جيل من الليمفاوي المجهرية الدقيقة وكشف لهم تأثير Proapoptotic على الخلايا الظهارية مجرى الهواء

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

الخلية المجهرية الدقيقة-تسليط غشاء (النواب) هي الحويصلات البيولوجية النشطة التي يمكن أن تكون معزولة وآثارها المرضية في جسم المريض التحقيق في نماذج مختلفة. نحن هنا تصف طريقة لتوليد النواب المستمدة من الخلايا الليمفاوية T (LMPS) ولإظهار تأثير proapoptotic على الخلايا الظهارية مجرى الهواء.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yang, C., Xiong, W., Qiu, Q., Tahiri, H., Gagnon, C., Liu, G., Hardy, P. Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (96), e52651, doi:10.3791/52651 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تزايد الاهتمام في الأدوار البيولوجية للخلية الحويصلات المشتقة من الغشاء في التواصل خلية خلية في السنوات الأخيرة. المجهرية الدقيقة (النواب) هي واحدة مثل هذا النوع من الحويصلات، والتي تتراوح قطرها من 0.1 ميكرومتر إلى 1 ميكرومتر، وتسلط عادة من غشاء البلازما من خلايا حقيقية النواة تمر تفعيل أو موت الخلايا المبرمج. نحن هنا وصف جيل من T-المستمدة اللمفاويات المجهرية الدقيقة (LMPS) من خلايا CEM T أفكارك حفز مع أكتينوميسين يتم عزل D. LMPS من خلال عملية الطرد المركزي التفاضلي متعددة الخطوات، وتميزت باستخدام التدفق الخلوي. ويعرض هذا البروتوكول أيضا في الموقع موت الخلايا طريقة الكشف لإثبات تأثير proapoptotic من LMPS على الخلايا الظهارية الشعب الهوائية المستمدة من الماوس الابتدائية الجهاز التنفسي إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية. الطرق الموضحة في هذه الوثيقة توفر الإجراء استنساخه لعزل كميات وفيرة من LMPS من الخلايا الليمفاوية أفكارك في المختبر. المستمدة LMPSفي هذه الطريقة يمكن استخدامها لتقييم خصائص النماذج المرض المختلفة، والصيدلة وعلم السموم الاختبار. وبالنظر إلى أن ظهارة الهوائية تقدم حاجز مادي وعملي وقائي بين البيئة الخارجية والأنسجة الكامنة، واستخدام إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية بدلا من خطوط الخلايا الظهارية خلد يوفر نموذج فعال للتحقيقات التي تتطلب الأنسجة المسالك الهوائية.

Protocol

ملاحظة: ذكر C57BL / 6 الفئران (5-7 أسابيع من العمر) هي من نهر تشارلز مختبرات الدولية، وشركة (سانت المستمر، كيبيك، كندا.) والتلاعب بها وفقا لبروتوكولات التي وافق عليها سانت جوستين جنة رعاية الحيوان CHU. توفر الماوس إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية مصدر جيد للخلايا الظهارية القصبية الأولية للتحقيق في الآثار proapoptotic من LMPS على الخلايا الظهارية. يصف هذا البروتوكول الجيل في المختبر من LMPS، وكذلك وسيلة للكشف عن الخلايا الظهارية أفكارك على LMPS المعاملة إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية. ويتكون هذا البروتوكول من 3 أقسام.

1. LMPS الإنتاج وتوصيف

ملاحظة: لمنع التلوث، وضمان أن جميع المواد المستخدمة في هذه التجربة هي معقمة أو تعقيمها. تنفيذ جميع الخطوات في RT في خزانة السلامة البيولوجية تحت ظروف معقمة، ما لم يذكر خلاف ذلك.

1.1) تحفيز ومجموعة من النواب9

  1. ذوبان الجليد قسامة من 10 مليون خلية CEM T في 37 ° C حمام الماء. تمييع في 10 مل قبل حرارة متوسطة للدم مثل X-VIVO، في 15 مل أنبوب معقم والطرد المركزي في 200 GX 5 دقائق خالية من المصل. نضح خلايا وطاف resuspend في 5 مل المتوسطة قبل تحسنت.
  2. نقل الخلايا إلى ثقافة قارورة الأنسجة T75 (للخلايا تعليق) مع 15 مل المتوسطة المكونة للدم قبل تحسنت مثل X-VIVO واحتضان لمدة 4 أيام في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  3. بعد 4 أيام، ونقل جميع مستنبت والخلايا في قارورة الثقافة الأنسجة T175 تحتوي على 100 مل متوسطة جديدة. مواصلة احتضان الخلايا لمدة 72 ساعة في ظل نفس الظروف حتى أنها قد نمت لكثافة من 2 مليون خلية / مل.
  4. تقسيم بالتساوي بين خلايا أربعة قوارير T175 تحتوي كل منها على 150 مل متوسطة جديدة ومواصلة زراعة الخلايا حتى نمت الخلايا (ما يقرب من 48 ساعة حضانة) إلى كثافة من 2 مليون / مل.
  5. 6 خلايا في قارورة T175 جديدة تحتوي على 150 مل متوسطة جديدة، للحفاظ على / كثافة الخلية مل من 2 مليون.
  6. إضافة أكتينوميسين D (الذائبة في DMSO في 2 ملغ / مل) إلى متوسطة في تركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / مل واحتضان لمدة 24 ساعة.
  7. نقل جميع مستنبت إلى 50 مل أنابيب مخروطية وتدور أسفل الخلايا في 750 x ج لمدة 5 دقائق. نقل طاف في أنابيب مخروطية 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 1،500 x ج لمدة 15 دقيقة لإزالة شظايا خلية كبيرة.
  8. نقل طاف في زجاجة 250 مل ونابذة فائقة السرعة في 12،000 x ج لمدة 50 دقيقة. تجاهل طاف وجمع الكريات.
  9. غسل الكريات LMPS المخصب مع PBS 40 مل العقيمة في أنبوب 50 مل بواسطة الطرد المركزي عند 12،000 x ج لمدة 50 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين.
  10. جمع غسل الماضي طاف. سيتم استخدامها كما السيطرة على السيارة. تعليق الكريات LMPS في 1مل من برنامج تلفزيوني ونقل إلى 1.5 مل microtube العقيمة. قسامة وتخزين LMPS معزولة في -80 ° C (لتجنب متعددة دورات خالية من ذوبان الجليد).

1.2) توصيف النواب عن طريق تحليل FACS 4

  1. إعداد 2 عينات من العازلة annexin (1)، مع وأخرى دون CaCl 2: HEPES 10 ملي، كلوريد الصوديوم 140 ملم، زائد أو ناقص 5 ملي CaCl 2.
  2. تصفية عازلة annexin وFACS السائل غمد تدفق باستخدام فلتر 0.22 ميكرون لإزالة الجسيمات.
  3. تمييع 1 ميكرولتر من LMPS في 44 ميكرولتر من العازلة annexin مع 5 ملي CaCl 2 في أنبوب FACS. إعداد أنبوب آخر مع 1 ميكرولتر من LMPS في 44 ميكرولتر من العازلة annexin دون CaCl 2 (المراقبة السلبية).
  4. إضافة 5 ميكرولتر من annexinV-Cy5 في كل أنبوب وتخلط جيدا. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام. وقف رد فعل عن طريق تمييع المزيج مع 400 ميكرولتر من FACS السائل غمد التدفق في كل أنبوب.
  5. إضافة 10 ميكرولتر (200،000 الخرز) من 7 ميكرون العد BEAتعليق DS كمعيار داخلي في كل أنبوب للحصول على عدد المطلق.
  6. إنشاء بوابات الحجم النسبي (FSC-H، PMT E00، تسجيل النطاق) وتحبب النسبي (SSC-H، PMT 325، تسجيل نطاق و) مؤامرة نقطة على تدفق عداد الكريات باستخدام معايرة حجم حبات الفلورسنت من 1 ميكرون (بوابة 1) و عد حبات البوابة في 7 ميكرون (بوابة 2).
  7. تحليل عينة LMPS على FSC-H / SSC-H مؤامرة باستخدام البوابات التي أقامتها وFL-4 قناة لannexin (PMT 765، تسجيل نطاق و) مؤامرة نقطة، من خلال الحصول على إشارة حتى يتم التوصل إلى 20،000 الخرز العد والفرز في بوابة 2.
  8. تحديد الأحداث annexinV الإيجابية للLMPS في المخزن annexin تحتوي على CaCl ومن ثم طرح أحداث LMPS في المخزن annexin دون CaCl 2 (المراقبة السلبية).
  9. حساب العدد المطلق للنواب على أساس المعادلة التالية:
    المعادلة 1

1.3) تحديد النائب Protein التركيز (برادفورد الفحص)

  1. إعداد 5 التخفيفات المسلسل من مستوى البروتين 1،25-20 ميكروغرام / مل. ماصة 800 ميكرولتر من كل حل معيار وعينة في أنبوب اختبار نظيف في مكررة. إضافة 200 ميكرولتر من برادفورد صبغ كاشف لكل أنبوب. تخلط جيدا، ثم يحضن في RT لمدة 5 دقائق.
  2. قياس الامتصاصية في 595 نانومتر. تحديد تركيز البروتين من LMPS باستخدام الانحدار الخطي للمنحنى القياسية.

2. إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية وعلاج LMPS

ملاحظة: إيلاء اهتمام خاص لبيئة العمل معقمة، وجو معقم و مطهر إعداد الحلول والوسيلة المستخدمة في التجارب التالية. لإعداد الشفاء التام المتوسطة، إضافة 1 مل من الأنسجة شفاء ملاحق المتوسطة مع المصل (إذابة على الجليد) إلى 100 مل الأنسجة شفاء متوسطة وتخلط جيدا.

2.1) إعداد الشعبي إإكسبلنتس الأنسجة

  1. قبل زراعة، خدش 6 مجالات 1 سم 2كل على حافة سطح كل 100 ملم الأنسجة صحن الثقافة بشفرة المشرط. معطف كل خدش 100 ملم الأنسجة صحن الثقافة مع 2 مل من محلول طلاء صحن الثقافة، واحتضان الطبق في ترطيب CO 2 حاضنة O / N عند 37 درجة مئوية. فراغ نضح الحل الفائض وملء الطبق مع 15 مل من الأنسجة غسل المتوسطة.
  2. الموت ببطء C57BL / 6 الفئران (5 إلى 7 أسابيع من العمر) من خلال CO 2 الاستنشاق وفقا لبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة الأخلاق رعاية الحيوان.
  3. جو معقم و مطهر تشريح أنسجة الرئة مع مشرط، دومون منتاش السوبر غرامة، ومقص جراحي. إزالة حمة والأوعية الدموية بعناية. وضع أنسجة الرئة في الجليد الباردة الأنسجة غسل المتوسطة لنقلها إلى المختبر، إن وجدت.
  4. وعلاوة على ذلك تشريح القصبات الهوائية غارقة في الأنسجة غسل المتوسطة وفصل القصبات الهوائية التي يبلغ قطرها بين 1 و 2.5 ملم من أنسجة الرئة الطرفية. أنسجة الشعب الهوائية شريحة إلى ~ 5 ملم حلقات الشعب الهوائية سميكة مع مشرط. تستخدم حركة شفط مع ملقط معقم microdissecting منحنية لالتقاط شظايا الشعب الهوائية ووضعها على المناطق خدش من الأطباق.
  5. إزالة الأنسجة غسل المتوسطة، واحتضان شظايا في RT ل~ 5 دقائق للسماح لهم الانضمام إلى الأطباق.
  6. إضافة 10 مل من الشفاء التام من متوسطة إلى كل طبق ووضعها في جو يسيطر غرفة الحاضنة وحدات. مسح الغرفة مع ارتفاع خليط الغاز O 2 (70٪ O 25٪ N 2 و 5٪ CO 2،). وضع الغرفة في حاضنة المدارية الفوق والتخلص منه في 37 ° C. يهز الغرفة لمدة 24 ساعة على 10 دورة في الدقيقة للسماح المتوسط ​​وتتدفق بشكل متقطع على مدى شظايا.
  7. بعد 24 ساعة الحضانة، ومراقبة إإكسبلنتس الأنسجة تحت المجهر الضوء على النقيض من المرحلة مقلوب. حدد إإكسبلنتس الشعب الهوائية مع كاملة، حركة الشعر الجميلة وظهارة الشعب الهوائية حية للعلاج LMPS اللاحقة.

2.2) LMPS العلاج

  1. إعداد الكامل المتوسطة النمو على النحو التالي: المكملات المتوسطة النمو ذوبان الجليد مع المصل والخلايا الليفية المانع على الجليد. إضافة 1 مل من مكملات النمو المتوسطة مع المصل و 200 ميكرولتر المانع الخلايا الليفية إلى 100 مل من النمو المتوسطة. تخلط جيدا. تدفئة متوسطة النمو الكامل عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة قبل استخدامها.
  2. تمييع LMPS المعزولة في أنبوب إيبندورف العقيمة جديد مع PBS لإعداد الأوراق المالية LMPS بتركيز 800 ميكروغرام / مل.
  3. إضافة 0.5 مل من النمو الكامل متوسطة إلى كل بئر من 12-جيدا لوحة زراعة الأنسجة.
  4. نقل إإكسبلنتس الشعب الهوائية المختارة مع ملقط microdissecting المنحنية من البروتوكول السابق (القسم 2.1) إلى كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة.
  5. تسمية لوحة الثقافة بشكل مناسب لتحديد الآبار العلاج LMPS وآبار المراقبة. إضافة 25 ميكرولتر الأسهم LMPS في كل معاملة LMPS جيدا (لتركيز النهائي من 40 ميكروغرام / مل) و 25 مركبة سيطرة ميكرولتر (انظر LMP الصورة الإنتاج) إلى آبار المراقبة.
  6. تستمر الحضانة في جو يسيطر غرفة الحاضنة وحدات عند 37 درجة مئوية مع الهز لطيف.
  7. بعد 24 ساعة، ويغسل إإكسبلنتس 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، والشروع في الخطوة التالية (4٪ بارافورمالدهيد [PFA] تثبيت).

3. المرضية فحص

3.1) إعداد الحلول التالية قبل الشروع في خطوات التالي

  1. إعداد 1X العازلة في برنامج تلفزيوني عن طريق خلط 137 مم كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 1.76 ملي KH 2 PO ودرجة الحموضة 7.4.
  2. لإعداد 4٪ PFA، حل 20 غراما من PFA في 400 مل من الماء، يسخن في 60 درجة مئوية مع التحريك. إضافة بضع قطرات من 10 M هيدروكسيد الصوديوم لمسح الحل. التالي إضافة 1X PBS عازلة وضبط مستوى الصوت إلى 500 مل ودرجة الحموضة إلى 7.4. تصفية وقسامة. تخزين في -20 ° C.
  3. إعداد الكواشف الجفاف أو الإماهة التالية: 100٪، 90٪، 70٪، 50٪ من الإيثانول والزيلين.
e_step "> 3.2) يزدرع التثبيت والأنسجة القسم Deparaffinization

  1. وضع كل يزدرع في أنبوب microcentrifuge المسمى مع 1.5 مل من 4٪ PFA واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية. شطف إإكسبلنتس مرتين مع 1X PBS.
  2. يذوى إإكسبلنتس من خلال سلسلة الكحول (70٪ من الإيثانول: 3 مرات كل 30 دقيقة، 90٪ من الإيثانول: 2 مرات 30 دقيقة لكل منهما؛ 100٪ من الإيثانول: 3 مرات كل 30 دقيقة، ثم زيلين: 3 مرات 20 دقيقة لكل منهما). تنفيذ جميع الخطوات في RT في غطاء الدخان.
  3. إطمر إإكسبلنتس الأنسجة في البارافين في 58 ° C في الفرن. إعداد 5 ميكرومتر أقسام الأنسجة السميكة باستخدام مشراح الدوارة.
  4. تعويم المقاطع في 56 ° C حمام الماء، ومن ثم تحميل المقاطع على الشرائح النسيجية المسمى. ضع الشرائح في رفوف تلطيخ اليدوية وجافة عند 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. السماح للشرائح لتبرد في RT.
  5. تراجع الرفوف في 4 أطباق وصمة عار على التوالي التي تحتوي على الزيلين لمدة 10 دقيقة كل لإزالة البارافين. تراجع الرفوف في سلسلة الإيثانول لإزالة زيلين: 100٪، ثم 95٪، الEN 80٪، ثم 70٪ ثم 50٪ من الإيثانول (5 دقائق لكل خطوة). شطف الرفوف مع ماء الصنبور لمدة 5 دقائق لإزالة الايثانول.

3.3) الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ

  1. مواصلة العمل مع أقسام الأنسجة الثابتة. وضع رف في طبق تلطيخ مليئة الهيماتوكسيلين ماير لمدة 15 دقيقة. شطف رف مع ماء الصنبور لإزالة الهيماتوكسيلين لمدة 20 دقيقة.
  2. وضع في الماء المقطر لمدة 30 sec.Place في 95٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية. ضع في يوزين Y طبق الحل تلطيخ لمدة 1 دقيقة. يذوى الى 2 التغييرات من الايثانول 95٪، و 100٪ من الإيثانول، والزيلين لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
  3. إجراء فحص سريع تحت المجهر للتأكد من أن تتم إزالة يوزين الزائد. ضع 2 إلى 3 قطرات من تصاعد المتوسطة (فيشر SP15-100) على كل شريحة، ثم تغطية مع غطاء زجاجي.

3.4) في الموقع خلية كشف الإعدام: الفحص TUNEL

  1. قبل بداية، وإعداد بروتين K الحل العمل: 20 ميكروغرام / مل في10 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4.
  2. كرر الخطوات من 1 إلى 5 من القسم 3.2 (تثبيت النباتى والأنسجة قسم deparaffinization). شطف الشرائح مع منزوع الأيونات H 2 O.
  3. تزج الشرائح مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة. استنزاف PBS الزائد. احتضان أقسام الأنسجة لمدة 30 دقيقة في RT مع بروتين K الحل العمل. شطف الشرائح مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X.
  4. إجراء فحص TUNEL كما هو موضح في دليل التعليمات من موت الخلايا كشف عدة. جبل باستخدام تصاعد المتوسطة، وساترة يدويا مع coverslips الزجاج.
  5. تحليل العينات تحت المجهر الضوئي. استخدام صورة برو 4.5 لتحليل الخلايا أفكارك في اللون البني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

واتسمت LMPS مع annexin V تلطيخ 10 بواسطة خلية مضان تنشيط الفرز (FACS) تحليل وبوابات باستخدام 1 ميكرومتر الخرز التي كانت 97٪ من النواب (≤1 ميكرون) annexin-V-Cy5 الإيجابي (الشكل 1A و 1B). عادة، تم الحصول على حوالي 2.5 ملغ من LMPS بعد هذا البروتوكول. إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية من C57BL / 6 تعرض الفئران لسيارة والعلاج LMPS. وكشف تحليل الأنسجة من أقسام الشعب الهوائية تأثير LMPS على السلامة الهيكلية للظهارة الشعب الهوائية. في إإكسبلنتس السيطرة، كانت ظهارة الشعب الهوائية التالفة إلى حد كبير (الشكل 2A)؛ ومع ذلك، في إإكسبلنتس LMPS المعاملة، أن أضرارا لحقت طبقة الخلايا الظهارية سطحية أو فقدت، وكانت هناك انخفاض كبير في ارتفاع الخلايا الظهارية والكثافة (الشكل 2B). تلطيخ TUNEL إيجابية (علامة على موت الخلايا المبرمج) كان أكثر وضوحا في LMPS المعاملة ظهارة الشعب الهوائية مقارنة مع الشاهد (

الشكل (1)
الشكل 1. تحليل التدفق الخلوي من النواب المستمدة من CEM T خط الخلية. (A) تحديد الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC) الخصائص مع 1 ميكرومتر الخرز المستخدمة للنواب البوابة. (ب) تم تقييم مزيد من الأحداث في البوابة النواب لوضع العلامات مع annexin V-Cy5 للتمييز الأحداث الحقيقية من الضوضاء الإلكترونية ، وبالتالي زيادة خصوصية كشف النواب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. LMPS التي يسببها القصبي الضرر طبقة الظهارية. الصور التشريحية المرضية التمثيلية للepitheli الشعب الهوائيةأم من إإكسبلنتس تعامل مع (A) التحكم أو (B) LMPS (40 ميكروغرام / مل لمدة 24 ساعة). كانت ملطخة أقسام يزدرع مع الهيماتوكسيلين ويوزين. وتشير السهام السوداء إلى الطبقة الظهارية. خسارة غير مكتمل من طبقات الخلايا السطحية والقاعدية هو واضح في أقسام إإكسبلنتس الشعب الهوائية LMPS المعاملة (B). التكبير 400X، بار = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. LMPS الناجم عن موت الخلايا المبرمج الشعب الهوائية الخلايا الظهارية تم الكشف عن خلايا أفكارك في الطبقة الظهارية للقصبات القطع التي TUNEL الفحص؛ بشكل إيجابي وصفت خلايا ملطخة باللون البني. صور الممثل من الخلايا الظهارية الشعب الهوائية في السيطرة (A) (B). وتشير السهام السوداء إلى الطبقة الظهارية. التكبير 200X (اللوحة العليا) و400X (اللوحة السفلية)، بار = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

النواب هي سطاء نشطة من عبر الحديث بين الخلايا ودراستهم واعد في العديد من مجالات العلم. وقدمت هذه الدراسة 11 بروتوكول مفصلة لفي المختبر جيل واسع النطاق للLMPS المستمدة من خط الخلية T أفكارك. هؤلاء النواب تعبر عن ذخيرة كبيرة من الجزيئات اللمفاويات وتورط بيولوجيا في تنظيم التوازن الخلوية والأنسجة. ومع ذلك، قد LMPS المستمدة من مصادر مختلفة تكون مختلفة بيولوجيا. 4،9،12،13

عرض LMPS خصائص متنوعة اعتمادا على المحفزات المستخدمة لتوليد لهم في المختبر، والخلية من التي تشتق منها. على هذا النحو، ينبغي إجراء استقراء البيانات التي تم الحصول عليها في المختبر باستخدام LMPS المستمدة من خطوط الخلايا خلد إلى البيانات من LMPS ولدت في الجسم الحي بحذر.

يصف هذا البروتوكول عدة خطوات الطرد المركزي اللازمة لعزل النواب. وبالتالي، جوهناك حاجة التلاعب areful لتقليل الخسائر من النواب خلال هذه العملية. ويوصى المفاجئة تجميد LMPS معزولة في -70 ° C. لاحظنا أن يمكن الحفاظ على bioactivities من LMPS في ظل هذه الظروف لمدة تصل إلى 2 سنة (بيانات غير منشورة).

حتى الآن، التدفق الخلوي يعتبر "المعيار الذهبي" لتحليل النواب. يستخدم متعدد الألوان تحليل تدفق cytometric لتحديد مجموعات سكانية فرعية من النواب من أصول الخلوية المختلفة. ومع ذلك، فإن أجهزة قياس التدفق الخلوي المتاحة تجاريا الحالية محدودة في قدرتها على تحليل النواب السكان أصغر الحجم (أقل من 300 نانومتر) والتمييز بين الحطام الخلوي والنواب. وبالإضافة إلى ذلك، تحليل FACS (تحليل cytofluorimetric) قد يكون طريقة بديلة لTUNEL فحص عد خلايا أفكارك للتحليل الإحصائي.

هنا، وتبين لنا أن إإكسبلنتس الشعب الهوائية مثقف خارج الحي يمكن أن توفر مصدرا جيدا للخلايا الظهارية مجرى الهواء وأو الصيدلة وفحص السموم. لأن هذه إإكسبلنتس الشعب الهوائية تشبه البيئات الفسيولوجية الأصلية، فإنها قد تكون مفيدة لتحديد مسارات إشارات من بعض الأمراض الشعب الهوائية أو الرئة. ومع ذلك، استخدم إإكسبلنتس الشعب الهوائية فقط لن يتمكن من تأكيد تأثير أفكارك من LMPS على الخلايا الظهارية ونتج عن مباشرة و / أو من الثانوية إلى تفعيل الخلايا المناعية المقيمين. للتحقيق في التأثير المباشر للLMPS، فإن الخلايا الظهارية الهوائية الأساسي يكون مناسبا لهذا الغرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

ويؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (178918)، فون دي بحوث أون سانتيه كيبيك - الرؤية شبكة بحوث الصحية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LMPs production and characterization
CEM T cells  ATCC  CCL-119
X-VIVO 15 medium  Cambrex, Walkersville 04-744Q
Flask T75 Sarstedt 83.1813.502
Flask T175 Sarstedt 83.1812.502
Actinomycin D  Sigma Chemical Co. A9415-2mg
PBS Lifetechnologies 14190-144
0.22 µm filter Sarstedt 83.1826.001
Annexin-VCy5 BD Pharmagen  559933
FACS flow solution BD Bio-sciences 342003
Fluorescent microbeads (1 µm) Molecular Probes  T8880
Polysterene counting beads (7 µm) Bangs laboratories PS06N/6994
Polypropylene FACS tubes Falcon 352058
1 ml pipet Fisher 13-678-11B
5 ml pipet Falcon 357543
25 ml pipet Ultident DL-357551
1.5 ml conical polypropylene micro tube Sarstedt 72.690
15 ml conical polypropylene tube Sarstedt 62.554.205
50 ml conical polypropylene tube Sarstedt 62.547.205
50 ml high speed polypropylene copolymer tube Nalgene 3119-0050
250 ml high speed polypropylene bottle Beckman 356011
Protein assay (Bradford assay) Bio-Rad Laboratories 500-0006
Protein assay standard II Bio-Rad Laboratories 500-0007
Test tube 16 x 100 VWR 47729-576
Test tube 12 x 75 Ultident 170-14100005B
Cell incubator  Mandel Heracell 150
Low speed centrifuge IEC Centra8R
High speed centrifuge Beckman Avanti J8
High speed rotor for 250ml bottle Beckman JLA16.250
High speed rotor for 50ml tube Beckman JA30.50
Fow cytometry  BD Bio-sciences FACS Calibur
Spectrophotometer Beckman Series 600
Bronchial tissue explants and sections 
C57BL/6 mice (5-7 weeks old)   Charles River Laboratories, Inc. 
Mouse Airway PrimaCell™ System: CHI Scientific, Inc. 2-82001
 Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades Becton Dickinson AcuteCare 371310 #10
Scalpel Handle Fine Science Tools Inc.  10003-12 #7
phase-contrast inverted microscope Olympus Optical CO., LTD.    CK2
high O2 gas mixture  VitalAire Canada Inc.
modular incubator chamber Billups-Rothenberg Inc. MIC-101
MaxQ 4000 incubated orbital shaker Barnstead Lab-Line,  SHKA4000-7
12-well tissue culture plate Becton Dickinson and Company 353043
Plastic tissue culture dishes (100 mm) Sarstedt, Inc. 83.1802
Surgical scissors Fine Science Tools Inc.  14060-09 Straight, sharp, 9cm longth
Half-curved Graefe forceps Fine Science Tools Inc.  11052-10
humidified CO2 incubator Mandel Scientific Company Inc.  SVH-51023421
 Histopathological examination 
formalin formaldehyde Sigma-Aldrich, Inc.  HT5011
paraffin Fisher scientific  International, Inc. T555
ethyl alcohol Merck KGaA, Darmstadt EX0278-1
 glutaraldehyde  Sigma-Aldrich, Inc.  G6403
Cacodylate Sigma-Aldrich, Inc.  31533
microscope slides VWR Scientific Inc.  48300-025 25x75 mm
Xylene Fisher scientific  International, Inc. X5-4
Mayer's hematoxylin Sigma-Aldrich, Inc.  MHS16 Funnel with filter paper  
HCl  Fisher scientific  International, Inc.   A144s-500
eosin  Sigma-Aldrich, Inc.  HT110116 Funnel with filter paper  
Permount™ Mounting Medium Thermo Fisher Scientific Inc.  SP15-100
glass coverslip surgipath medical industries, Inc. 84503 24×24 #1 
TUNEL detection kit In Situ Cell Death Detection, POD 11 684 817 910
oven Despatch Industries Inc. LEB-1-20
rotary Microtome Leica Microsystems Inc. RM2145
filter paper Whatman International Ltd. 1003150 #3
Microscope Nikon Imaging Japan Inc. E800
staining dish complete Wheaton Industries, Inc. 900200 including dish, rack, cover
1.5 ml eppendorf tube Sarstedt Inc.  72.69 39x10 mm
Orbital and Reciprocating Water Bath ExpotechUSA ORS200
phosphate buffered saline   GIBCO 14190-144
fume hood Nicram RD Service 3707E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31, (1), 4-9 (2011).
  2. Martinez, M. C., Tual-Chalot, S., Leonetti, D., Andriantsitohaina, R. Microparticles: targets and tools in cardiovascular disease. Trends Pharmacol Sci. 32, (11), 659-665 (2011).
  3. Benameur, T., Andriantsitohaina, R., Martinez, M. C. Therapeutic potential of plasma membrane-derived microparticles. Pharmacol Rep. 61, (1), 49-57 (2009).
  4. Yang, C., et al. Lymphocytic microparticles inhibit angiogenesis by stimulating oxidative stress and negatively regulating VEGF-induced pathways. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 294, (2), 467-476 (2008).
  5. Yang, C., Gagnon, C., Hou, X., Hardy, P. Low density lipoprotein receptor mediates anti-VEGF effect of lymphocyte T-derived microparticles in Lewis lung carcinoma cells. Cancer Biol Ther. 10, (5), 448-456 (2010).
  6. Angelillo-Scherrer, A. Leukocyte-derived microparticles in vascular homeostasis. Circ Res. 110, (2), 356-369 (2012).
  7. Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. J Immunol. 178, (12), 8090-8096 (2007).
  8. Qiu, Q., Xiong, W., Yang, C., Gagnon, C., Hardy, P. Lymphocyte-derived microparticles induce bronchial epithelial cells' pro-inflammatory cytokine production and apoptosis. Mol Immunol. 55, (3-4), 220-230 (2013).
  9. Martin, S., et al. Shed membrane particles from T lymphocytes impair endothelial function and regulate endothelial protein expression. Circulation. 109, (13), 1653-1659 (2004).
  10. Shet, A. S., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102, (7), 2678-2683 (2003).
  11. Mause, S. F., Weber, C. Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange. Circ Res. 107, (9), 1047-1057 (2010).
  12. Yang, C., et al. Anti-proliferative and anti-tumour effects of lymphocyte-derived microparticles are neither species- nor tumour-type specific. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  13. Soleti, R., et al. Microparticles harboring Sonic Hedgehog promote angiogenesis through the upregulation of adhesion proteins and proangiogenic factors. Carcinogenesis. 30, (4), 580-588 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics