (الشكل 1L).
  9. يحملق أنبوب على رأس باستخدام شريط لاصق.

3. Laparatomy (15-20 دقيقة)

  1. ضع الماوس على وسادة التدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم. حلق البطن، إزالة بعناية الشعر من الجلد. تطهير الجلد والفرو حلق باستخدام محلول البوفيدون اليود.
  2. إجراء خفض أدناه القص باستخدام مقص جراحي (الشكل 2A) الجلد صغير. تمديد خفض أفقيا تحت الأضلاع لكلا الجانبين، كية جميع الأوعية الدموية واضحة لمنع النزيف.
  3. أداء بعناية قطع صغيرة في ألبا الخط تحت القص، وفتح الغشاء البريتوني (الشكل 2B). تمديد خفض لكلا الجانبين باستخدام cauterizأوجه لمنع النزيف (الشكل 2C، D).
  4. ضع الماوس إلى الاغاروز طبق المرحلة (الشكل 2E). وضع أكوام من الارتفاع المناسب على كلا الجانبين من الماوس (عادة 12-14 زلات الغطاء) (الشكل 2F).
  5. ضع الجهاز التنفسي استشعار الزناد تحت أعلى الظهر لمزامنة المجهر مع التنفس. تفعيل وحدة الزناد (الشكل 2G).
  6. وضع موضوع الجراحي (5-0) من خلال القص لسحب الأضلاع (الشكل 2I).
  7. قطع بعناية الرباط الذي يربط الكبد والحجاب الحاجز (المنجلي الرباط)، وكذلك الكبد والجهاز الهضمي المسالك باستخدام مقص جراحي منحنية. قطع في الرباط المنجلي وصولا الى الشريان الأبهر (الشكل 2J).

4. إعداد نموذج (10-15 دقيقة)

  1. ضع الماوس على الجانب الأيمن مع بزاوية 45 درجة لسهولة الوصول إلى الفص الكبد واسع.
  2. إضافة جسر تنظيم تحت الأضلاع، الذي يغطي البطنتجويف. تصنيع جسر باستخدام غطاء زلة القياسية مع شريط لاصق الطلاء لتغطية حواف حادة (الشكل 2K).
  3. وضع الفص الكبد كبير على خشبة المسرح. زلة بعناية كروي مزدوج قلم التحقيق أو ملعقة مبطن أسفل الكبد مع الاستمرار على رأس الجهاز باستخدام قطعة من القطن مبللة أو الأنسجة الرطبة. رفع الفص على الشريحة وتطبيق السحب لطيف. الفص يمكن أن تكون عازمة أو مطوية. توفير المزيد من الحيطة لطيف فقط التلاعب في الكبد (الشكل 2L).
  4. ضع دعم الوحشي المخاطر، على سبيل المثال، أكوام من زلات صغيرة غطاء (20 ملم × 20 ملم)، ما يقرب من نفس الارتفاع من الفص الكبد بجانبه لدعم تغطية زلة.
  5. ضع زلة غطاء كبير (24 ملم × 50 ملم) على الفص الكبد. تأكد من أن غطاء زلة موجه كما الأفقي ممكن (الشكل 2M).
    ملاحظة: يجب أن يكون زلة تغطية على اتصال مع الأنسجة دون الضغط عليه. التحقق من وجود علامات واضحة على ضعف تدفق الدم (الأنسجة البيضاء). إذا microcircتعطل ulation، إضافة مزيد من دعم حصص.
  6. * مكان اثنين من القسطرة داخل الصفاق المستقلة (الشكل 2N) للتخدير المدى الطويل وG-5 التطبيق. تثبيت القسطرة أفقيا في الجزء الأسفل من البطن بالقرب من أطرافه الخلفية.
    ملاحظة: يمكن للالقسطرة داخل الصفاق يكون من خلال ربط الإبر 27 G مع مرونة أنابيب السيليكون (الشكل 3) من صنع الذات.
  7. * يحملق إبرة مع حلقة من 5-0 موضوع الجراحي للجلد لتجنب النزوح عرضي.
  8. * إرفاق ضخ حقنة مع حل التخدير I لقثطار 1، تعيين معدل التدفق إلى 0.2 مل / ساعة. إرفاق ضخ حقنة مع G-5 لقسطرة 2، تعيين معدل التدفق إلى 0.1 مل / ساعة.

5. رصد ماوس

  1. * أقطاب مكان ECG إلى الأمام والأطراف الخلفية (الشكل 4A).
  2. * إرفاق أنابيب انتهاء إلى CO 2 استشعار مستوى.
  3. إضافة جهاز استشعار درجة الحرارة الخارجي المتصل سادة الحرارة (الشكل 4C).

6. تضمين وتثبيت الأنسجة (5-10 دقيقة)

  1. إعداد 100 مل من 3٪ (ث / ت) الاغاروز في برنامج تلفزيوني 1X. تضمين الكبد عندما تكون درجة الحرارة في 41 ° C باستخدام حقنة 5 مل و 18 G إبرة (الشكل 5A).
  2. صب المتبقية الاغاروز على ساترة وحول الماوس (الشكل 5B، C). انتظر حتى يتم مهيلم الاغاروز بالكامل.
  3. إزالة الاغاروز الزائد باستخدام ملعقة هايدمان، وإعداد viewfield كبيرة بما يكفي لمسح الفص الكبد إعداد (الشكل 5D، E).

7. التصوير

  1. نقل الماوس إلى غرفة المناخ المجهر.
  2. إضافة 50-100 مل من برنامج تلفزيوني 1X (مسخن على 37 ° C).
  3. تغطية صحن عينة لمنع التبخر (الشكل 5F).
  4. * تصغير الأيزوفلورين inhalative إلى 0.5٪ المجلد (ت / ت).
  5. * ابدأ برنامج مراقبة وتسجيل تخطيط القلب، معدل ضربات القلب وCO 2 الزفير.
  6. بدء تصوير: فتح لامصاريع سر، وتحديد جهة نظر المجالات ذات الاهتمام، وتحديد الحدود العليا والدنيا للZ-مداخن، وبدء تسجيل مرور الوقت. تعدل Z-مداخن إذا لزم الأمر لتصحيح Z-الانجراف (على سبيل المثال. نظرا للتغيرات في ضغط الدم أو درجة حرارة تذبذب، الشكل (5G).
    ملاحظة: بعد الانتهاء من فترة التصوير أو إذا كان التداول أو تخدير الحيوانات يصبح غير مستقر، التضحية الفئران عن طريق خلع عنق الرحم (بدون الصحوة من التخدير).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

للتحقق من صحة نهج TPLSM حيوي داخلي لدينا، وتعرض CXCR6 GFP / + الفئران لتصوير TPLSM حيوي داخلي. تم الفئران يقم إما غير المعالجة والضوابط الأساسية أو تعرض لحقن داخل الصفاق واحد من رابع كلوريد الكربون (لجنة علم المناخ 4) للحث على تلف الكبد الحاد 20.

اتخذت تسلسل الفيديو عبر فترة زمنية من 2-5 ساعة، وكانت تتبع الخلايا مع مرور الوقت بسبب مضان الخضراء. لإظهار الحركة الخلوية العامة، تم رسم جميع المسارات التي تم الكشف عنها أثناء إجراء كصورة فرضه (الشكل 6A). في حين أن الخلايا تحت ظروف خط الأساس وأظهرت الهجرة لمسافات طويلة على طول الجيوب الكبد نحو الوريد المركزي، 18 ساعة بعد لجنة علم المناخ 4 العلاج أظهرت CXCR6 خلايا + / GFP أنماط الحركة بالفعل ضعف جزئيا. على الرغم من أن بعض الخلايا تتحرك بسرعة كانت لا تزال موجودة في الجيوب الكبد، وكانت عدة مجالات التركيز مرئية مع الخلايا التيغيرت من الهجرة العشوائية لمسح المحلي، مشيرا إلى استجابة الكيميائي تجنيد الخلايا إلى منطقة الإصابة. حتى أكثر وضوحا والتأثير بعد 36 ساعة، مما يدل على اعتقال شبه الكامل للCXCR6 + الخلايا مع أي الهجرة النشطة تقريبا. في حين ظل ظروف أساسية إستحوذ الخلايا المهاجرة سرعات متغير الهجرة مع تغييرات الاتجاه عشوائية، وأظهرت لجنة علم المناخ 4 الحيوانات المعالجة الخلايا التي تم الزحف ببطء فقط، وكذلك بعض الخلايا متحركة بحرية تقوم بدوريات في الجيوب بعد 18 ساعة ولكن ليس بعد 36 ساعة. باستخدام مسارات الهجرة مرمزة، يمكن تصور سرعة الخلية مباشرة لتقييم تأثير العلاج جنة علم المناخ (4). وكانت الهجرة ضعاف أيضا واضحة في المسار المخطط تطبيع (الشكل 6B)، وتبين أن 18 ساعة بعد لجنة علم المناخ 4 كمية مسافات طويلة المسارات وكذلك تم تخفيض متوسط ​​طول المسار بشكل ملحوظ، في حين بعد 36 ساعة كانت أي خلايا متحركة كشف أي أكثر. في خط ثإيث هذه النتائج، وتشريد الخلوي، الذي يصف قدرة خلية للقيام بدوريات بحرية الأوعية الدموية، انخفض مع مرور الوقت، مما يدل على محاصرة الخلايا 36 ساعة بعد لجنة علم المناخ 4 العلاج في موقع الضرر الكبد (الشكل 6C).

لمتابعة سلوك الهجرة من خلايا CXCR6 + / GFP في الكبد في مزيد من التفاصيل، وتآمر سرعة هجرة الخلايا الفردية تمثيلية لتصور مستواهم في الحركة مع مرور الوقت. نحن وآخرون وصفت سابقا عدة أنماط الحركة متميزة من CXCR6 خلايا + / GFP: الزحف العشوائي نشاطا حيث تم الشائكة المتداول نمط، والتي تبين مراحل الحركة الخلوية والدول هادئة الزمنية. توجه التوظيف الخلوي مع خلايا مسح مساحة من الاهتمام ولكن لا تزال قادرة على الزحف نشطة؛ إجمالي اعتقال الخلوي يرافقه المناعة تنشيط الخلايا 18،20. بينما الفئران من دون علاج أظهر أساسا الخلايا التي كانت موتي بحريةلو بسرعات تصل إلى 15 ميكرون / ثانية، وخلايا CXCR6 + / GFP في الفئران التي عولجت مع لجنة علم المناخ 4 المعروضة خفضت بشكل ملحوظ سرعة هجرة الخلايا واعتقال جزئي بالفعل بعد 18 ساعة واعتقال المهاجرة كامل بعد 36 ساعة (الشكل 7A). وتمشيا مع تحليل خلية واحدة، وكشفت البيانات الإحصائية لجميع الخلايا ضمن تسلسل تناقص سرعة الهجرة الشاملة بعد لجنة علم المناخ 4 العلاج (الشكل 7B)، الذي يشبه أيضا متوسط ​​سرعة المسار (الشكل 7C) وتتبع السرعات القصوى الهجرة (الشكل 7D)، والتي تبين أن النهج كان مناسبة لوصف الاختلافات في الهجرة الخلية وتحديد المواقع في الإصابة بأمراض الكبد.

الشكل (1)
الشكل 1: ثقب القصبة الهوائية من الفأرة (A) المعدات الجراحية المستخدمة لإعداد. 1X طقطق القياسيةن ملقط، ملقط 1X Semken، ملقط 1X دومون NO.7، ملقط غريف (مسننة، 2X مستقيم / 1X المنحنية)، الكامشات 2X بلير (4 محاور (ثلم))، كروي مزدوج قلم التحقيق (على سبيل المثال، الملغم الملمع 3PL)، هايدمان ملعقة HD2، حامل إبرة (ماتيو أو هالسي)، مقص جراحي صغيرة 1X (الحاد / حادة، 1xcurved، 1X مباشرة)، مقص الصغرى (على سبيل المثال، Vannas الربيع مقص)، 1X مكواة الحيوانات الصغيرة، ومسحات القطن، والعين مرهم واقية والجراحية موضوع، ن بوتيل-2-Cyanoacrylatglue. محمية (B) عيون باستخدام مرهم واقية العين. (C) قطع الجلد الأولي لإعداد القصبة الهوائية. (D) تشريح النسيج الضام بين الغدد اللعابية تحت الفك. (E) المعرض من القصبة الهوائية. (F) تشريح الأنسجة العضلية المحيطة القصبة الهوائية. (G) الموضع من الخيط الجراحي تحت القصبة الهوائية لتثبيت الأنبوب. (H) القصبة الهوائيةآل شق باستخدام microscissors بين حلقات الغضروف العليا. (I) الإدراج من أنبوب التهوية في القصبة الهوائية. (J) الموضع من الخيط الجراحي الجمجمة لإصلاح أنبوب على الجلد. (K) تثبيت مزدوج من الأنبوب. (I) ختم شق جراحي باستخدام ن بوتيل-2-Cyanoacrylat. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: Laparatomy والكبد إعداد (A) الأولي شق الجلد، وأكتوي الأوعية الدموية لمنع النزيف. (ب) افتتاح الصفاق تحت عظمة القص. (C) تمديد خفض البريتوني باستخدام وحدة الكي. (D) ختم الأوعية شرسوفية. ( ز> E) مواصلة تمديد شق البريتوني أدناه الأضلاع. (F) الموضع من الحيوان إلى طبق مرحلة الاغاروز. (F) الموضع من مداخن الدعم. (G) تنسيب الجهاز التنفسي استشعار الزناد. (H) إعداد عتبة الزناد للتنفس متزامنة التصوير. (I) عظم القص تثبيت ليتراجع الأضلاع باستخدام خيط جراحي. (J) فصل المرارة من الحجاب الحاجز وتشريح في الرباط المنجلي. (K) الموضع من تنظيم زلة تغطية. (L) موضع الفص الكبد على خشبة المسرح. (M) الموضع من ساترة على الفص الكبد. (N) التنسيب القسطرة الملكية الفكرية للتخدير المدى الطويل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3 "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 52607 / 52607fig3.jpg "/>
الرقم 3: القسطرة داخل الصفاق 27 الإبر G اتصال مع مرونة أنابيب السيليكون.

الشكل (4)
الشكل 4: رصد الماوس. (A) الموضع من الأقطاب الكهربائية ECG (الأخضر والأحمر، والكابلات الزرقاء). توضع الإبر للكشف عن ECG تحت الجلد كما هو مبين. (ب) رصد ECG (الحمراء)، الزفير CO 2 (الأزرق) ومعدل ضربات القلب (الحمراء) التي تبين تطور طويل الأمد (يسار) والقياس الفعلي (يمين). (C) درجة الحرارة التي تسيطر عليها وحدة الطاقة من أجل السيطرة سادة الحرارة. وضبط درجة الحرارة إلى 36 ° C. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ve_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الرقم 5
الشكل 5: تضمين الكبد والتصوير. (A) التضمين من الفص الكبد. يتم حقن 3٪ الاغاروز في برنامج تلفزيوني في 41 درجة مئوية تحت الغطاء زلة باستخدام حقنة 2 مل مع إبرة 18G. مضمن (B) الفص الكبد بالكامل في الاغاروز للحد من القطع الأثرية الحركة. (C) ختم البريتوني مع المتبقية الاغاروز لمنع الجفاف. (D) إزالة الاغاروز الحقل المجهر تغطية نظر بعد جلتنة الكامل. (E) إعداد viewfield. تعديل F من مستوى Z وتقييم تدفق الدم العينة باستخدام المجهر الضوئي. (D) طبق الغلاف لمنع التبخر المفرط. رفع غطاء في الصورة لتظهر الإعداد. الرجاء انقر هنا لعرض أكبرنسخة من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: تتبع من CXCR6 GFP / + الخلايا في تلف الكبد المزمن بعد لجنة علم المناخ 4 حقن تم حقن الفئران الملكية الفكرية مع 0.6 مل / كغ لجنة علم المناخ 4 المذاب في زيت عباد الشمس 18 ساعة أو 36 ساعة قبل التصوير. في يوم من التجربة، وتعرض الفئران لTPLSM حيوي داخلي كما هو موضح. (A) الصور الثابتة من تتبع الخلية. تم فرضه المسارات من جميع نقاط الوقت لإظهار الحركة الخلوية والنزوح. واتخذت صورة باستخدام شعاع واحد تيتان سافيري الليزر في 840 نانومتر، والمجهر TPLSM. والمناطق الممسوحة ضوئيا تتخذ 3-5 Z-مداخن وعلى عمق تغلغل 70μm مع معدل أخذ العينات حوالي 30 ثانية لكل دورة المسح الضوئي. كانت المسارات ونا مميزا لإظهار سرعة الهجرة (الضوء الأزرق: بطيئة الحركة أو خلايا لاطئة، الأرجواني: خلايا متحركة). الحانات النطاق: 100 μ؛ م. (B) XY الرسوم البيانية لمسارات طبيعية لأصلهم تظهر الاتجاهية المسار وطول المسار (ميكرون). (C) النزوح الكلي للخلايا من مصدرها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7: إحصاءات الهجرة من CXCR6 GFP / + خلايا تليها TPLSM حيوي داخلي في أنسجة الكبد في الأساس ولجنة علم المناخ 4 الفئران التي عولجت تم تحليل الخلايا للسرعة هجرتهم تقوم بدوريات في الكبد. وجاءت (A) سرعة التمثيلية للخلايا وحيدة مع مرور الوقت. تم قياس السرعة في كل نقطة زمنية وخططوا لكل إطار على حدة. الخطوط تمثل الخلايا الفردية. يتم تحجيم Y-محاور وفقا لأقصى سرعة الهجرة. (B) سانتتم تجميع تحليل atistical السرعات A. الإطار محددة من كل الخلايا وتحليلها في الأساس ولجنة علم المناخ 4 معاملة الفئران. تم احتساب (C) متوسط ​​سرعة المسار لكل مسار والبيانات من جميع المسارات تم تجميعها لتحليلها. وقد رسم (D) السرعة القصوى من كل مسار وتحليلها. وأجريت جميع التجارب في مجموعات من 3 الحيوانات وتأكدت النتائج في تجربتين مستقلة. *** P <(الذيل اثنين من الطلاب أونبايريد اختبار t) 0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وكان الهدف من دراستنا لتطوير طريقة موحدة للغاية، ومستقرة وقابلة للتكرار للتصوير TPLSM حيوي داخلي في الكبد. وقد أعطى التصوير حيوي داخلي بشكل عام معلومات قيمة حول سلوك الخلوية في ظل ظروف الحياة الحقيقية بعد صاروخ موجه وتفاعل السكان الكريات البيض مختلفة في التنمية، والتوازن والمرض. ومع ذلك، فإن موقف التشريحي تحديا إلى حد ما في الكبد، وذلك بسبب والتي التنفسي وحركة الأمعاء تحوي تنتقل مباشرة إلى الكبد، فضلا عن هشاشة العالية مقارنة مع الأجهزة الصلبة الأخرى تفرض العديد من التحديات للتصوير حيوي داخلي مستقر على المدى الطويل. خلال السنوات الأخيرة، كشفت العديد من الدراسات التجريبية في الفئران طبيعة ديناميكية للغاية من تسلل الخلايا المناعية في الكبد المصاب 28، مع مساهمات كبيرة من المقيمين أو التسلل حيدات / الضامة 30-32، العدلات 33 أو مختلف مجموعات فرعية اللمفاويات 34،35. ومع ذلك، موقد استمدت معاهدة الفضاء الخارجي لهذه البيانات من التحليلات نقطة النهاية (على سبيل المثال، وتدفق متعدد الألوان الخلوي بعد التضحية الحيوانات). حتى الآن سوى دراسات قليلة موجودة يصف ديناميات الحركة الخلوي أثناء التهاب الكبد باستخدام التصوير حيوي داخلي متعدد الألوان. باستخدام المجاهر المقلوب تلتف على ضرورة تثبيت والترطيب للكبد بسبب التصاق متين من الأنسجة إلى أسفل الزجاج 24. ومع ذلك، منذ يتم بناؤها العديد من المجاهر multiphoton كما نظم التصوير تستقيم، وهناك حاجة إلى أساليب إعداد وتثبيت أكثر تفصيلا لتحقيق الاستقرار في الأنسجة لوقت التصوير. عادة، وقد وصفت أنظمة انطلاق العرف لتثبيت الأنسجة 6، 36،37، ولكن مع هذه لا بد من التحقق من صحة دوران الأوعية الدقيقة في الكبد، لأن الضغط حتى الحد الأدنى على النسيج يؤثر تدفق الدم جيبية مع مزيد من الآثار شديدة على الكبد المريضة 38 .

ولذلك، كانت النقاط التالية الإعلانيةيرتدون الإعداد لهذه الطريقة لتحسين النتائج التي حصل عليها في الجسم الحي TPLSM التصوير: تعزيز نوعية إعداد كتبها التقليل من اضطراب عينة وتعطيل دوران الأوعية الدقيقة بسبب التعامل مع القضايا وزيادة بقاء الحيوان؛ مراقبة العناية المركزة والتكيف لاحق من التخدير والتنفس واستقرار الدورة الدموية زيادة تعزيز بقاء الحيوان والتحف الفسيولوجية أدنى حد ممكن، على سبيل المثال، والناجمة عن الاختلالات في درجة الحموضة في الدم. كان التنفس للرقابة في تركيبة مع التصوير مسبب أساسي للقضاء على حركة القطع الأثرية بسبب تزامن المجهر مع دورات في الجهاز التنفسي. وكان التضمين للجهاز في الاغاروز التي تحتوي على تركيزات الملح الفسيولوجية مفيد ليحملق بلطف الجهاز بعد إعداد دون أي تلاعب الميكانيكية أخرى، ومنعت أيضا جفاف العينة. معظم البروتوكولات المستخدمة للفحص المجهري الكبد توفر وسائل كافية فقط لستا بلي، والتخدير على المدى الطويل. ومع ذلك، فإن بقاء هذه الحيوانات يمكن تعزيز بشكل كبير مع بروتوكول التخدير المقدمة هنا وبالاقتران مع رصد كان كافيا لضمان بقاء ما يصل الى 8 ساعة. الطرق البديلة عادة ما تكون مناسبة لتصور عمليات خلال فترة زمنية تصل إلى 3 ساعات مثل الغزو العدلة 39، ولكنها تفتقر إلى إمكانية صورة تعد عمليات دائمة مثل الوحيدات أو اللمفاويات الغزو 22 أو حتى تكاثر الخلايا 6. يمكن فهم ديناميات التوظيف والتسلل والتفاعل الخلوي أثناء الحاد والمزمن التهاب الكبد توفير نظرة أكثر تفصيلا في تطور وتقدم مرض الكبد. باستخدام هذا الفهم محسنة من الباثولوجيا المناعية سيكون من الممكن لتصميم علاجات أكثر دقة بكثير من حيث معالجة الخلايا المستهدفة من الفائدة بدلا من استخدام النهج المثبطة للمناعة مثل غير انتقائية.

ove_content "> ولمعالجة هذه المواقع، والتهجير والتفاعل من الكريات البيض هناك حاجة إلى صور ذات جودة عالية، لتتبع دقيق 4D من الخلايا داخل الأوعية الدموية الكبد والكبد الأنسجة 18،20،40.

طريقة نقدمها هنا يمكن تطبيقها باستخدام الكواشف المخبرية المشتركة والمعدات، مما يجعل كلا من السهل التعامل معها وفعالة مع الحد الأدنى من اضطراب العينة من حيث التكلفة. للحفاظ على الظروف الفسيولوجية من الفأرة لأطول فترة ممكنة، فمن الضروري غرامة، وضبط حجم الجهاز التنفسي والتردد للسيطرة على الأوكسجين والدم CO 2 المستويات. على الرغم من أن نتيجة لاستمرار تدفق السوائل في الغشاء البريتوني هناك ما لا يقل عن العرض المبدئي لتحقيق الاستقرار في قياسات الدورة الدموية، ECG وتواتر القلب السماح فقط لسيطرة جزئية بشأن استقرار الدورة الدموية. من خلال تنفيذ المباشرة السيطرة على ضغط الدم وتطبيق السائل الوريدي المركزي من المرجح أن paramet الحيويالمتطلبات البيئية يمكن أن يستقر حتى أكثر، مما يؤدي إلى زيادة تعزيز الاستقرار والبقاء على قيد الحياة.

حتى في ظل ظروف رقابة شديدة، والتصوير من الحيوانات التي تعرضت لنماذج تلف الكبد التي تستخدم عادة في الفئران مثل اسيتامينوفين الناجم عن تلف الكبد، لجنة علم المناخ 4 تلف الكبد الناجم أو مرض الكبد الدهني الغذائية التي يسببها لا يزال تحديا. يرجع ذلك إلى وظيفة أساسية في الكبد في سيطرة الدولة الأيضية وموقعها المركزي في الدورة الدموية، والتعديلات من وظائف الكبد أو دوران الأوعية الدقيقة تأثيرات مباشرة البقاء على المدى الطويل من الحيوانات، وبالتالي الحد من إمكانية الحصول على TPLSM طويلة الفيديو متواليات من بالسلاح أجهزة التالفة، على سبيل المثال مع نزيف شديد أو الأوعية الدموية الدقيقة تدميرها. أيضا، في تغييرها بشدة التشريح المجهري الكبد كما في النماذج مع التنخر واسعة، ما زال من الصعب دراسة خلية خلية التفاعلات والتقسيم المحلي من المجاميع خلية التهابات، لأنه لا يوجد ستانdardized "مكافحة تلطيخ" لهياكل تشريحية (مثل الهيماتوكسيلين تلطيخ في المجهر التقليدية أو تلطيخ دابي في المناعي) متاح للجودة TPLSM.The حيوي داخلي من البيانات التي حصلت عليها عملية التصوير مزيد يعتمد على كثافة العلامات على الخلايا و الإعداد المجهري.

وتوجد عدة طرق لتصور خلايا GFP + في الكبد. يتم الحصول على أعلى مضان مع منخفضة للغاية مضان الخلفية بين 900 و 920 نانومتر الإثارة الطول الموجي. خسارة كاملة تقريبا من مضان الخلفية الكبد لا تسمح بالتحقيق في المواقع من الخلايا داخل الكبد، وعندما لا تستخدم بتتبع سفينة إضافية مثل ديكستران أو كتين. ولذلك، قررنا أن صورة الكريات البيض المهاجرة في الطول الموجي 840 نانومتر، وإعطاء أفضل نسبة بين إشارة GFP وتفصيلا ولكن ليست مشرقة جدا مضان الخلفية الكبد.

أخذت معا، وINTRنظام التصوير أفيتال TPLSM أدخلت في هذه الدراسة يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من الأسئلة intravital المجهري محددة الكبد. مع هذا النهج، TPLSM التصوير في أجهزة صلبة أخرى مثل الكلى والكبد والمثانة والأمعاء أو البنكرياس هو ممكن مع تعديلات طفيفة فقط من العمليات الجراحية وانطلاق الأنسجة، وبالتالي توفير نهج درجة عالية من المرونة للتحقيق في عمليات الهجرة المدى الطويل من الخلايا في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetics
Buprenorphine Essex Pharma 997.00.00 Analgeticum, 0.1 mg/kg
Fentanyl Rotex Medica charge: 30819
Fluovac anesthesia system Harvard Apparatus 34-1030
Glucose 5% Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser Eickemeyer 4802885
Isoflurane Forene Abbott B 506
Isotonic (0.9%) NaCl solution DeltaSelect GmbH PZN 00765145
Ketamin 10% ceva Charge: 36217/09
Xylazin 2% medistar Charge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20 ml Syringe BD Plastipak
250 ml Erlenmeyer flask Schott Duran 21 226 36
25 ml Beaker 2x Schott Duran 50-1150
2 ml syringe BD Plastipak
4-0 Vicryl suture Ethicon V7980
Agarose commercially available
Bepanthen Eye and Nose ointment Bayer Vital GmbH 6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit Fine Science Tools Inc. 18010-00
Cotton Gauze swabs Fuhrmann GmbH 32014
Cover Slip 24x50 mm ROTH 1871
Durapore silk tape 3M 1538-1
Feather disposable scalpel Feather 02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID Smiths medical 800/100/200
Histoacryl Braun 1050052 5x 0.5 ml
Leukoplast BSN Medical Inc.
Microscope Slides ROTH 1879
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum Antiseptica GmbH 72PAH200
Sterican needle 18 G x 1 B. Braun 304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1 B. Braun 4657705
Tissue paper commercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PL Gatz 0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 Storz&Klein S-01134
Dumont No.7 forceps Fine Science Tools Inc. 91197-00
Graefe forceps curved x1 Fine Science Tools Inc. 11151-10
Graefe forceps straight x2 Fine Science Tools Inc. 11050-10
Heidemann spatula HD2 Stoma 2030.00
Needle holder Mathieu Fine Science Tools Inc. 12010-14
Scissor Fine Science Tools Inc. 14074-11
Semken forceps Fine Science Tools Inc. 11008-13
Small surgical scissors curved Fine Science Tools Inc. 14029-10
Small surgical scissors straight Fine Science Tools Inc. 14028-10
Standard pattern forceps Fine Science Tools Inc. 11000-12
Vannas spring scissors Fine Science Tools Inc. 15000-08
Equipment
ECG Trigger Unit Rapid Biomedical 3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer AD Instruments
Minivent Typ 845 Harvard Apparatus 73-0043
Multiphoton microscope Trimscope I LaVision
Perfusor Compact B. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorder AD Instruments PL3508
Temperature controlled heating pad Sygonix 26857617
Temperature sensor comercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box Life Imaging Services

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117, (4), 1250-1259 (2011).
  2. Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
  3. Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10, (11), 955 (1969).
  4. Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82, (33), 575-578 (1970).
  5. Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24, (4), 307-318 (2011).
  6. Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75, (3), 307-315 (2011).
  7. Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).
  8. Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280, (6), G1076-G1082 (2001).
  9. Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45, (5), 544-553 (2010).
  10. Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50, (5), 497-506 (1977).
  11. Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99, (11), 2782-2790 (1997).
  12. Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172, (1), 45-53 (2004).
  13. Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (20), 10763-10768 (1996).
  14. Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75, (4), 2015-2024 (1998).
  15. Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62, (2), 137-145 (2003).
  16. Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91, (4), 281-289 (2013).
  17. McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23, (6), 2212-2217 (2003).
  18. Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3, (4), (2005).
  19. Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180, (4), 2024-2028 (2008).
  20. Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190, (10), 5226-5236 (2013).
  21. Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43, (2), 306-315 (2006).
  22. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28, (2), 271-284 (2008).
  23. Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40, (1), 117-123 (2010).
  24. Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, (3), e1000805 (2010).
  25. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, (6002), 362-366 (2010).
  26. Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89, (6), 419-432 (2008).
  27. Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14, (10), 996-1006 (2013).
  28. Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10, (6), 509-536 (2011).
  29. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352, (1-2), 89-100 (2010).
  30. Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50, (1), 261-274 (2009).
  31. Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55, (3), 898-909 (2012).
  32. Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (46), E3186-E3195 (2012).
  33. Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60, (4), 782-791 (2014).
  34. Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59, (2), 630-642 (2014).
  35. Syn, W. -K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61, (9), 1323-1329 (2012).
  36. McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205, (4), 915-927 (2008).
  37. Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34, (5), 807-819 (2011).
  38. Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24, (1), 13-20 (2008).
  39. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17, (11), 1381-1390 (2011).
  40. Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4, (3), e4693 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics